시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

이 기술의 주요 장점은 매우 간단하고 표준 장비만 필요하며 항체의 주요 장점인 특이성의 이점을 누릴 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 Michela Matteoli와 동료들에 의해 처음 도입되었으며 매우 효과적인 것으로 입증되었습니다. 나는 특정 단백질 코르도티가 활성 시냅스에 국한되어 있는지 여부를 테스트하기 위해 그것을 사용했습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 3일 동안 24웰 플레이트의 커버슬립에서 1차 해마 세포를 배양하여 이 절차를 시작합니다. 수조에서 환원된 혈청 배지, 세포 배양 배지 및 증류수를 섭씨 37도로 예열합니다. 멸균 작업 조건을 보장하기 위해 층류 후드 아래에서 작업하면서 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에서 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다.

먼저, 7.5마이크로리터의 2몰 염화칼슘과 각 내독소가 없는 DNA 4마이크로그램을 혼합합니다. 60ml 마이크로 원심분리기 튜브에 총 1.5마이크로리터의 부피에 도달하도록 물을 추가합니다. 이제 60마이크로리터의 트랜스펙션 완충액을 혼합물에 추가합니다.

최상의 결과를 얻으려면 DNA 혼합물을 와류에서 부드럽게 흔들면서 transfection buffer를 적반식으로 추가합니다. 생성된 transfection 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 부양 시간 동안 튜브를 흔들지 마십시오.

층류 후드 아래에서 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 별도의 용기에 보관 한 다음 즉시 각 웰에 500 마이크로 리터의 환원 혈청 배지를 추가합니다. 조절된 배지를 인큐베이터에 보관하십시오. transfection mix를 위한 20분의 배양 기간이 끝날 때까지 섭씨 37도 및 5%CO2에서 세포를 배양합니다.

그런 다음 여러 방울을 피펫팅하여 각 웰에 30마이크로리터의 transfection mix를 추가합니다. 튜브 바닥에 잔여물을 버리십시오. 모든 웰에 트랜스펙션 혼합물이 공급된 후, 24웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 배지에 트랜스펙션 혼합물이 분포되도록 합니다.

이제 섭씨 37도에서 60분 동안 우물을 배양하고 5%CO2를 사용합니다. 배양 후, 형질주입 혼합물을 제거 및 폐기하고 세포 배양 배지로 세포를 3회 세척합니다. 세척 단계가 중요합니다.

웰별로 제거 및 교체하여 각 웰에 매체가 없는 시간을 최소화합니다. 또한 매체를 부드럽게 추가해야 합니다. 세포를 세척하려면 각 웰에 1ml의 세포 배양 배지를 추가하고 실온에서 30초 동안 배양합니다.

그런 다음 750마이크로리터의 배지를 제거하고 같은 양의 새 배지를 추가합니다. 이 과정을 3회 반복한 후 세포 배양 배지를 제거 및 폐기하고 컨디셔닝된 배지 450마이크로리터를 웰별로 잘 첨가합니다. 이제 뉴런을 섭씨 37도, 5%CO2에서 DIV 10까지 인큐베이터에서 성숙시킵니다.

600마이크로리터의 1X 탈분극 완충액과 10밀리리터의 세포 배양 배지를 수조에서 섭씨 37도까지 예열합니다. 1X 탈분극 버퍼에 1마이크로리터의 마우스 Anti-Syt1 항체를 추가하고 10초 동안 와류를 치십시오. 세포에서 세포 배양 배지를 제거하고 폐기한 후 각 웰에 탈분극 항체 혼합물 200마이크로리터를 추가합니다.

인큐베이터에서 섭씨 37도, CO2 5%에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다. 탈분극 항체 혼합물을 제거 및 폐기하고 세포 배양 배지로 세포를 3회 세척합니다. 각 웰에 1ml의 세포 배양 배지를 추가하고 실온에서 30초 동안 배양합니다.

그런 다음 750마이크로리터의 배지를 제거하고 같은 양의 새 배지를 추가합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다. 다음으로, 세포 배양 배지를 제거 및 폐기하고 1X PBS에 300 마이크로 리터의 4 % PFA를 첨가합니다.

마지막으로, 섭씨 4도에서 20분 동안 배양한 후 1X PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 2차 형광단 결합 항체를 각 웰에 대한 200마이크로리터의 차단 완충액에 1 - 1,000의 희석으로 희석합니다. 배양된 뉴런과 함께 커버슬립을 포함하는 각 웰에서 1X PBS를 제거하고 폐기합니다.

각 웰에 200마이크로리터의 차단 완충액 항체 혼합물을 추가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다. 배양 후 1X PBS 1밀리리터로 5분 동안 세포를 세 번 세척합니다. 다음으로, 7마이크로리터의 임베딩 매체를 현미경 슬라이드에 떨어뜨립니다.

캐뉼라로 들어 올리고 집게로 잡아 24웰 플레이트에서 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립을 증류수에 담궈 PBS를 제거하고 한쪽 가장자리를 연조직에 대고 조심스럽게 건조시킵니다. 커버슬립을 임베딩 배지 액적 위로 뒤집어 세포를 운반하는 표면이 현미경 슬라이드를 향하도록 하여 세포를 임베딩 배지에 임

슬라이드를 후드 아래에서 1-2시간 동안 건조시키고 빛에 노출되지 않도록 덮습니다. 건조된 슬라이드를 섭씨 4도의 현미경 슬라이드 상자에 보관하십시오. 형광 표지된 2차 항체로 Syt1 항체를 면역표지한 후, 면역신호(immunosignal)를 사용하여 Syt1 흡수 정도를 최종적으로 정량화합니다.

반점 면역형광은 시야에서 Syt1 흡수 부위를 나타냅니다. 따라서 이 부위에는 실험 중에 재활용된 시냅스 소포가 포함되어 있습니다. Synaptophysin-mOrange 형광은 형질주입된 뉴런의 축삭돌기에 시냅스 소포가 축적되어 있음을 나타냅니다.

GFP-Rogdi 형광은 형질주입된 뉴런의 축삭돌기에 Rogdi가 축적되었음을 나타냅니다. 실험의 이 부분은 GFP-Rogdi와 Synaptophysin-mOrange의 광범위한 공동 국소화를 보여주며, 이는 GFP-Rogdi가 축삭돌기 내의 시냅스전 부위에 축적된다는 것을 시사합니다. 오버레이는 GFP-Rogdi 및 Synaptophysin-mOrange의 공동 축적 중 어느 것이 Syt1 항체 흡수 부위와 공동 국소화되는지를 보여줍니다.

화살표로 표시된 부위는 기능적 시냅스에서 재조합 로그디(Rogdi)와 재조합 시냅토피신(synaptophysin)의 축적을 나타냅니다. 이 프로토콜은 시냅스 잔류물 재활용 정도를 결정하는 기술적으로 간단한 방법을 보여줍니다. 이 방법은 특정 뉴런의 축삭돌기에서 시냅스전 신경 말단이 할당되는 위치와 관심 있는 재조합 또는 내인성 단백질이 이러한 말단에 축적되는지 여부와 같은 분자 및 세포 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 시냅스전 말단에서 시냅스 소포 재활용을 모니터링하기 위해 여러 가지 방법으로 사용되었습니다. 예를 들어, 적응 단백질에서 과발현된 후 뉴런에서 시냅스 소포 재활용을 결정하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 동물 또는 줄기 세포 유래 뉴런에서 얻은 뉴런