Name: ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 학습하세요 형광 이미징을 활용한 Drosophila 신경퇴행성 질환 모델에서 단백질 응집체 정량 분석 방법을. ImageJ 기반 반자동화 워크플로우로 선택 편향을 최소화하고 재현성을 극대화하여 세포 생물학적 메커니즘을 심도 있게 이해할 수 있습니다.

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이 작품은 쉴라와 데이비드 Fuente Neuropathic 고통을 연구 프로그램 대학원 친교 (J.M.B.)에 의해 지원, 로이스 교황 생활 휄 로우 프로그램 (카스 티 야, Y.Z., 및 J.M.B.)는 스나이더-로빈슨 재단 Predoctoral 친목 (카스 티 야), 닥터 존 T . 맥도날드 재단 (에 카스 티 야), 계약서, 부여에서 건강 (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018, 및 R56NS095893의 국가 학회 (R.G.Z.), 고 대 산 학자 프로젝트 (산둥 성, 중화 인민 공화국) (R.G.Z.)에 의해.

1. 고려 사항 및 이미지 분석 실험 설계에 대 한 준비
<ol><li>미리 적당 한 해부학, 세포, 또는 subcellular 마커 다른 샘플에서 관심 (ROI) 영역에 표준화에 대 한 랜드마크로 서 역할을 예를 들어 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 막 마커, 지역화 된 형광 단백질, 등
</li>
	<li>관심의 구조에 대 한 배경 수준 넘어 개별 puncta 구분 수 형광 마커를 선택 합니다. 참고:이 프로토콜은 최적화 배치할 구조 (예를 들어, misfolded 단백질 집계)와 막 바인딩된 세포 (예를들면, autophagy 기자). 단백질 집계를 시각화 하려면 138 반복 (RFP-hHttQ138)의 병원 성 polyQ로 인간의 Htt 단백질의 N-터미널 RFP 태그 조각이 사용된5이었다. 돌연변이 체 Htt 단백질 세포질 집계 elav GAL45,6등 신경 특정 드라이버에서 표현 하는 때 형성 한다. Autophagosome-리소좀 플럭스를 시각화 하려면 말라 GAL4 편 탠덤 mCherry GFP Atg8a 기자의 식 드라이브 사용 되었다. mCherry-GFP-긍정적인 puncta autophagosomes, 나타내고 GFP 형광 단백질이 저하7때까지 산을 구분 하지 않는 mCherry의 남아 있는 리소좀의 산 성 환경에서 침묵으로 유량 모니터링 합니다. 비율 분석을 위해 구조의 일관 된 표식 인 단일 채널 세분화, 사용 하거나 두 개 이상의 채널의 투영 구조, 윤곽을 그리 다를 사용할 수 있는 적절 한 경우 비록 명시적으로 설명 된이 프로토콜에 될 수 있습니다. 이 예제에서 mCherry는으로 산을 구분 하지 않는 경로 통해 유출 통해 구획에 남아 있을 것 이다 Atg8-긍정적인 입자의 세분화에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>다운로드 하 고 오픈 소스 이미지 분석 플랫폼 ImageJ 또는 피지 설치-와 ImageJ의 기본 배포 번들 플러그인2,3.</li>
	<li>H-맥시 마 대화형 유역에 대 한 플러그인을 설치 합니다. 참고:이 프로토콜 사용 하 여 피지; 추가 플러그인 ImageJ에 대 한 필요할 수 있습니다. Benoit Lombardot SCF-MPI-CBG에 의해 개발 된 플러그인은 사용할 수 온라인 (https://imagej.net/Interactive_Watershed)입니다.</li>
	<li>로 이동 "도움말 | 업데이트","관리 업데이트 사이트"선택" ImageJ 업데이트 "에서 목록에서 SCF-MPI-CBG 업데이트 사이트를 선택 하 고 다음 닫고 다시 시작 피지.</li>
</ol>2. 뇌의 해 부와 면역 형광 염색
<ol><li>
실리콘 고무 줄 절 개 요리를 합니다.
	<ol>
<li>실리콘 엘라 스토 머 부품에 붓고 비 커 및 철저 하 게 혼합 때까지 잘 저 어에 표시 된 대로.</li>
		<li>5 cm을 채우기 위해 한 피 펫을 사용 하 여 조직 문화 요리 1-3 반에 전체 (고무 혼합물의 약 10 mL). 어떤 거품 표면에 승천 하 고 티슈로 제거를 허용 합니다. 요리를 커버 하 고 실내 온도 (RT)에서 48-72 h에 대 한 치료를 레벨 표면에 그들을 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
초파리 뇌, 그리고 필요한 경우 비주얼 시스템을 해 부.
	<ol>
<li>앞에서 설명한8,9 초파리 뇌 해 부를 수행 합니다. 파괴적인 조직 또는 집게를 피하기 위해 두뇌를 안정 시키기 위해 고무 바닥을 사용 하 여 고무 줄 절 개 요리를 해 부를 수행 합니다.</li>
		<li>해 부 동안에 lamina 그대로 유지, 망막 아래 두 개의 집게를 슬라이드 하 고 부드럽게 제거 망막을 눈의 중간을 통해 눈물. Lamina 표면에 평행 하 게 개최 하는 집게와는 lamina에 연결 된 어떤 망막 조직을 멀리 당겨. 참고: 잔여 안료 다음 단계에서 씻어 것입니다 그리고 일반적으로 항 체 얼룩이 지 고 이미징 방해 하지 않습니다.</li>
		<li>인산 염 버퍼 식 염 수 500 µ L microcentrifuge 튜브에 3.7%의 최종 농도 사용 하기 전에 신선한 게를 (PBS)에 37% 포름알데히드를 희석. 수정 솔루션 microcentrifuge 관에 해 부 두뇌를 전송 하 고 부드러운 락와 RT에 15 분 동안 품 어. 참고: 포름알데히드 포 름 산을 생산 자연 산화 될 경향이 있다. 따라서, 그것은 스토리지에 대 한 약 수는 37% 포름알데히드를 제안 및 각 사용 전에 갓 3.7%에 희석입니다. -고정 또는 아래 고정 조직 및 형광10의 무결성에 영향을 것입니다.</li>
		<li>PBTx로 3 회 세척 (PBS 0.4% 트라이 톤 X-100) 15 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunohistochemistry 수행 하 고 표본 탑재.
	<ol>
<li>항 체는 얼룩이 지는 필요한 경우, PBTx를 제거, PBTx에서 5% 정상 염소 혈 청 희석 주 항 체를 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 aliquot 믹서에 품 어</li>
		<li>1 차적인 항 체를 제거 하 고 15 분 동안 PBTx와 3 번 세척. 추가 5% 정상 염소 혈 청 희석 PBTx에서 이차 항 체와 RT에 1 시간에 대 한 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤 PBTx 3 시간 15 분 동안 씻어.</li>
		<li>DAPI 얼룩은 필요한 경우, PBTx 제거, DAPI 솔루션 추가 (재고 솔루션: 5 mg/mL, 희석 작업 PBTx에 15 µ g/mL의 농도에), 및 실시간 씻어 3 시간 15 분 동안 PBTx에서 10 분 동안 품 어.</li>
		<li>취소는 조직, 양쪽에 명확한 테이프의 1 개의 층의 스페이서와 현미경 슬라이드의 중심에 장착 매체의 한 방울을 배치 합니다. 전송 설치 매체의 드롭에 두뇌와 두뇌 투명 하 게 될 때까지 1-2 분 기다립니다. 조심 스럽게 제거를 피 펫을 장착 매체.</li>
		<li>탑재, 슬라이드에 두뇌에 신선한 설치 매체의 방울을 적용 합니다. 조심 스럽게 거품을 피하고 커버 유리 오버레이. 고무 시멘트, 가장자리를 밀봉 하 고 20 분 최상의 결과 얻으려면 이미지 수집을 진행에 대 한 실시간에 건조.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 이미지 수집
<ol><li>공간 해상도, 목표, 스캐닝 속도, 줌 현미경 수집 매개 변수를 최적화 하 고 단계 크기, 이미지 분석 중 반자동된 세분화를 촉진 하기 위하여 관심의 구조의 해상도 최대화 하기 위해. 참고: 그것은 샘플 이미지를 캡처하고 모든 실험 샘플을 이미징 하기 전에 (이 프로토콜의 5 단계)에서 반자동된 세분화를 테스트에 유용할 수 있습니다. 이 방법으로 사용자 분석 도구 쉽게 관심의 생물학 구조를 분별 수 있도록 이미지 설정을 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>
높은 신호 대 잡음 비율 및 표본의 높은 동적 범위를 캡처 이미지 검출기 컨트롤을 조정 합니다.
	<ol>
<li>사용 하 여 픽셀의 채도 (너무 높은 노출) 또는 undersaturation (너무 낮은 오프셋) 설정 (그림 3B, 빨간색 나타냅니다 안녕/낮은 LUT에 의해 픽셀 채도) 조정 하는 동안 나타내는 LUT (조회 테이블).</li>
		<li>이득 및 오프셋 설정은 모든 실험적인 그룹에 대 한 적절 한 실험 조작 가능성이 관심의 구조 변경으로 확인 합니다. 참고: 그것은 절대적 양적 비교에 같은 설정이 모든 그룹에 대해 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 데이터를 캡처하려면 조직을 통해 이미지입니다. 참고: 한 이미징 세션 동안 사용할 수 있는 데이터의 모든을 포착 하 고 필요한 경우 4 단계에서에서 ROI 선택 동안 더 정확한 영역을 정의 하 것이 좋습니다.</li>
	<li>인수 매개 변수 및 공간 교정 같은 메타 데이터를 보존 하기 위해 이미징 소프트웨어에서 지 원하는 파일 형식으로 이미지를 저장 합니다. 실험 날짜, 유전적 배경, 그리고 형광 성 취재 원, 항 체를 포함 한 파일 이름으로 이미지를 저장 또는 채널에 해당 하는 염료 같은 [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _Ch1. 스캔 [Fluorophore-표적 /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye], 등
</li>
</ol>4. 피지/ImageJ 이미지 가져오기 및 ROI 선택
<ol><li>피지에서 이미지를 엽니다. "바이오 형식 가져오기 옵션" 대화 상자를 사용 하 여, 선택 "으로 보기 스택: Hyperstack" 설정 "색상 모드: 회색 음영". 참고: 공간 교정 피지에 의해 읽을 수 수와 같은 메타 데이터로 현미경 파일 형식을 열려면 추천 된다.</li>
	<li>
하나의 z-비행기 또는 표본 (그림 1, ROI 선택)에 걸쳐 표준화 된 투자 수익으로 사용 될 수 있는 마커 채널에 따라 투영에서 영역을 식별 합니다.
	<ol>
<li>"C" 스크롤 막대를 사용 하 여 단계 1.1에서에서 지정 하는 marker(s)을 캡처하는 데 사용 하는 채널을 볼 수 있습니다.</li>
		<li>"Z" 스크롤 막대를 사용 하 여 초점 비행기를 통해 이동. 단일 슬라이스를 선택 하거나 클릭 하 여 여러 조각의 투영을 만듭니다 "이미지 | 스택 | Z 프로젝트"및 설정" 시작 "조각과"Stop 슬라이스"투자 수익을 포괄 하는. 참고: "투영 유형 설정" "Z 프로젝트"에서 "최대 강도" 대화 상자는 자주 가장 적합 섹션 5에 세분화에 대 한 구조를 강조 하기 위해이 모든 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다 비록. 다른 유형의 투영 분석을 위해 필요한 경우, 저장 하 고 따라서 섹션 6 또는 7 기능 추출에 대 한이 파일을 문서 처리.</li>
		<li>채널 및 이미지 분석 프로토콜에서 다음 단계를 단순화 하는 관심의 초점 plane(s)를 포함 하는 새로운 이미지를 생성 합니다. 선택 "이미지 | 중복 "을 원하는"채널"(c)와"분할 영역"(z), 설정 하 고 (예를 들어, [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) 실험 선택에 맞게 파일 이름을 변경할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4.2 단계에서 결정 하는 선택 기준에 따라 표준화 된 ROI를 수동으로 선택 하 피지 도구 모음에서 "선택 도구" 중 하나를 사용 합니다.</li>
	<li>클릭 하 여 투자 수익 ROI 관리자에 추가 "분석 | 도구 | 투자 수익 관리자 "및 ROI 관리자 메뉴에서"추가 "를 클릭 합니다. 클릭 하 여 투자 수익 ROI 관리자 메뉴에서 저장 "더 | 저장"하 고 투자 수익을 반영 하기 위해 파일 이름을 (예를 들어, [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ [z-plane(s)] _ [투자 수익 설명]). 참고:이 나중 분석에 대 한 피지에 재개 될 수 있다 또는 다른 채널 또는 5.3 단원에서 이미지에 적용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 전처리 및 h-맥시 마 Watershedding와 시장 세분화
<ol><li>
관심의 구조를 캡처하는 데 사용 하는 채널에 전처리를 수행 합니다.
	<ol>
<li>이미지 파일 여러 채널의 경우, 클릭 하 여 채널을 분리 "이미지 | 컬러 | 채널 분할"관심의 채널을.</li>
		<li>소음이 나 클릭 하 여 스무 딩 가우스 흐림 효과 줄이기 위해 중간 필터 같은 필터를 적용 "과정 | 필터 | 필터 유형"(예를 들어," 중간값 필터 "또는" 가우스 흐려 ").<ol>
<li>다른 필터를 샘플 하 고 각 실험 그룹에서 이미지 매개 변수를 필터링 합니다. 단계 6.2 세분화 성능 확인 각 그룹에서 대표적인 예를 계속 수행 합니다. 필터 및 관심의 구조의 세분화를 촉진 하는 설정을 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>필터 및 설정을 기록 합니다. 실험 그룹에서 이러한 매개 변수를 적용 합니다.</li>
		<li>Tiff 파일 참조에 대 한 적용 된 필터를 포함 하 여 이미지의 복사본을 저장. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 상세한 이름을 사용 [z-plane(s)] _ [매개 변수 필터].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전처리 된 이미지 생성 및 단계 5.1에서에서 저장에 대화형 h-최대 분수령 도구에 대 한 관심의 구조의 세분화를 수행 합니다.
	<ol>
<li>피지에서 활성 전처리 이미지 클릭 하 여 h-맥시 마 대화형 분수령 도구 시작 "SCF | 라벨 | 인터랙티브 H_Watershed "입니다. 참고:이 플러그인 분수령와 먼저 다음 사용자에 게 로컬 맥시 마와 즉시 업데이트 출력 이미지를 통해 세분화에 임계값 옵션의 효과 탐험.</li>
		<li>컨트롤 패널에서 씨앗 역학 (h), 강도 임계값 (T), 및 세분화를 최적화 하기 위해 (%)을 초과 하는 피크를 조정 합니다. 참고: 항상 섹션 4.2 수동으로 관심의 구조의 세분화의 성능 검사에에서 전처리 하기 전에 raw 이미지를 참조.</li>
		<li>세분화 결과 만족 하는 경우 "내보내기 영역 마스크"를 선택 하 고 "내보내기"를 선택 하십시오. 이 분수령 결과 (그림 1, 분할)의 이진 이미지를 생성 합니다.</li>
		<li>기록 세그먼트 매개 변수; 이 매개 변수는 양적 비교에 대 한 실험적인 그룹에 적용할 필요가 있다. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 이름에 대 한 자세한 세그먼트 매개 변수 참조에 대 한 원하는 경우 이진 결과 마스크를 저장 [z-plane(s)] _ [매개 변수가 있는 필터] _ [H_Watershed 매개 변수].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분수령 결과에서 관심의 구조를 추출 합니다.
	<ol>
<li>투자 수익 관리자에 단계 4.4에서 저장 된 ROI를 엽니다. 5.2.4 활성 단계에서 이진 영역 마스크 기능 추출 표준화 된 투자 수익을 제한 하려면 이미지에 적용할 ROI 관리자에서 투자 수익을 선택 합니다.</li>
		<li>이진 분수령 마스크에 활성 ROI 선택 "분석 | 분석 입자 ""관리자 추가"기능을 추출 하는 대화 상자에서 선택 합니다. 참고:이 세분화 ROI 관리자에 동안 delineated 각 구조에 대 한 입자 식별자를 추가 합니다. 옵션 크기 또는 순환 분석에 포함 하는 구조를 수정 하는 데 필요한 경우에 따라 기능을 제외 하려면이 메뉴에서 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>클릭 하 여 입자를 저장 "더 | 투자 수익 관리자 메뉴에서 "저장 합니다. 식별자를 선택 하 고 모든 입자 모두 zip 파일에 저장 됩니다 확인 하십시오. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 상세한 이름을 사용 [z-plane(s)] _ [매개 변수가 있는 필터] _ [H_Watershed 매개 변수] _ [구조].</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 수량, 지역, 그리고 강도 정량화 및 분석
<ol><li>생성 및 저장 단계 4.2에서에서 raw 이미지를 엽니다. 관심의 구조를 캡처하기 위해 사용 되는 채널을 스크롤하십시오. 참고: 적용 단계 5.1 변경에서 필터 픽셀 값으로 (전처리) 전에 raw 이미지에서 강도 측정 하는 중요 한 이다.</li>
	<li>5.3 단계에서 기능 추출에서 얻은 입자 열고 ROI 관리자에서 "모두 보기"를 선택 합니다. 참고:이 작업 각 입자에는 "ROI 관리자" 이미지에 대 한 개요를 오버레이 및 관심 (그림 1, 기능 추출)의 구조의 가장자리를 일치 해야 합니다.</li>
	<li>클릭 하 여 원하는 측정을 설정 "분석 | 설정 측정 ". 참고: 영역, 강도, 그리고 입자의 밀도 "지역" 및 "통합된 밀도"를 선택 하 여 측정할 수 있습니다. 통합된 밀도 옵션을 선택 하면 피지 두 값을 생산할 예정 이다: 지역 및 평균 회색 값과 '원시 통합 밀도' 픽셀 값의 합으로 측정으로 계산 '밀도 통합'. 입자에 형광 단백질의 밀도 지역으로 나눈 픽셀 값의 합으로 계산 됩니다. 5.3 단계에서 생성 된 입자의 수 ROI 4.4 단계에서 정의 하는 조직 내의 입자의 수량을 나타냅니다.</li>
	<li>투자 수익 관리자 메뉴에서 "측정"을 선택 합니다. 결과 측정 이미징 소프트웨어에서 피지에서 파생 된 파일에서 가져옵니다으로 보정 단위로 표현 됩니다. 결과 창에서 결과 복사 하 고 컴파일 및 추가 계산 스프레드시트 소프트웨어에 붙여 넣습니다.</li>
</ol>7. 비율 정량화 및 데이터 분석
<ol><li>단계 6.1 및 6.2 입자 식별자의 첫 번째 원시 채널에 여.</li>
	<li>클릭 하 여 원하는 측정을 설정 "분석 | 설정 측정 ". 참고: 입자 당 평균 강도 "의미 회색 값"을 선택 하 여 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>투자 수익 관리자에서 "측정"을 선택 합니다. 결과 창에서 데이터를 복사 및 붙여넣기 스프레드시트 소프트웨어에.</li>
	<li>관심,이 예 (그림 4A), GFP의 두 번째 원시 채널에 "C" 스크롤 막대를 이동 하 고 반복 하는 단계 7.2. 그리고 7.3입니다. 참고: 입자 저장 단계 5.3에서에서 기본적으로 됩니다 채널 및 생성 된 조각. 주의 입자의 올바른 채널에 적용 됩니다.</li>
	<li>스프레드시트 소프트웨어에서 각 입자에 대 한 두 번째의 강도를 하나의 채널에서 휘도의 비율을 계산 합니다.</li>
	<li>
산 점도 사용 하 여 시각화 하 고 개별 변경 기본 생물학 과정의 반사를 전시 fluorophores에서 비율 계량 데이터를 계량.
	<ol>
<li>그래프 소프트웨어에서 산 점도 생성 합니다. 참고: 각 데이터 요소는 관심의 첫 번째 fluorophore의 강도 "x"값 및 두 번째 fluorophore의 강도 각 입자를 측정 하는 "y 값"의 구조를 나타냅니다.</li>
		<li>게이팅 사분면을 정의 하기 위해 각 fluorophore에 대 한 임계값을 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
선 프로 파일을 사용 하 여 관심의 구조에 걸쳐 fluorophore 강도 시각화.
	<ol>
<li>5.3 단계에서 생성 된 ROI를 선택 하 고 도구 모음에서 직선 도구를 사용 하 여 투자 수익을 통해 직선을 그립니다. 라인 투자 수익 ROI 관리자에 추가 합니다.</li>
		<li>관심, 투자 수익, 라인의 각 채널에 대 한 선택 "분석 | 플롯 프로필 ". 참고: 플롯 프로필 기능 히스토그램 플롯 및 라인을 따라 강도 값의 테이블을 생성 합니다. 각 채널 및 붙여넣기 스프레드시트 소프트웨어 라인을 따라 두 채널을 보여주는 플롯을 생성 하에 측정 결과 복사 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

튼튼하게 그리고 reproducibly quantitate 형광 기반 이미징에 의해 시각 세포 생물학 과정을 여기에 설명 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 생물 학적 컨텍스트 및 기술적 한계 실험 설계 가이드를 신중 하 게 고려 될 필요가 있다. 관심의 subcellular 구조의 형광 마커 immunohistochemical, 염료 기반, 또는 유전자 표현 배경 형태와 강도 의해 위에 구별 될 필요가 있는지. UAS/GAL4 시스템 널리 초파리에 타겟된 유전자 발현을 운전 하는 데 사용 됩니다. 여기에 제시 된 예제 단백질 집계 및 신 경계에서 autophagy 조사 UAS 증강의 통제 붙일 태그가 단백질의 전사를 활성화 하기 위해 유전자 변형 라인 GAL4 드라이버를 들고 사용. 실험적인 UAS transgene의 동시 식 형광 리포터 transgene 함께 필요한 경우, 다음 컨트롤 그룹 또한 포함 해야 한다 예 GAL4 복용량에 대 한 제어를 하 찮은 transgene의 공동 ov...

신경 퇴행 성 질환에 영향을 미칠 수백만의 사람들이 매년 고 발생률은 노후화 인구1증가 하 고 있다. 각 신경 질환은 독특한 병 인, misfolded 단백질의 집계 및 proteostasis 네트워크의이 질병의 많은 것의 일반적인 병리학 특징입니다. 어떻게 이러한 근본적이 고 상호 프로세스의 중단 awry elucidating 신경 역 기능 및 세포 죽음에 기여 하이 중요 이해 신경 퇴행 성 질환으로 치료 개입을 유도 합니다. 형광 기반 이미징 뉴런에서 이러한 복잡 하 고 동적 프로세스의 조사 가능 하며 신경 세포 생물학의 우리의 이해에 크게 기여 했다. 붙일 태그가 단백질의 분석 실험 실행 된다 vivo에서, 매우 소형 조직, 다양 한 세포 유형 및 형태학이 때에 특히 도전, 이다. 수동으로 보조 정량화 저렴 하 고 간단, 하지만 종종 소모 및 인간의 편견. 따라서, 이미징 연구에서 정량 데이터를 추출, 재현성, 공평 하 고 액세스할 수 있는 방법에 대 한 필요가 있다.
우리의 실험 모델에서 형광 이미징 연구에서 양적 데이터를 추출 피지/ImageJ, 강력 하 고 자유롭게 액세스할 수 있는 이미지 처리 소프트웨어2,3를 사용 하 여 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 설명 했습니다. neurodegeneration 초파리를 사용 하 여입니다. 단백질 집계 및 autophagic 유량을 계량 하이 프로토콜에 따라-2 셀 neurodegenerative 질병 병 리 관련성이 높은 생물학 기능-우리 감도 재현성이이 방법의 설명. Drosophila 광 엽에 붙일 태그가 돌연변이 huntingtin (Htt) 단백질의 분석 수, 크기, 및 단백질의 강도 공개 했다. 우리 시각 autophagic 플럭스4compartmental 환경 따라 다른 방출 신호 표시 초파리 비주얼 시스템 내에서 협동 형광 기자. 탠덤 기자 저하는 리소좀에 autophagosome 형성, 성숙, 그리고 전송에서 autophagy 리소좀 플럭스의 양적이 고 포괄적인 보기에 대 한 허용 하 고 또한 취약 한 강조의 비율 기반 분석 신경 퇴행 성 조건에서 중단 하는 구획. 중요 한 것은, 의식이 없는 편견을 최소화 하기 위해 우리의 프로토콜에 반자동된 임계 처리 및 세분화 단계를 구현 우리 모두 분석, 샘플링 파워를 증가 하 고 비슷한 연구 간의 비교를 촉진 하기 위하여 표준을 제공 키를 누릅니다. 간단한 워크플로 강력한 피지/ImageJ 플러그인 (수학 알고리즘에 따라 컴퓨터 과학자에 의해 개발)을 위한 neurobiologists과 생명 과학 지역 사회에 더 접근 가능.

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>해부 접시</td></tr><tr><td>Falcon 35mm TC 처리되지 않음 쉽게 그립 스타일 세균 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>해부 접시</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>PBS 솔루션</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS 솔루션</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS 솔루션</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>세척 및 항체 인큐바톤 솔루션.&nbsp;</td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td>고정</td></tr><tr><td>일회용 마이크로 원심분리기 튜브 (0.5mL, 파란색)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>고정, 세척 및 항체 인큐베이션.&nbsp;</td></tr><tr><td>플레인 및 프로스트 마이크로 슬라이드 (25&times; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>컨포칼 이미징용</td></tr><tr><td>슬라이드 마이크로 커버 안경, 직사각형 (22회; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>컨포칼 이미징용 슬라이드</td></tr><tr><td>고무 시멘트</td><td>슬라임</td><td>1051-A</td><td>마운팅</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>마운팅</td></tr><tr><td>스카치 매직 810 인비저블 테이프 (19mm&times; 25.4m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>마운팅</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>항체 인큐바톤</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>핵산 염색. 탈이온수에 용해시켜 5mg/mL 원액을 만들고 -80°C에서 보관합니다. 10-20°C의 작업 농도로 희석합니다. g/mL(PBTx)입니다.</td></tr><tr><td>3.5X-90X 스테레오 줌 검사 산업용 현미경</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>해부 범위. 6W LED 듀얼 구즈넥 조명기</td></tr><tr><td>장착 ImageJ / Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>SCF_MPI_CBG 플러그인 (버전 1.1.2)</td></tr> <tr><td>FV1000-IX81 컨 포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 구조</td><td>블루밍턴 초파리 주식 센터</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

imagej를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 neurodegeneration의 양적 세포 생물학

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

신경 퇴행 성 질환의 증가 보급, 신경 장애 및 손실 기본 이상 이해 하는 것 점점 더 중요 하다. 형광-기반 이미징 도구 및 기술 사용 subcellular neurobiological 프로세스의 전례 없는 분석 아직 여전히 이미징 연구에서 정량 데이터를 추출, 재현성, 공평 하 고 액세스할 수 있는 방법에 대 한 필요 . 우리 neurodegeneration의 초파리 모델을 사용 하 여 형광 기반 이미징 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. 특히, 피지/ImageJ를 사용 하 여 두 개의 세포 프로세스를 분석 하는 따라 하기 쉬운, 반자동 접근 설명: 첫째, 우리가 계량 단백질 집계 내용과 초파리 광 엽 돌연변이 형광 태그를 사용 하 여 프로 파일 huntingtin 단백질; 및 두 번째, 우리 autophagy의 탠덤 형광 기자의 부 량 비율 기반으로 초파리 비주얼 시스템에서 autophagy 리소좀 플럭스 평가. 중요 한 것은, 여기에 설명 된 프로토콜 선택 편견을 최소화 하 고 미묘한 비교의 해상도 높이기 위해 모든 형광 구조 분석 되도록 반자동된 세분화 단계를 포함 합니다. 이 방법은 다른 세포 생물학 구조의 분석을 위해 확장 될 수 있습니다 및 프로세스 연루 neurodegeneration, 배치할 puncta (스트레스과 립 및 시 냅 시스 복합물) 같은 막 도약 뿐만으로 구획 (미토 콘 드리 아와 막 밀매 vesicles)입니다. 아직 적응 참조 이미지 분석 및 정량화를 위한 분야에 걸쳐 안정성과 재현성을 촉진 및 궁극적으로 neurodegeneration의 기계적 이해를 향상 시킬 수이 방법을 표준화 하 고, 제공 한다.

번호, 지역, 및 초파리 광 엽에 붙일 태그가 돌연변이 체 Htt 집계의 강렬의 정량화
Huntington의 질병, RFP 태그 돌연변이 초파리 모델의 중앙 신 경계에 misfolded 단백질 집단을 조사 하는 병 적인 비 (UAS-RFP-hHttQ15) 또는 병 적인 확장 ( 인간의 Htt UAS-RFP-hHttQ138) 막 GFP (UAS-mCD8::GFP)11 팬 신경 드라이버 elav GAL4아래 공동 표현 했다. 여성 파리 일수로 (대) 후 2 일의 머리 해 부, 고정, 고 DAPI 프로토콜의 섹션 2에 따라 물. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 기름 침수 렌즈, 1.30 수 가늠 구멍 (NA), 픽셀 당 8...

단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

우리는 신경 퇴행의 초파리 모델에서 복잡하고 역동적인 세포 생물학적 과정을 추출하기 위해 형광 기반 이미징 연구에서 정량적 데이터를 추출하기 위해 이 방법을 개발했습니다. 이 기술의 주요 장점은 선택 편향을 최소화하고 샘플링 파워를 극대화하며 필드 전체에서 재현성을 달성하기 위한 적응형 반자동 이미지 분석 워크플로우입니다. 이 접근 방식은 신경 퇴행과 관련된 다른 단백질 반점 및 막 결합 구획의 분석을 위해 확장될 수 있으며, 이는 궁극적으로 신경 퇴행성 질환에 대한 기계론적 이해를 향상시킬 것입니다.실체 현미경으로 해부하는 동안 얇은 판을 그대로 유지하려면 두 개의 집게를 망막 아래로 밀어 넣고 눈 중앙을 부드럽게 찢어 망막을 제거합니다. 겸자를 얇은 판 표면과 평행하게 유지하면 얇은 판에 붙어 있는 남아 있는 망막 조직이 모두 당겨집니다. 각 그룹별로 3-5개의 뇌를 해부하고 뇌를 적절한 고정제가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 실온에서 15분 동안 부드럽게 흔들어 놓습니다.PBS와 Triton X-100 또는 PBTx로 15분간 3회 세척한 후, 마지막 세척 후 PBTx에 희석된 1차 관심 항체를 5% 일반 염소 혈청으로 교체하여 섭씨 4도의 분취액 믹서에서 하룻밤 배양합니다. 다음날 아침, PBTx로 15분씩 3회 세척하여 여분의 항체를 제거하고 PBTx에 5% 정상 염소 혈청과 함께 희석한 적절한 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 뇌를 배양합니다. 배양이 끝나면 시연된 대로 뇌를 세 번 세척하고 조직 샘플당 하나의 현미경 슬라이드 중앙에 있는 두 개의 투명 테이프 사이에 장착 매체 한 방울을 놓습니다.뇌를 장착 매체에 1-2분 동안 놓습니다. 조직이 투명해지면 피펫을 사용하여 양쪽에서 장착 매체를 조심스럽게 제거합니다. 얼룩진 조직을 이미지화하려면 새로운 장착 매체 한 방울을 뇌에 바르고 샘플을 커버 유리로 조심스럽게 오버레이합니다.덮개 유리 가장자리를 고무 시멘트로 밀봉하고 실온에서 20분 동안 슬라이드를 자연 건조합니다. 그런 다음 현미경에서 표본을 보고 형광 현미경의 이미지 검출기 컨트롤을 조정하여 표본의 가장 높은 동적 범위에서 가장 높은 신호 대 잡음비를 캡처합니다. 설정이 최적화되면 다른 그룹의 표본을 보고 설정이 실험 전반에 걸쳐 적절한지 확인합니다.그런 다음 첫 번째 표본을 이미지화할 수 있으며, 획득 매개변수 및 공간 보정과 같은 메타데이터를 보존할 수 있는 파일 형식으로 이미지를 저장할 수 있습니다. 이미지를 분석하고, 피지에서 이미지를 열고, Bio-formats Import Options 대화 상자에서 View Stack with Hyperstack을 선택한 다음 색상 모드를 Grayscale로 설정합니다. C 스크롤 바를 사용하여 채널을 보고 Z 스크롤 바를 사용하여 초점면을 통해 이동할 수 있도록 표본 전체에서 표준화된 관심 영역으로 사용할 수 있는 마커 채널을 기반으로 영역을 식별합니다.이미지 분석을 단순화하려면 채널과 초점 평면을 포함하는 새 이미지를 생성하고 이미지 및 복제를 선택합니다. 원하는 채널과 슬라이스를 설정하고 선택 영역을 반영하도록 파일 이름을 변경합니다. 이전에 결정된 선택 기준에 따라 선택 도구를 사용하여 표준화된 관심 영역을 수동으로 선택합니다.분석(Analyze), 도구(Tools), 관심 영역 관리자(Region of Interest Manager) 및 추가(Add)를 클릭하여 관심 영역을 관심 영역 관리자(Region of Interest Manager)에 추가합니다. 그런 다음 더 보기 및 저장을 클릭하고 관심 영역을 반영하도록 파일 이름을 지정합니다. 이미지를 사전 처리하려면 필터에서 처리를 클릭하고 적절한 필터를 선택합니다.여기서는 세그멘테이션 중에 관심 있는 구조를 감지하는 데 도움이 되도록 가장자리를 보존하면서 노이즈를 줄이는 필터 설정을 선택합니다. 피지에서 사전 처리된 이미지를 활성화한 상태에서 SCF, Labeling, and Interactive H_Watershed 클릭합니다. 제어판에서 Seed dynamics, Intensity threshold 및 Peak flooding을 조정하여 세분화를 최적화합니다.세분화 결과가 최적화되면 Export Regions(내보내기), Filters(마스크) 및 Export(내보내기)를 선택하여 유역 결과의 이진 이미지를 생성합니다. 저장된 표준화된 관심 영역을 엽니다. Region of Interest Manager(관심 영역 관리자)에서 관심 영역 식별자를 선택하여 특징 추출을 이미지의 표준화된 관심 영역으로 제한합니다.이진 유역 마스크에서 관심 영역이 활성화된 상태에서 분석, 입자 분석 및 관리자에 추가를 선택하여 피쳐를 추출하고 세분화 중에 묘사된 각 구조에 대한 입자 식별자를 관심 영역 관리자에 추가합니다. 그런 다음 추가된 입자를 저장하면서 식별자가 선택 취소되고 모든 입자가 zip 파일에 저장되도록 합니다. 이제 사전 처리된 원시 이미지를 열고 관심 구조를 캡처하는 데 사용되는 채널로 스크롤합니다.특징 추출에서 얻은 입자를 열고 관심 영역 관리자에서 모두 표시를 선택하여 각 입자의 윤곽을 이미지에 오버레이합니다. Analyze and Set Measurements를 클릭하고 적절한 실험 측정값을 설정합니다. 그런 다음 Region of Interest Manager(관심 영역 관리자)에서 Measure(측정)를 선택하고 컴파일 및 추가 계산을 위해 결과를 복사하여 적절한 스프레드시트 프로그램에 붙여넣습니다.초파리의 시신경을 통해 표준화된 초점면에서 반자동으로 분할된 RFP huntingtin 응집체의 수를 정량화하면 질병을 유발하는 Huntington Q138 확장에 의한 단백질 응집체 축적에서 비병원성 Huntington Q15 확장의 확산 발현이 나타납니다. Huntington Q138을 발현하는 5개의 서로 다른 광학 엽으로 구성된 표준화된 초점면에서 얻은 모든 응집체의 크기 및 강도 프로파일은 이 워크플로우의 견고성과 재현성을 보여줍니다. 이미지 획득 중 응집체가 과다 노출되는 경우, 응집체의 크기와 수를 정량화하는 것은 이상적인 노출로 캡처된 응집체와 비슷합니다.그러나 과다 노출된 응집체의 강도는 포화된 픽셀이 최대 강도 값을 나타내기 때문에 크기의 함수가 됩니다. 여러 자가포식 관련 또는 Atg8 양성 구조에 걸쳐 mCherry 및 GFP 강도를 시각화하면 두 형광단의 높은 강도가 자가포식소체를 나타내는 리포터의 차이를 알 수 있습니다. mCherry가 높고 GFP가 낮다는 것은 GFP가 이 산성 구획에서 담금질되기 때문에 리소좀과의 융합을 나타냅니다.마지막으로 mCherry가 낮다는 것은 리소좀 내의 분해를 반영합니다. 반자동으로 분할된 각 mCherry Atg8 양성 입자의 평균 형광단 강도에서 생성된 산점도는 사분면 분석을 통해 개별 단계로 분리할 수 있는 자가포식 리소좀 경로를 통한 플럭스를 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 이미지 분석 단계에서 사용자 정의 매개변수는 응용 프로그램에 따라 크게 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.따라서 표본 간의 일관성과 비교 가능성을 보장하기 위해 작업 흐름을 문서화하는 데 주의하십시오.

quantitative-cell-biology-neurodegeneration-drosophila-through

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

이 비디오는 유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. 뇌는 장착하기 전에 고정, 세척 및 페이딩 방지제로 처리됩니다. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처하고 정량화하여 돌연변이 단백질 응집체의 전달을 관찰합니다.

Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains (유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화)

초파리 널리 신경 퇴행을 연구하기위한 모델 시스템으로 사용된다. 이 프로토콜은, 뇌의 공포 형성에 의해 결정된 바와 같이, 정량 할 수있는 변성하는 방법을 설명한다. 또한 인해 하나의 샘플로 처리 및 절편 제어 및 실험 파리에 의해 실험 절차에 효과를 최소화 할 수 있습니다.

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기<em&gt; 초파리</em

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.

초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

이 프로토콜에서 초파리, 수지상 morphogenesis의 연구를 위해 사용 될 수 있는 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)의 정량 분석에 집중 한다.

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

이 절차의 목표는 Drosophila melanogaster를사용하여 신경 퇴행성 질환 모델에서 DLM 신경 근육 접합 (NMJs)의 구조적 무결성을 평가하기 위해 등쪽 세로 근육 (DLM) 조직을 해부하는 것입니다.

신경변성과 관련하여 성인 Drosophila에서 시냅스 퇴성을 시각화

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

이 연구는 참수, 고정, 동결 절제, 형광 염색, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 조직 처리를 위한 단순화된 프로토콜을 제시하며, 이는 공초점 및 다광자 이미징으로 확장될 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 해부에 필적하는 효능을 유지하며 고급 운동 기술의 필요성을 우회합니다. 정량적 이미지 분석은 광범위한 조사 잠재력을 제공합니다.

향상된 뇌 형광 염색 및 면역 염색을 위한 초파리 머리의 직접 동결 절편

학습하세요 형광 이미징을 활용한 Drosophila 신경퇴행성 질환 모델에서 단백질 응집체 정량 분석 방법을. ImageJ 기반 반자동화 워크플로우로 선택 편향을 최소화하고 재현성을 극대화하여 세포 생물학적 메커니즘을 심도 있게 이해할 수 있습니다.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

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