생물 학적 문화와 진딧물 nerii에 유전자 발현 측정 유지: 식물 곤충 상호 작용에 대 한 비-모델 시스템
2018년 8월 31일
진딧물 진딧물 nerii 벌레 가족 (Apocyanaceae)에 높은 방어 식물에 colonizes 고 식물 곤충 상호 작용을 공부 하는 수많은 기회를 제공 합니다. 문화, 그리고 생성 및 분자의 분석 및 진딧물의 유지 보수에 대 한 프로토콜의 시리즈 제시 하는 여기, 그리고 A. nerii에 대 한-omic 데이터.
이 방법은 진딧물 배양을 위한 일반적인 단계와 진딧물의 유전자 분석 단계를 설명합니다. 이러한 방법은 진딧물의 진화와 생태학, 그리고 진딧물 생물학의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 핵심 질문에 답하는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적으로 대부분의 진딧물 종에 적용할 수 있고 상대적으로 저렴한 비용으로 수행할 수 있다는 것입니다.
표준 묘목 트레이에 발아 혼합 토양을 채우고 토양이 우물 꼭대기에 도달하도록주의하십시오. 모든 우물이 채워지면 각 우물의 토양에 3cm 깊이의 구멍을 만들고 각 구멍에 씨앗을 하나씩 놓습니다. 씨앗을 덮고 있는 토양이 포화될 때까지 세포에 물을 주고 트레이를 온실에 놓고 매일에서 격일로 물을 주어 적당한 토양 수분 수준을 유지합니다.
묘목이 자라면 첫 번째 전체 잎 세트가 4 인치 원형 화분에 가장자리 아래 약 5cm까지 화분 용 흙을 채 웁니다. 화분 바닥에 닿을 만큼 깊은 토양에 전체를 만들고 성숙한 묘목을 손으로 부드럽게 퍼서 새 화분의 구멍 깊숙이 넣습니다. 그런 다음 묘목을 흙으로 덮고 묘목에 매일 물을 주어 적당한 토양 수분 수준을 유지합니다.
식물이 최소 3-4세트의 완전한 잎이 자랐고 키가 10cm 이상이면 식물에 원치 않는 해충이 있는지 수동으로 검사하고 입 피펫을 사용하여 수집된 단일 번식 필드 성충 진딧물을 첫 번째 식물의 잎에 조심스럽게 옮겨 iso-clonal line을 만듭니다. 모든 진딧물이 옮겨지면 맞춤형 컵 케이지로 식물을 단단히 덮고 진딧물에 감염된 식물을 통제된 환경 챔버에 놓습니다. 재고 개체군을 유지하려면 구강 피펫을 사용하여 매주 1-3마리의 2차 또는 3마리의 instar 유충과 1마리의 성인 노화 진딧물을 새로운 공장으로 안전하게 옮깁니다.
그리고 시연된 대로 배양을 위한 새로운 컵 케이지로 각 식물을 덮으십시오. 한 마리의 성충 진딧물에서 DNA를 추출하려면 액체 질소가 들어 있는 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥 근처에 진딧물을 놓고 유봉으로 진딧물을 갈아냅니다. 다음으로, 100마이크로리터의 용해 완충액을 미세 원심분리 튜브에 추가하고 샘플이 눈에 띄게 분해될 때까지 분쇄된 진딧물을 계속 분쇄합니다.
추가로 100마이크로리터의 용해 완충액으로 유봉을 씻고 지상 진딧물을 섭씨 65도에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 14마이크로리터의 에어뮬러 포타슘 아세테이트를 튜브에 넣고 뒤집어 혼합합니다. 얼음 위에서 30분 후 원심분리로 세포 파편을 수집하고 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
상층액에 200마이크로리터의 차가운 100% 분자 등급 에탄올을 넣고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 실온에서 15분 후 원심분리로 침전된 DNA를 채취하고 피펫으로 에탄올을 제거합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 차가운 70% 분자 등급 에탄올에 다시 부유시키고 두 번째 원심분리기 세척을 위해 튕깁니다.
그리고 펠릿을 200마이크로리터의 신선하고 차가운 100% 분자 등급 에탄올에 재현탁시킵니다. 세 번째 원심분리 후, 튜브를 티슈 페이퍼 위에 수평으로 놓고 5-10분 동안 공기 건조시킵니다. 그리고 DNA 펠릿을 80 마이크로 리터의 낮은 tris edta에 재현탁시킵니다.
그런 다음 분광 광도계에서 재현탁 DNA를 정량화하고 나머지 샘플을 섭씨 4도에서 보관합니다. 시연된 바와 같이 액체 질소에서 최대 5마리의 성체 진딧물을 분쇄한 후 샘플을 흄 후드로 옮기고 800마이크로리터의 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출 시약을 샘플 튜브에 추가합니다. 유봉으로 샘플을 균질화하고 실온에서 5분 동안 균질화합니다.
다음으로, 160마이크로리터의 클로로포름을 샘플에 첨가한 다음 손으로 15초 동안 격렬하게 흔듭니다. 그런 다음 실온에서 2-3분 동안 샘플을 배양하고 원심분리하여 추출된 RNA를 수집합니다. RNA를 침전시키기 위해 중간상을 방해하지 않고 수성상을 새로운 RNS free microcentrifuge tube로 옮기고 RNA에 400마이크로리터의 이소프로판올을 첨가합니다.
영하 20°C에서 10분 동안 배양한 후 원심분리를 통해 침전된 RNA를 수집합니다. 그런 다음 디에틸 피로카보네이트 처리된 물에 75% 에탄올 1ml를 넣어 샘플을 천천히 와류와 원심분리하여 샘플로 두 번 세척하여 페놀 오염 물질을 제거합니다. 두 번째 세척 후, 대부분 멸균 벤치에서 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조하고 RNA 펠릿을 30마이크로리터의 초순수에 부드러운 피펫팅으로 용해한 후 섭씨 55-60도에서 10-15분 동안 배양합니다.
씨앗은 계절에 따라 약 2주에서 4주가 걸리며 분갈이에 심을 수 있을 만큼 크게 자랍니다. 분갈이에 심은 묘목은 진딧물 배양을 위한 최적의 크기로 자라는 데 2-4주가 더 걸립니다. 성인 aye-near-ee-eye는 어두운 꼬리표로 구별되며 날개가 없거나 날개가 있을 수 있습니다.
발달 중인 날개 패드는 애벌레가 세 번째 instar에 도달할 때 보이게 됩니다. 단일 성인 aye-near-ee-eye는 DNA 마이크로리터당 약 100-200나노그램, RNA 마이크로리터당 150-300나노그램을 산출합니다. 그런 다음 다른 치료 조건에서 후보 유전자의 상대적 발현을 계산할 수 있습니다.
이 절차를 시도할 때 iso-clonal stock을 오염시키지 않는 것이 중요합니다. 또한 진딧물의 품질은 식물의 품질에 크게 좌우된다는 것을 기억하십시오. 이 절차에 따라 진딧물 생물학의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 질문에 답하기 위해 다른 추출 및 염기서열분석 기술을 수행할 수 있습니다.
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개요
Aphis nerii는 강력하게 방어하는 식물인 개망초과(Apocyanaceae) 식물에 서식하며, 식물-곤충 상호작용을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이 기사는 A. nerii의 식물 및 진딧물 배양 유지 프로토콜과 분자 데이터를 생성 및 분석하는 방법을 제시합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 식물-곤충 상호작용
- 진딧물 생물학
- 생태학 및 진화
배경
- Aphis nerii는 진딧물을 연구하는 모델 생물입니다.
- 식물 방어 및 진딧물 적응을 이해하는 것이 중요합니다.
- 프로토콜은 다양한 진딧물 종에 적용할 수 있습니다.
- 저렴한 방법은 연구자들의 접근성을 향상시킵니다.
연구 목적
- 진딧물 배양을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
- 진딧물의 유전자 분석을 용이하게 합니다.
- 진딧물 생물학의 기초가 되는 분자 메커니즘을 탐구합니다.
사용된 방법
- 발아 믹스 토양으로 묘 트레이를 채웁니다.
- 종자를 심고 토양 수분을 유지합니다.
- 최적의 성장을 위해 온실 조건을 이용합니다.
- 배양된 진딧물에 대한 유전자 분석을 실시합니다.
주요 결과
- A. nerii 배양의 성공적인 유지.
- 다양한 진딧물 종에 적용 가능한 프로토콜.
- 진딧물의 생태학적 역할에 대한 통찰력.
- 진딧물 생물학에 대한 향후 연구의 기초.
결론
- 설명된 방법은 진딧물 연구에 효과적입니다.
- 연구는 식물-곤충 역학 이해에 기여할 수 있습니다.
- 프로토콜은 생태학의 더 넓은 응용을 위해 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Robust maintenance of Aphis nerii cultures and quantitative gene expression analysis enable biopharma teams to interrogate plant-insect molecular interactions in non-model systems. These protocols support early discovery efforts by bridging ecological context with molecular readouts, enhancing predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The approach facilitates scalable, reproducible workflows for translational research on host adaptation and gene-environment interplay.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in plant-insect interactions.
- Supports biological de-risking by linking ecological phenotypes to molecular mechanisms.
- Facilitates functional target validation in non-model organisms lacking reference genomes.
- Provides a platform for comparative studies across genotypes and environmental conditions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream molecular assays.
- Standardizes culturing and extraction protocols to ensure reproducibility and scalability.
- Generates quantitative gene expression data for assay optimization and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of gene-environment interactions in controlled settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular outputs with ecologically relevant phenotypes for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by integrating organismal and molecular data.
- Provides a framework for biomarker discovery in plant-insect adaptation studies.
- Enhances predictive de-risking for targets influenced by environmental variables.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through assay development, supporting lead identification and translational research in plant-insect systems.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in non-model organisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides molecular and phenotypic measurements to support statistical evaluation of experimental conditions.
- Translational Research: Connects ecological context to molecular mechanisms for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers adaptable protocols for diverse aphid species and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes culturing and extraction workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by integrating ecological and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aphid culturing, molecular extraction, and quantitative gene expression analysis.
- Needs access to controlled environment chambers, molecular biology instrumentation, and analytical platforms.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility across experiments.
- Adaptable to various aphid species and host plant systems with minor modifications.
- Dependent on quality of plant and aphid stocks to ensure reliable molecular outputs.
