Name: 혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 학습하세요 포유류 세포의 혐기성 장기 배양 기법을 통해 세포 생리학과 암 치료 연구에 활용하는 방법을. 이 프로토콜은 17일까지 세포 생존이 가능하며 산소 오염 방지가 핵심입니다.

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저자는 그들의 지원에 대 한 연구의 중서부 대학 사무실 및 후원 프로그램을 감사합니다.

1. 다양 한 포유류 세포 라인의 혐 기성 문화에 대 한 미디어 준비
<ol><li>
무산 소 셀 문화25에 대 한 완전 한 PS 74656 매체를 확인 합니다.
	<ol>
<li>아 질산염 이온 증류수 50 ml에서의 17.25 g을 용 해 하 여 살 균 아 질산염 재고 솔루션 (5 M; 100 배)를 확인 한 다음 그것을 소독 필터.</li>
		<li>110 mg/l L-글루타민, 나트륨 pyruvate 그리고 10% 태아 둔감 한 혈 청의 584 mg/L의 낮은 포도 DMEM (1 g/L의 포도 당)의 50 mL 당 아 질산염 재고 솔루션의 0.5 mL을 추가 (FBS; 열 비활성화). 참고: FBS 농도 10%는 독성 보다 큰 사용 합니다. 메모의 한 암 세포 라인 테스트 아 질산염 (MDA-MB-231, 유 방 암 세포 선)와 미디어에 대 한 낮은 내성을 했 그리고, 따라서, 아 질산염의 부재에서 성장 했다. 또한, PS 74656 매체 지원 테스트 모든 셀 라인의 성장 (n = 9), 특정 셀 라인 (예를 들어, Vero 세포) 전시 높은 세포 농도 높은 포도 당 (4.5 g/L) DMEM과 PS-74656에서 더 높은 생존 능력 25.</li>
		<li>살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 매체의 20 mL를 배치 합니다. 모자; 강화 하지 마십시오 그것은 느슨하게 해야 합니다.</li>
		<li>진공 벨 항아리에 튜브를 삽입 하 여 탈 가스 매체는 약 45 ° 각도, 중간 영역을 최대화 하기 위해.</li>
		<li>실 온에서 진공 펌프 또는 해당을 사용 하 여 진공을 적용 합니다. 거품은 더 이상 (24-48 h) 관찰 때까지 진공을 유지 합니다.</li>
		<li>항아리에서 튜브를 제거 하 고 즉시 매체에 공기의 도입을 최소화 하기 위해 튜브 씰링 뚜껑을 닫습니다.</li>
		<li>상업적인 혐 기성 챔버에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>튜브 캡을 풉니다 하 고 적어도 24 h에 대 한 챔버에 혐 기성 가스 혼합물의 equilibrate를 튜브에 분위기를 허용 합니다. 참고: 매체 있어야 챔버에 때까지 그것 사용 합니다. 튜브 플러시 프로세스를 속도 대 한 살 균 전송 피 펫을 사용 하 여 무산 소 가스 혼합물과 적어도 3 배 H2, CO2, 그리고 N 구성 된 무산 소 가스로 가득 차2.
</li>
		<li>모든 튜브 (10-15 분) 튜브 씰링과 챔버에 배치 하기 전에 위에서 설명한 대로 혐 기성 챔버에 배치 드 사용 하기 전에, 1.5-2 mL 전송 펫을 사용 하 여 혐 기성 가스 혼합물으로 그것을 플러시 또는 무산 소를 플러시는 피 펫 팁 가스 적어도 3 배.</li>
		<li>혐 기성 챔버에 살 균 degassed 마이크로 원심 관에 매체의 100 µ L을 제거 하 고 산소 프로브를 사용 하 여 챔버 내에 용 존된 산소에 대 한 테스트. 참고: 산소 전극은 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜 사전 당 보정 됩니다. 제대로 degassed equilibrated 혐 기성 가스 혼합 미디어의 수치는 0입니다. 주의: 수치는 산소의 0.3 ppm 이상, 계속 equilibrate 매체에 더 많은 시간 필요 이므로 혐 기성 챔버에 미디어를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 무산 소 재배 다양 한 포유류 세포 라인의
<ol><li>
지정 된 날-1
	<ol>
<li>T150 플라스 크에 세 24-잘 접시 (80% 합류)에 대 한 세포의 충분 한 번호를 제공 하는 무산 소 및 normoxic 문화 컨트롤에 대 한 90% 합류 (37 ° C, 5% CO2) 세포를 성장. 참고:이 연구를 위해 헬러 229과 Vero 세포 사용 되었다. 이 프로토콜은 또한 테스트 하 고 성장 및 7 다른 셀 라인25의 유지 보수에 대 한 성공을 증명 했다.</li>
		<li>포부에 의해 플라스 크에서 매체를 제거 하 고 HBSS의 10 mL와 함께 그것을 씻어.</li>
		<li>5 mL의 트립 신 매체를 바꿉니다. 셀은 시각적으로 플라스틱에서 분리 될 때까지 플라스 크를 교 반 하십시오. 트립 신의 대부분 발음 다음 꺼내 부착 세포를 플라스 크를 누릅니다. 높은 포도 DMEM의 10-15 mL을 추가 (4.5 g/L의 포도 당, L-글루타민, 10%의 110 mg/L FBS, gentamicin의 50 µ g/mL) 비활성화는 트립 신을.</li>
		<li>모든 세포 덩어리는 중단 될 때까지 25 mL 피 펫을 사용 하 여 셀 triturate</li>
		<li>셀을 계산 하 고 표준 hemocytometer 고 trypan blue 염료 제외 방법 또는 자동된에 해당 하는 사용 하 여 생존을 결정 합니다.</li>
		<li>105 셀/mL x 2.24의 셀 밀도를 위에서 언급 한 대로 높은 포도 당 DMEM 셀을 일시 중단 합니다.</li>
		<li>24-잘 조직 배양 접시의 우물에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 (105 셀/잘 x 2.24; 80% 합류). 무산 소 문화와 다른 제어 normoxic 문화에 대 한 종자 1 접시.</li>
		<li>24 h에 대 한 normoxic 조건 (5% CO2) 37 ° C에서 세포를 품 어. 참고: 셀 다양 한 잘 크기의 접시에 도금 될 수 있다. 그러나, 플라스 크에서 무산 소 성장에 대 한 셀을 시드 위험을 실행 산소의 소개의 시스템으로, 치료 대기 가스를 플러시 완전히 행사 하지 않는 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
지정된 일 0
	<ol>
<li>Normoxic 외피의 24 h 후 혐 기성 챔버 (상업 혐 기성 챔버;에 무산 소 성장에 대 한 번호판을 배치 그림 1)입니다.</li>
		<li>즉시 항생제 무료 드 기름된 PS 74656 매체는 혐 기성 챔버를 24 h에 대 한 acclimated 되었습니다 매체를 변경 합니다. 젖은 수건으로 컨테이너에 접시를 놓고 느슨하게 수 분을 유지 하기 위해 그것을 닫습니다. 참고: normoxic 성장 위한 접시는 동일 하 게 모든 치료 대기 조건 하에서 행해진다 예외 처리 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
지정된 일 1
	<ol>
<li>혐 기성 배양의 1 일 10% H2, 10%의 CO2, 그리고 80% N2의 표준 혐 기성 가스 혼합물을 포함 하는 상업 혐 기성 챔버에 외피의 24 시간 후 시작 합니다.</li>
		<li>다양 한 기간에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>시간이 지남에 따라 색 변경에 대 한 혐 기성 매체를 모니터링 합니다. 참고: 마젠타 레드-오렌지에서 색상 변화 신호 매체를 변경 하는 시간. 이 발생 2 주까지 걸릴 수 있습니다. 노랑 빨강 주황색에서 매체에 색상 변화 세균 오염 물질의 존재를 나타냅니다.</li>
		<li>매체 마젠타 레드에서 변경 때 포부에 의해 runagate 셀을 제거 합니다.</li>
		<li>장소 degassed 혐 기성 가스에서 runagate 셀 aspirated 보냈다 미디어 equilibrated microfuge 관, 인감, 안전 하 고 그들 (326 gx; 10 분 동안 실내 온도에) 원심 튜브 닫습니다. 즉시 우물에 있는 발음된 미디어를 바꿉니다 새로운 degassed PS 74656 매체의 1 mL.</li>
		<li>그것을 열기 전에 혐 기성 챔버에 수송과 셀 microfuge 관을 넣습니다. 보낸된 중간 발음 하 고 신선한 degassed PS 74656 매체 microfuge 관에 1 ml의 총 볼륨을 바꿉니다.</li>
		<li>튜브에서 24-잘 조직 문화 접시에 잘 셀을 반환 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Anaerobically 배양된 세포의 현미경에 의해 Phenotypic 세포 분화의 평가
<ol><li>
혐 기성 챔버에 접시 혐 기성 가스 혼합물으로 플러시 resealable 상자에 놓고 상자를 닫습니다. 참고: 상자 습기를 제공 하 고 밖으로 건조에서 접시를 방지 젖은 종이 타월을 포함 해야 합니다. 이후 그들은 얇은 현미경 검사 법, 샌드위치 가방 최고 작동.<ol>
<li>현미경 세포 관찰, 완전히 가방을 봉인 하 고 상공에서 그것을 제거 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 접시 위에 비닐 봉투를 스트레칭, 카메라 부착으로 거꾸로 단계 대조 현미경을 사용 하 여 셀을 검토 하 고 다양 한 배율에서 photomicrographs를 받아.</li>
		<li>실로, 봉인된 봉투에 접시를 반환 하 고는 인큐베이션 단계 2.3.3에서에서 설명한 대로 계속.</li>
		<li>별도로 runagate 세포 현 탁 액에 있는 분석, 2.3.5 단계에서 설명 하는 단계를 따릅니다. 참고: 이러한 셀 에어로빅 테스트에 사용할 수 있습니다 또는이 특정 인구의 테스트에 대 한 혐 기성 챔버에 반환 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 메서드는 산소의 부재에서 시간의 연장된 기간에 대 한 교양 했다 처음 포유류 세포를 나타냅니다. 현재 관측을 바탕으로는 무산 소 성장 기능을 통해 비 발효 통로 나타납니다 포유류 세포 라인28, 사이 보편적인 혐 기성 성장 형 분기에서 결과. 이 테스트는 모든 셀 라인에 대 한 관찰 되었다. 혐 기성 경작 셀의 비율을 증가 되었다 둥근, 서 스 펜 션 같은 인구 개발과 복제할 수 있었다. 2 차 전지 타입 기판;에 연결 된 남아 그러나, 세포 형태학 스핀 들 (수지상) 모양에 복귀 했다. 이러한 연구 결과 분석 및 무산 소 조직 배양 재배에 관하여 관측에서 일반적인 오류를 지적 한다. 그것은 일반적으로 그 때 normoxic 조건 (5% CO2)에서 성장 하는 포유류 세포 모아 분리, 그들은 죽어가 고 있다 허용. 반대로 세포 성장, 어떤 경우에, 산소의 부재에서 반올림 해야 하는 셀에 대 한 정확 하 게 표시 되며 분리, 단순히 형태학 상으로 분...

고체 종양, 줄기 세포 벽 감, 안 감 점 막 표면 세포 anoxia1,2,,34를 포함 하 여 감소 산소 수준, 경험 하는 환경에 존재 한다. 정상 생리 상태에서 산소 anoxia (산소의 완전 한 부재)5,6산소 보다 다릅니다. 대기 산소는 포유류 세포 복제에 부정적인 영향을 미치는 그 체 외에서 세포 성장이 고갈된 산소 조건에서 최적화 될 수 있습니다 실현 1970 년대 초반에 보고 되었다. 리히터 외. 7 1-3% 산소 수준 (hypoxia)의 대기 산소 (20%) 도금 효율 향상을 보여주었다. 인간 2 중 세포 수명 또한 hypoxic 문화 조건8에 확장 됩니다.
Vivo에서, hypoxic 조건이 발생할 때 산소 매장 고갈 (예를 들어를 강렬한 운동 동안)와 함께 발효 (혐 기성 호흡) 호 기성 호흡에서 골격 근육에 ATP 생산은 전환 하는 점에서 젖 산9의 최종 제품. 병 적, 암 종양, 내부에에서는 종양의 질량은 산소 가난한 vascularization 인해 무산 소를10. 종양 내부에 제한 된 관류의 효과 독립적으로 유효성을 검사 하지 종양 인테리어 의무 anaerobes1에 의해 식민지에 의해. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 1 알파 유전자의 표현에 전적으로 종속 hypoxia에서 종양 세포 생존은 생각 하는 mechanistically, (HIF1-알파), 산소4,11 초기 자발적인 응답은 , 12. HIF1-알파 hypoxic 조건 하에서 HIF1를 바인딩할 열 충격 단백질에 의해 유도 된다-알파 발기인 및 upregulate 유전자 전사12. 이 열 충격 단백질 종양 hypoxic microenvironment에서 본 다양 한 고기의 유도에 도움으로 추정 된다. 이 고기 세포 막 포도 당 운송업의 증가 표현과 분해 (바르 부르 크 효과)13의 속도 전시 한다. 결과 발효 젖이 나올를 미토 콘 드 리아 산화 인 산화에서 스위치입니다.
무산 소 생존 또한 대안 생존 현상14,15를 지원 하기 위해 포도 당을 활용할 수 있습니다. 최고의 공부 포유류입니다 두더지 쥐과 당 구동 glycolytic 발효 통로14통해 산소 없이 거의 20 분 동안 살아남을 수 있습니다. 특정 생선에 발생 하는 다른 적응 (예를 들어, 훨씬 더 이상 살아남을 수 있는 잉어 [떡 sp.], 기간 터미널 부산물로 에탄올 분해를 사용 하 여)15. 두 경우 모두, 발효 드라이브 활성화 산소의 부재에서 생존 하는 대사. 무산 소 생존에 대 한 현재 가설은 오랫동안으로 HIF1-알파16혐 기성 조건 발생 하는 산소에 대 한 필요 없이 hypoxia, 미토 콘 드리 아 호흡 하는 동안 활성화 됩니다. 또한, 그것은 가정 하는 hypoxic/무산 소 생존을 위한 발효 경로 사용 하 여 셀 셀 생존17에 해로운 증명할 수 있는 산화 스트레스 방지 이후 종양 생존을 향상. 이 공준 cardiomyocytes에서 hypoxia 종양 세포17에 배치 하는 산화 스트레스 감소를 보여주는 최근 연구에 의해 지원 됩니다.
날짜 하려면, 무산 소 포유류 세포 생존에 대 한 발효 통로의 본질은 되었습니다에 배어 든 문학, 인해, 3 일 이상 산소의 완전 한 부재에 문화 포유류 세포의 무 능력에 큰 부분에서. 그러나, 혐 기성 생존을 위한 분해 대신 박테리아에서 발생합니다. 특정 박테리아에 질소 또는 황산 (다른 화합물) 중 산소18시 토 크롬 산화 효소 시스템 부재에 대 한 터미널 전자 수락자로 사용할 수 있습니다. 세균과 진 핵 진화 마지막 보편적인 일반적인 조상에서 분기 이후 병렬로 발생, 비록 미토 콘 드리 아 1.542 백만 년 전에 바다19의 산소 세포에 에너지를 제공 했다 추정 된다 . 연구원은 고립 된 미토 콘 드리 아 터미널 전자 수락자로 아 질산염으로 산소의 부재에서 ATP를 생성할 수 있다 나타났습니다 그것 이므로 세포 산소의 부재에 3 일 이상 기간에 대 한 기능 수를 가정 하는 합리적 20 , 21 , 22 , 23.이 연구에서 설명 하는 방법론은 수많은 셀 라인의 혐 기성 포유류 세포 성장에 대 한 유틸리티.

<table><tbody><tr><td>Whitney A35 혐기성 챔버</td><td>Don Whitley Scientific&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td>챔버 전면을 제거할 수 있는 기능을 사용하면 포털을 통해 기기를 가져갈 걱정 없이 내부에 기기를 쉽게 넣을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 후드</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr><tr><td>피펫 에이드</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>멸균 이송 피펫</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50cc 멸균 원추형 원심분리기 튜브</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>진공 용기</td><td>Nalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고혈당(4.5g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 저혈당(1g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크(T75 또는 T150)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 조직 배양 처리 접시</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>글래드 지플락 샌드위치 백</td><td>Ziploc</td><td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>역상 현미경(카메라 몽이 있는 10, 20 40x 대물렌즈)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin 마이크로타이터 피펫</td><td>Mettler Toledo</td><td>Rainin Classic 피펫 PR-100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로타이터 팁</td><td>Santa Cruz 생명공학</td><td>sc-213233 & sc-201717&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>시험관 랙 (50cc 튜브)</td><td>Lab Depot</td><td>HS29050A</td><td></td></tr><tr><td>아질산 나트륨</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US</td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이있는 투명 상자</td><td>Rosti Mepal</td><td>고무 메이드</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>집</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>집에서 70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브 멸균</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-200273</td><td></td></tr><tr><td>홀더가있는 생물학적 위험 가방 (데스크탑)</td> <td>Heathrow Scientific</td><td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>VWR</td><td>89428</td><td></td></tr><tr><td>산소 전극</td><td>eDAQ</td>, <td>EPO354</td><td></td></tr>, <tr><td>pH 측정기</td>, <td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr>, <tr><td>pH 종이/ pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

대부분 점 막 표면 종양에 줄기 세포 벽 중간점 함께 무산 소는 신체의 지리적 영역이 있습니다. 이전 연구 결과 부 화 normoxic (5% CO2 공기에서)에 또는 hypoxic (낮은 산소 수준) 조건 제한 가능성 (2-3 일)에 무산 소 인큐베이션 (자유로운 산소의 부재) 결과 옵니다. 새로운 방법론은 (적어도 17 일, 최대 시간 테스트)에 대 한 무산 소 세포 배양을 가능 하 게 개발 되었다. 이 방법론의 가장 중요 한 측면 산소 시스템에 도입 하는 것입니다. 이 기체 제거 미디어, 그리고 세 정 튜브, 요리, 플라스 크, 및 혐 기성 가스 혼합물 (H2, CO2, N2)와 함께 펫 자료 무산 소 (산소) 환경에 equilibrate를 허용 하 여 뒤에 의해 얻어진 다 이전에 사용. 현미경 얻은 아티팩트를 포함 하지 않도록 하려면 photomicrographs 인수 하는 경우 추가 관리를 행사 해야 합니다. 산소의 부재에서 셀 형태학 크게 변경 됩니다. 두 가지 morphotypes anaerobically 성장 하는 모든 셀에 대 한 설명 되어 있습니다. 성장 하 고 산소의 부재에 포유류 세포를 유지 하는 능력의 세포 생리학, polymicrobial 상호 작용, 그리고 소설 암 약물 개발에 대 한 생 합성 통로의 특성 분석에 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜의 강점 장 수 및 여러 셀 라인의 성장 지원 및 깊은 변경 및 셀 형태학25에서 분기는 인식입니다. 이 연구의 가장 중요 한 요소는 전송 및 엄격한 anaerobiosis 아래 세포의 유지 보수입니다. 이 혐 기성 챔버를 프로토콜 (그림 1)을 극대화 하기 위해 조직과 셀 현미경 또는 다른 테스트에 대 한 제거 하는 보증 된 환경에서 보관 해야 합니다. 날짜 하려면, 무산 소 생존의 범위 15-17 일 불멸의 암에 대 한 셀 라인 이었고 최대 17 일 변형 셀 라인 (무산 소 성장에 대 한 검사는 9 셀 라인). 실행 가능한 세포의 수준 무산 소 조건이 셀이 이동 되 면 전에 그들이 안정 90%, 최대 10% 이상 떨어졌다. 모든 셀 라인 듀얼 고기 되 돌 (곁에 runagate) 시간이 지남에 따라 증가 하는 정지에 셀의 비율으로. 몇 주 연장된 보육, 후에 일...

여기, 우리는 설립된 셀 라인의 혐 기성 장기 재배를 가능 하 게 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 테스트는 최대의 생존 시간은 17 일 이다. 이 메서드는 세포 독성 대리인의 테스트 및 anoxically 세포 복제의 생리학 탐험에 적합 합니다.

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

이 방법은 무산소 세포의 생리학적 특성을 규명하는 데 사용할 수 있으며, 숙주-병원체 상호작용, 줄기세포 분화, 암세포 전이 및 치료 민감성과 관련된 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이는 포유류 세포의 장기 무산소 배양을 가능하게 하는 최초로 기술된 프로토콜입니다. 산소 독성으로 인해 여러 세포 유형이 성장을 위해 저산소 환경을 선호하므로, 이 기술의 영향은 표적 맞춤형 암 치료 및 회춘 요법까지 확대될 수 있습니다.이 방법은 세포의 혐기성 호흡 및 대사에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 줄기세포 배양과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 산소 오염을 방지하기 위해 극도로 세심한 주의를 기울여야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 산소 오염을 차단하는 데 필요한 주의 사항은 직관적이지 않으므로, 이 방법의 물리적인 시연이 매우 중요합니다.먼저, L-glutamine, sodium pyruvate 및 fetal bovine serum이 포함된 저포도당 DMEM에 0.5 milliliters의 nitrite stock solution을 첨가합니다. 그 다음, 해당 배지 20 milliliters를 멸균된 50 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 이어서, 튜브를 45도 각도로 진공 벨 자(vacuum bell jar)에 넣어 배지를 탈기합니다.진공 펌프를 사용하여 실온에서 진공을 가합니다. 기포가 더 이상 관찰되지 않을 때까지 24~48시간 동안 진공 상태를 유지합니다. 벨 자(bell jar)에서 튜브를 꺼낸 후, 배지로 공기가 유입되는 것을 최소화하기 위해 즉시 캡을 닫습니다.그 다음 튜브를 준비된 혐기성 챔버에 24시간 동안 두고 캡을 느슨하게 조입니다. 튜브가 챔버 안에 있는 동안, 배지 100 µL를 멸균된 탈기 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 산소 프로브를 사용하여 튜브의 용존 산소량을 측정합니다.먼저, T150 플라스크에서 세포를 90% 합쳐질 때까지 배양합니다. 흡입법으로 플라스크에서 배지를 제거하고 10 milliliters의 HBSS로 플라스크를 세척합니다. 그다음, 제거한 HBSS 대신 5 milliliters의 trypsin을 넣고 세포가 플라스틱에서 떨어져 나올 때까지 플라스크를 흔들어 줍니다.플라스크에서 트립신의 대부분을 흡입하여 제거하고, 플라스크를 톡톡 쳐서 부착된 세포들을 떼어냅니다. 그 다음, 트립신

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

체외 시스템에 수정 3 - D는 재구성 지하 막 여러 종양 세포 라인의 성장 특성 전이성 보조 사이트에서 종양 세포의 휴지 또는 proliferative 행위와 연관있는...

체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

여기에서 우리는 시험 관내에서 Homalodisca vitripennis 세포와 HoCV-1을 전파하는 프로토콜을 제시한다. 중간 HoCV - 한 긍정적 인 문화에서 제거하고 RNA는 168 시간 동안 매 24 시간을 추출 하였다. 세포 생존은 트리 판 블루 염색에 의해 정량 하였다. 전체 바이러스 입자는 감염 후를 추출 하였다. 추출 된 RNA는 QRT-PCR에 의해 정량 하였다.

의 전파<em&gt; Homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em&gt;를 통해<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; 세포 배양

공압 바이오리액터를 사용하여 포유류 세포의 성장을 위한 이 일회용 바이오리액터 시스템의 조립, 작동 및 성능을 시연합니다.

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

지속적인 성장 조절 공급을 사용한 영양소 조절은 교반 현탁 생물 반응기에서 배양에 대한 간헐적 배치 공급에 비해 포유류 세포 스페로이드의 성장 속도를 향상시킵니다.  이 연구는 간단한 조정된 비율 공급 배양을 설정하는 데 필요한 방법을 보여줍니다.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

배양 된 일차 또는 확립 된 세포 주는 일반적으로 동물 모델을 사용 하기 전에 초기 접근법으로 서 근본적인 생물학적 및 기계적 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 아연 (Zn) 및 원자 흡 광도 분광학이 있는 다른 미 량 원소 연구를 위해 전체 세포 추출 물과 세포 분 획을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학

여기서, 우리는 시험관 내 유방동체재생정량분석법의 결과의 이행 및 해석을 설명한다.

뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신의 정량화

골격근은 상주 줄기세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각 세포 유형은 근육 항상성과 재생에 특별한 기여를 합니다. 여기에서는 근육 줄기 세포의 2D 배양과 생리학적, in vivo 및 환경적 특성의 많은 부분을 보존하는 ex vivo 환경에서의 근육 세포 틈새에 대해 설명합니다.

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

이 프로토콜은 이중층 미세유체 칩을 제작하고 급격한 산소 진동에서 미생물 성장을 분석하는 방법을 제시합니다. 이 장치의 성능은 유체 채널에서의 산소 감지와 미생물 배양을 통해 검증되었습니다.

Microfluidic Double-layer Device를 사용한 미생물 단일 세포 성장 분석에서 빠른 산소 진동 생성

우리는 밀리유체 연속 배양 장치(MCCD)에 대한 프로토콜을 제시하는데, 이는 수백 나노몰 농도까지 지속된 저영양 조건이나 시간적 영양분 변동 조건에서 세균 집단을 미세한 시간 척도로 배양할 수 있게 합니다.

영양소가 낮고 변동하는 상태에서 대 장 균 연구를 위한 연속 배양 밀리플루이딕 장치

학습하세요 포유류 세포의 혐기성 장기 배양 기법을 통해 세포 생리학과 암 치료 연구에 활용하는 방법을. 이 프로토콜은 17일까지 세포 생존이 가능하며 산소 오염 방지가 핵심입니다.

혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수

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