Name: 핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 학습하세요 마이크로피펫 기법을 활용한 살아있는 부착세포의 핵 변형력 측정 방법을. 이 기술은 NIH-3T3 및 다양한 세포주에서 핵 역학 특성을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 NIH R01 EB014869에 의해 지원 되었다.

1. 영상에 대 한 셀을 준비합니다.
참고: 직접 힘 프로브 (DFP) 모든 부착 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여기, NIH 3T3 마우스 fibroblasts 모델 셀 라인으로이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다.
<ol><li>문화 NIH 3T3 fibroblast 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 1%와 10% 기증자 소 혈 청 보충 페니실린-스 35 m m 유리 하단에 원하는 confluency까지 요리. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합니다.<ol>
<li>NIH 3T3 세포 이미징 뿌리기 전에 모든 35 mm 유리 하단 요리 fibronectin (또는 유사한 ECM 단백질), 5 µ g/mL와 코트를 해야 합니다. 참고: 셀 해야 합니다 수 완전히 확산 및 실험에 대 한 접시에 부착. DFP 메서드가 작동 하려면 confluency 측면에서 제약 되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 직전 셀 완전 한 성장 매체를 가진 단일 세척 뒤 PBS로 두번 세척.</li>
	<li>유리 하단 접시에 완전 한 성장 매체의 3 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>2. 현미경 및 이미지 수집
참고:는 거꾸로 형광 현미경 (또는 동등한) micromanipulator 쪽 팔의 제조 업체의 권장 사항에 따라 설치 된와 함께. 현미경은 37 ° C에서 온도 CO2 수준 5%에서 유지 하기 위해 환경 챔버를도 복 한다. Micromanipulator 및 현미경에 부착 된 microinjector는 또한 필요 합니다. 기름 침수 40 x 1.3 / NA 또는 60 x 1.49 / NA (또는 해당 목표)는 실험에 대 한 것이 좋습니다. 현미경 진동 절연 테이블에 거치 되어야 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> 그림 1 . 핵 변형 및 현미경 초점 A. 최대 핵 변형 그리고 핵 변형의 휴식. 최대 핵 변형 계산 하기 전에 핵 모양의 뒤 가장자리 했다 처음 변형된 핵의 번역에 대 한 해결을 동시에. Micropipette 팁 초연의 순간에 핵의 모양 당기는 전에 초기 핵 모양에 중첩 되었다. 두 셰이프 사이의 지역 차이 Δ로 측정 되었다1. 최대 핵 변형 ΔA1 원래 핵 영역으로 나눈 값으로 정의 되었다. 마찬가지로, 두 번째 매개 변수, ΔA2, 원래 핵 모양에 micropipette 분리 후 최종 상태 핵 모양 오버레이하여 정의할 수 있습니다. 2. 초점 평면 A에 셀 이동한 다음 micropipette 팁을 찾을 수 평면 B까지 초점 비행기. 이미징, 동안는 micropipette 오른쪽 (주황색 화살표의 방향)으로 번역 되었다. 이 그림은 Neelam 외에서 수정 되었습니다. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol><li>제조 업체의 프로토콜 당 microinjector를 켭니다.</li>
	<li>침수 기름 스포이드를 사용 하 여 대물 렌즈 위에 침수 기름 한 방울을 적용 합니다.</li>
	<li>접시 홀더에 접시를 단단히 클램프 하 고 무대에 접시 홀더를 로드 합니다. 참고: 셀 실험 동안 37 ° C, 5% CO2 에서 유지 되어야 합니다.</li>
	<li>초점 (비행기, 그림 1B)에 셀을가지고 목표의 높이 조정 합니다.</li>
	<li>관심의 셀 데 현미경 단계를 이동 합니다.</li>
	<li>최상위 순위에 피펫으로 홀더 이동 micromanipulator에 조이스틱을 회전 합니다. 0.5 µ m 직경 팁 micropipette 피펫으로 보유자에 로드 합니다.<ol>
<li>micropipette에 세포 접착을 방지 하려면 미리 실 온에서 0.3 mg/mL 1 시간을 위한 PLL-g-말뚝 솔루션으로 micropipette 팁 취급. 모든 흡입 압력 없이 핵을 micropipette 감동 하 고 다음 핵에서 micropipette 번역 여 접착 테스트 합니다. 접착의 부재는 핵 변형 및 번역의 완전 한 부족에서 분별 수 있습니다. 참고: 패키지 여 제조 제안을 따르십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미세 제어를 조정 하 여 비행기 A와 비행기 B 셀의 맨 위에 객관적인 초점 비행기를 올립니다 (그림 1B단계 2.4 참조).</li>
	<li>거친 제어는 micromanipulator를 설정 합니다. 천천히 micropipette의 실루엣에 대 한 보고는 micropipette 초점으로 완전히 때까지 비행기 B 아래로 micropipette 가져.</li>
	<li>일단 micropipette 팁 초점에, 세밀 하 게 제어 하는 micromanipulator를 설정 합니다.</li>
	<li>목표 셀 (비행기 A, 그림 1B)의 적도 면에 낮은 및 15 µ m 비행기 A 위의 (그림 1B, 파선된 micropipette) micropipette.</li>
	<li>원하는 압력; microinjector에 보상 압력 (Pc)를 설정 안정 압력에 대 한 몇 초 동안 기다립니다. 참고: 최적의 압력 세트 포인트 셀 종류와 실험의 특정 목표에 따라 달라 집니다. 대부분의 경우, 300 hPa 좋은 출발점이 있을 것 이다.</li>
	<li>micropipette micromanipulator 패널에 클린 설정을 사용 하 고 기포 micropipette 팁에서 나타날 ㄴ 다는 것을 확인 하 여 막힌 되지 확인 하십시오.</li>
	<li>팁을 팁 핵 표면에 닿아 가볍게 때까지 micropipette을 서서히 낮추어 셀에 넣습니다. 참고:는 micropipette, 낮추는 때 micropipette 팁의 실루엣 될 것 이다 분명 그것은 초점으로 온다. 전에 micropipette 건드리면 핵, 객관적인 초점을 핵 (동일한 x y 좌표, 더 높은 z-비행기)와 micropipette 끝. 다시 핵 (비행기, 그림 1B)의 적도 면에 초점을 반환 및 점차 micropipette 팁.</li>
	<li>되므로 대기 micropipette 튜브의 끝을 열어 microinjection 시스템에서 압력 공급 튜브를 분리 하 여 micropipette 팁과 핵 막 인감을 만듭니다. 이 단계는 부정적인 압력 Pc 와 같은 핵 표면에 만듭니다.</li>
	<li>현미경 이미지 컬렉션 소프트웨어와 함께 이미지를 취득 합니다. Avi-인수 (비디오) 또는 nd-수집 (이미지) 이미지 컬렉션 소프트웨어에서를 설정 합니다. 참고: 어떤 이미징 소프트웨어를 인수, 실시간 비디오 이미징 또는 짧은 시간 간격으로 시간 경과 이미지 인수를 설정 합니다.</li>
	<li>해당 형광 이미징 채널을 토글 (즉, GFP, RFP, 등)와 이미징 시작.</li>
	<li>(오른쪽, 그림 1B)에 셀의 본문에서 micropipette 팁 번역 핵은 micropipette에서 분리 될 때까지. 참고: (오른쪽에 있는 보기의 필드에) 긍정적인 x 방향에 따라 팁을 당겨. 풀링 레이트 프로그램을 컴퓨터에 의해 제어 또는 조이스틱을 수동으로 이동할 수 있습니다. 우리 밀 지 사이 어떤 상관 관계를 발견 하지 않은 속도 핵 변형15 를 주로 탄성 응답을 제안.</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>사용할 수 있는 기본적인 이미지 처리 소프트웨어 이미지 분석을 수행 합니다. 길이 변형 (Ɛ) 또는 지역 스트레인 (그림 1A)에 의해 핵 변형 정도 측정할 수 수 있습니다. 길이 변형 방정식 1를 사용 하 여 계량 어디 L과 L0 는 각각 최대 변형 및 초기 위치에서 핵의 길이 나타냅니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(식 1)</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

어느 고립 된 핵 (핵은 골격에서 분리)를 필요로 하기 때문에 micropipette 포부16, 등 최신 방법에 대 한 도전 이다 골격 가진 핵의 기계적 통합 측정 또는 일시 중단 된 셀 (견인 힘, 같은 세포 외 세력 있는 결 석)에 핵. 강제로 막17,18; 세포 점착에 biaxial 긴장을 적용 하 여 핵에 적용 된 그러나,이 기술은 핵에 힘 불명 하다는 사실에 의해 제한 됩니다. 원자 힘 현미경 (AFM) 프로브; 그대로 셀에 핵을 사용 장점은 그들이 동안 핵의 기계적 성질을 공개 골격와 통합이 제공 합니다. 핵12,,1314대상이 기존 vivo에서 기술에 추가 하려면, 우리는 그것 동안 살아있...

암과 같은 병 리 핵 모양 및 구조1,2, 일반적으로 동반 된다 핵3,4의 '연'을 변경 포함 됩니다. 기계적 변형에 저항을 핵은 고립 된 핵5에 힘을 적용 하 여 일반적으로 특징 되었습니다.
셀에 핵 분자로 링커의 Nucleoskeleton와 골격 (링컨) 복잡 한6,7,,89골격에 연결 됩니다. 그 결과, 골격과, 세포 층 유착, 세포 외 매트릭스를 통해 핵 기계적으로 통합 되었습니다. 기계적으로 부착 세포 안에 핵을 프로 빙이 기계적 통합에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 살아있는 세포에서 핵을 조작 하는 메서드는 micropipette 포부10,11및 원자 힘 현미경 검사 법12,,1314있습니다. 우리는 최근 생활 부착 셀15에 핵에 직접 기계적인 힘을 적용 하는 직접 힘 프로브 (DFP)를 설명 합니다.
여기, 우리가 일반적으로 알려진된, 나노 기계적 힘을 부착 셀에서 핵 직접 적용할 현미경 시설에서 사용할 수 있는 microinjection 시스템을 사용 하기 위한 절차를 설명 합니다. Femtotip (0.5 µ m 직경 micropipette 팁) 탑재 하 고 튜브에 의해 microinjection 시스템에 연결 된. 때까지 핵 표면에 인접 한 문화 접시의 표면에 상대적으로 45 ° 각도로 위치 팁은 낮 췄 다. 튜브 분리 그리고 핵 표면에 부정적인 흡입 압력을 만들고 물개 micropipette 팁 핵 표면에 대 한 분위기에 열입니다. Micropipette 팁의 번역을 통해 핵 변형 이며 결국 (적용 되는 힘의 크기), 따라는 micropipette에서 분리. 이 분리는 micropipette에 의해 적용 되는 흡입 힘 동등 하 게 복원 (저항) 세력, 핵 및 셀에 의해 발휘 될 때 발생 합니다. 핵의 변위를 측정 하 여 분석을 수행할 수 있습니다 길이 변형 (공식 1), 또는 지역 스트레인 (그림 1A).

<table><tbody><tr><td>FluoroDish</td><td>WPI</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>펨토팁스&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>단종, 현재 동급모델: InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>현재 모델 FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan Fluor oil immersion 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF oil immersion 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Donor Bovine Serum (DBS)</td><td>ThermoFisher 과학적</td><td>16030074</td><td>NIH 3T3 혈청</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Eagle's (DMEM)</td> <td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 배지</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td></td><td>MT30004CIRF NIH 3T3 중간 보충제</td></tr><tr><td>이머젼 오일 타입 LDF 비형광</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>이머젼 오일, 오브젝티브 렌즈용&nbsp;</td></tr></tbody></table>

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

핵의 기계적 속성 응답 세포에서 생성 된 기계적인 힘을 결정 합니다. 핵 분자로 골격과 연속 이므로 메서드 부착 세포의 기계적 동작을 필요 합니다. 여기, 우리가 살아있는 부착 세포에서 핵에 직접 힘을 적용 하는 도구로 직접 힘 프로브 (DFP) 토론. 우리는 흡입과 핵 표면에 좁은 micropipette를 연결합니다. micropipette는 변형 하 여 번역 핵 핵 거리 변환 됩니다. 복원 힘은 흡입 힘, 핵 분리 되 고 탄력적 이완. 흡입 압력을 정확 하 게 알려져 있다, 때문에 핵 표면에 강제로 알려져 있다. 이 메서드는 나노 스케일 세력 변형 및 부착 세포에서 핵을 번역 하기에 충분 되며 저항 세력에 핵을 사용할 수 있는 cytoskeletal 요소를 식별 밝혔다. DFP는 살아있는 세포에서 핵 기계적 속성의 구성 요소 세포질과 핵의 기여를 해 부를 사용할 수 있습니다.

그림 2A 는 NIH 3T3 마우스 구와 핵의 강제로 보여줍니다. Micropipette 팁은 오른쪽에 번역, 핵 변형 하 고 결국 micropipette 팁에서 분리. 핵의 길이 변형 흡입 힘 (그림 2B) 증가 함께 증가를 볼 수 있다. 핵 (micropipette 당기는 가장자리)의 앞쪽 가장자리 핵 돌출을 형성 하 고 후행 가장자리 그것의 원래 위치에서 난민. 돌출의 길이 후행 가장자리 변위 (그림 2C), 핵 및 주변 세포질 간의 긴밀 한 통합을 제안 보다 훨씬 큽니다. 시간의 척도 핵 앞쪽 가장자리의 짧은 휴식 (&lt; 1 s), 그리고 핵 뒷면 가장자리 (&lt; 2 s) (그림 2D).
<p class="jove_content" fo:k...

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

이 방법은 핵 역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 세포의 핵을 변형시키는 데 필요한 힘은 무엇입니까? 변형에 대한 핵 저항성에 대한 세포 및 핵 구성 요소의 기여는 무엇입니까?아니면 세포 구조와의 핵 결합이 세포 유형에 따라 다른가요? 이 기술의 주요 장점은 살아있는 부착 세포에서 통합 핵-세포 골격을 변형시키기 위해 프로빙 힘을 가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 NIH-3T3 세포의 핵 기계적 특성에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용되었지만 Hutchinson-Gilford progerial cell의 핵 기계적 특성을 조사하는 것과 같은 모든 부착 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 35mm 유리 바닥 접시에 밀리리터당 5마이크로그램의 피브로넥틴을 코팅합니다. 그런 다음 코팅된 접시에 10% 공여자 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 NIH 3T3 섬유아세포 세포를 원하는 농도가 될 때까지 섭씨 37도로 배양합니다. 실험 직전에 PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 완전한 성장 배지로 한 번 세척합니다.그런 다음 유리 바닥 접시에 3ml의 완전 성장 배지를 추가합니다. 이 절차에서 마이크로인젝터를 켭니다. 이멀젼 오일 스포이드를 사용하여 대물 렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 바릅니다.그런 다음 접시를 접시 홀더에 단단히 고정하고 접시 홀더를 무대에 싣습니다. 실험 내내 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지되어야 합니다. 다음으로, 대물렌즈의 높이를 조정하여 셀에 초점을 맞춥니다.현미경 스테이지를 움직여 관심 세포를 찾습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 홀더를 가장 높은 위치로 이동합니다. 그런 다음 0.5 마이크로미터 직경의 팁이 있는 마이크로피펫을 피펫 홀더에 로드합니다.그런 다음 미세 제어를 조정하여 대물렌즈 초점면을 평면 A와 셀 상단을 평면 B로 올립니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 거친 제어 위치로 설정합니다. 마이크로피펫에 초점이 완전히 맞춰질 때까지 마이크로피펫의 실루엣을 관찰하여 마이크로피펫을 B 평면으로 천천히 가져옵니다.마이크로피펫 팁에 초점이 맞춰지면 마이크로매니퓰레이터를 미세 제어로 설정합니다. 그런 다음 대물렌즈를 세포의 적도 평면으로 낮추고 마이크로피펫을 그보다 약 15마이크로미터 위로 낮춥니다. 마이크로인젝터의 보상 압력을 원하는 압력으로 설정합니다.압력이 안정될 때까지 몇 초간 기다립니다. 피펫 팁이 파손되거나 막혔는지 확인하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 힘 측정이 정확하지 않을 수 있습니다. 마이크로매니퓰레이터 패널의 청소 설정을 사용하여 마이크로피펫이 막히지 않았는지 확인하고 마이크로피펫 팁에서 기포가 나오는지 확인합니다.그런 다음 마이크로피펫 팁이 핵 표면에 가볍게 닿을 때까지 세포에 삽입합니다. 마이크로주입 시스템에서 압력 공급 튜브를 분리하여 마이크로피펫 끝부분을 대기로 개방하여 마이크로피펫 팁과 핵막 사이에 밀봉을 만듭니다. 이 단계는 핵 표면의 보상 압력과 동일한 음의 압력을 생성합니다.그런 다음 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. 이미지 수집 소프트웨어에서 이미지에 대한 비디오 또는 ND 획득을 위한 AVI 획득을 설정합니다. 그런 다음 해당 형광 이미징 채널로 전환하고 이미징을 시작합니다.핵이 마이크로피펫에서 분리될 때까지 마이크로피펫 팁을 세포 본체에서 멀리 이동합니다. 이 그림은 NIH 3T3 마우스 섬유아세포 핵의 강제를 보여줍니다. 마이크로피펫 팁이 오른쪽으로 이동함에 따라 핵이 변형되어 결국 마이크로피펫 팁에서 분리됩니다.핵의 길이 변형은 흡입력이 증가함에 따라 증가하는 것으로 보입니다. 핵의 앞쪽 가장자리는 핵 돌출부를 형성하고 뒤쪽 가장자리는 원래 위치에서 변위됩니다. 돌출부의 길이는 트레일링 엣지 변위보다 훨씬 크며, 이는 핵과 주변 세포질 사이의 긴밀한 통합을 시사합니다.시간 척도는 핵 전면 가장자리와 핵 후면 가장자리의 이완을 위해 짧습니다. Direct force probe는 변형에 대한 핵의 저항에 대한 핵 내 및 세포 골격 구조의 기여도를 결정하는 데 사용되었습니다. 형광 이미지는 표시된 조건에서 핵의 오버레이를 보여주었습니다.F-actin 파괴 또는 미세소관 파괴 후 핵 변형 또는 번역에서 유의미한 차이는 발견되지 않았지만, siRNA 기반 녹다운을 통해 멘텐 발현을 줄이면 핵 번역 및 변형이 크게 증가했습니다. 이것은 섬유아세포의 멘텐 중간 필라멘트가 핵이 국부적인 힘에 저항하는 데 도움이 되는 주요 세포골격 요소임을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 부착 세포의 핵에 제어되고 알려진 힘을 가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 글로벌 또는 지역화된 스트레인 응용 프로그램에 대한 응답으로 하나의 살아있는 자기편 세포에서 유도된 핵 및 cytoskeletal deformations을 측정하기 위해 두 개의 독립적인, 현미경 기반의 도구를 제시한다. 이러한 기술은 핵 강성 (즉, deformability)을 확인하고 핵과 cytoskeleton 세포 사이에 강제로 전송을 탐사하는 데 사용됩니다.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

여기, 우리는 프로토콜 nucleosome 정적 및 시간 경과 원자 힘 현미경 (AFM) 이미징 기술을 사용 하 여 단일 분자 수준에서 입자의 특성을 제시. 설명 된 표면 기능화 방법 구조의 캡처 및에 nucleosomes의 역학에 대 한 수는 nanoscale에 고해상도.

구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사

여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

이 논문은 DNA 기반 장력 프로브를 사용하여 면역 세포에 의해 가해지는 수용체 힘을 이미지화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 수용체 힘&gt;4.7pN을 실시간으로 매핑할 수 있으며 시간이 지남에 따라 힘을 통합할 수 있습니다.

면역 세포에 의한 일시적인 피코네톤 수용체 힘을 매핑하는 DNA 장력 프로브

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 세포핵에 기계적 힘을 직접 적용하고 동시 살아있는 세포 형광 이미징을 수행하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.

3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.

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구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

학습하세요 마이크로피펫 기법을 활용한 살아있는 부착세포의 핵 변형력 측정 방법을. 이 기술은 NIH-3T3 및 다양한 세포주에서 핵 역학 특성을 연구하는 데 활용됩니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

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