핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

이 방법은 핵 역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 세포의 핵을 변형시키는 데 필요한 힘은 무엇입니까? 변형에 대한 핵 저항성에 대한 세포 및 핵 구성 요소의 기여는 무엇입니까?

아니면 세포 구조와의 핵 결합이 세포 유형에 따라 다른가요? 이 기술의 주요 장점은 살아있는 부착 세포에서 통합 핵-세포 골격을 변형시키기 위해 프로빙 힘을 가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 NIH-3T3 세포의 핵 기계적 특성에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용되었지만 Hutchinson-Gilford progerial cell의 핵 기계적 특성을 조사하는 것과 같은 모든 부착 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 35mm 유리 바닥 접시에 밀리리터당 5마이크로그램의 피브로넥틴을 코팅합니다. 그런 다음 코팅된 접시에 10% 공여자 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 NIH 3T3 섬유아세포 세포를 원하는 농도가 될 때까지 섭씨 37도로 배양합니다. 실험 직전에 PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 완전한 성장 배지로 한 번 세척합니다.

그런 다음 유리 바닥 접시에 3ml의 완전 성장 배지를 추가합니다. 이 절차에서 마이크로인젝터를 켭니다. 이멀젼 오일 스포이드를 사용하여 대물 렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 바릅니다.

그런 다음 접시를 접시 홀더에 단단히 고정하고 접시 홀더를 무대에 싣습니다. 실험 내내 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지되어야 합니다. 다음으로, 대물렌즈의 높이를 조정하여 셀에 초점을 맞춥니다.

현미경 스테이지를 움직여 관심 세포를 찾습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 홀더를 가장 높은 위치로 이동합니다. 그런 다음 0.5 마이크로미터 직경의 팁이 있는 마이크로피펫을 피펫 홀더에 로드합니다.

그런 다음 미세 제어를 조정하여 대물렌즈 초점면을 평면 A와 셀 상단을 평면 B로 올립니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 거친 제어 위치로 설정합니다. 마이크로피펫에 초점이 완전히 맞춰질 때까지 마이크로피펫의 실루엣을 관찰하여 마이크로피펫을 B 평면으로 천천히 가져옵니다.

마이크로피펫 팁에 초점이 맞춰지면 마이크로매니퓰레이터를 미세 제어로 설정합니다. 그런 다음 대물렌즈를 세포의 적도 평면으로 낮추고 마이크로피펫을 그보다 약 15마이크로미터 위로 낮춥니다. 마이크로인젝터의 보상 압력을 원하는 압력으로 설정합니다.

압력이 안정될 때까지 몇 초간 기다립니다. 피펫 팁이 파손되거나 막혔는지 확인하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 힘 측정이 정확하지 않을 수 있습니다. 마이크로매니퓰레이터 패널의 청소 설정을 사용하여 마이크로피펫이 막히지 않았는지 확인하고 마이크로피펫 팁에서 기포가 나오는지 확인합니다.

그런 다음 마이크로피펫 팁이 핵 표면에 가볍게 닿을 때까지 세포에 삽입합니다. 마이크로주입 시스템에서 압력 공급 튜브를 분리하여 마이크로피펫 끝부분을 대기로 개방하여 마이크로피펫 팁과 핵막 사이에 밀봉을 만듭니다. 이 단계는 핵 표면의 보상 압력과 동일한 음의 압력을 생성합니다.

그런 다음 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. 이미지 수집 소프트웨어에서 이미지에 대한 비디오 또는 ND 획득을 위한 AVI 획득을 설정합니다. 그런 다음 해당 형광 이미징 채널로 전환하고 이미징을 시작합니다.

핵이 마이크로피펫에서 분리될 때까지 마이크로피펫 팁을 세포 본체에서 멀리 이동합니다. 이 그림은 NIH 3T3 마우스 섬유아세포 핵의 강제를 보여줍니다. 마이크로피펫 팁이 오른쪽으로 이동함에 따라 핵이 변형되어 결국 마이크로피펫 팁에서 분리됩니다.

핵의 길이 변형은 흡입력이 증가함에 따라 증가하는 것으로 보입니다. 핵의 앞쪽 가장자리는 핵 돌출부를 형성하고 뒤쪽 가장자리는 원래 위치에서 변위됩니다. 돌출부의 길이는 트레일링 엣지 변위보다 훨씬 크며, 이는 핵과 주변 세포질 사이의 긴밀한 통합을 시사합니다.

시간 척도는 핵 전면 가장자리와 핵 후면 가장자리의 이완을 위해 짧습니다. Direct force probe는 변형에 대한 핵의 저항에 대한 핵 내 및 세포 골격 구조의 기여도를 결정하는 데 사용되었습니다. 형광 이미지는 표시된 조건에서 핵의 오버레이를 보여주었습니다.

F-actin 파괴 또는 미세소관 파괴 후 핵 변형 또는 번역에서 유의미한 차이는 발견되지 않았지만, siRNA 기반 녹다운을 통해 멘텐 발현을 줄이면 핵 번역 및 변형이 크게 증가했습니다. 이것은 섬유아세포의 멘텐 중간 필라멘트가 핵이 국부적인 힘에 저항하는 데 도움이 되는 주요 세포골격 요소임을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 부착 세포의 핵에 제어되고 알려진 힘을 가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.