Name: 하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 배우세요 drop-off ddPCR 기술을 사용하여 액체 생검에서 순환 종양 DNA의 다중 돌연변이를 동시에 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 KRAS 및 EGFR 유전자 변이 분석에 활용되며 정량적 암 진단에 필수적입니다.

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이 작품은 인 퀴리 SiRIC (그랜트 잉카-DGOS-4654)에 의해 지원 되었다. 저자 또한 비디오에 그녀의 기여에 대 한 캐롤라인 Hego을 감사 하고자 합니다.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
<li>Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li>
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<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
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<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
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<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

몇몇 저자는 ctDNA 검출 관련 2 개의 특허 출원 (EP17305920.5, EP18305277.8)의 발명가 이름이 지정 됩니다.

효율적인 감소 ddPCR 분석 결과, 디자인에 최적화는 중요 한, 그리고 프로토콜을 신중 하 게 따라야 합니다. 뇌관 및 프로브 각 조합의 고유 PCR 반응 효율이 있다. 따라서, 개별 분석 결과 신중 하 게 유효성을 검사할 컨트롤 샘플에 귀중 한 테스트 샘플에 사용 되 고 있다. 최적화 및 유효성 검사 증명 피크 신호 검출 및 특이성 및 감도 평가에 중요 하다. 프로토콜에 설명 된 대로 모든 돌연변이 "프로브 2"에 의해 보호 대상 지역에 있는 잠재적으로 심문 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 유효성 검사 것이 좋습니다 "프로브 2", 5' 또는 3' 끝에 있는 돌연변이 때문에 이러한 이탈 분석 결과의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.
여기에 제시 된 방법 FFPE 직물, 문화 또는 혈액 샘플에 있는 셀을 포함 하 여 "조직"의 모든 종류에서 추출 된 DNA와 함께 수행할 수 있습니다. 그러나, 핵 산 추출의 품질 ddPCR 결과 영향을 크게 수 있습니다. 헤 파 린, 단...

암 개발에 관련 된 체세포 돌연변이의 수천 보고 된1되었습니다. 이 중, 몇 가지 예측 마커 타겟된 치료 2,3 의 효능 이며 상영이 돌연변이의 유전은 이제 일상적인 임상 연습. 드롭릿 디지털 PCR (ddPCR) 기술은 높은 검색 정확도로 유무의 변이 대 한 모니터링에 사용할 수 고 매우 비 침략 적 액체 biopsies4,5와 호환 합니다. 그러나, 현재 ddPCR 분석 실험은 주로 선험적으로알려진 돌연변이 감지 하도록 설계 되었습니다. 이 심각 하 게 돌연변이 알 수 없는 경우 검색 도구로 ddPCR 사용 하 여를 제한 합니다. 실제로, 기존의 ddPCR 디자인, 야생 형 대립 유전자 (WT 프로브)를 인식 하는 가수분해 프로브 인식 하는 돌연변이 체 대립 유전자 (MUT 프로브) (그림 1A) 특정 조사와 경쟁 한다. 높은 선호도 조사 서식 파일을 hybridizes 하 고 해당 대립 유전자의 성격을 나타내는 그것의 fluorophore를 해제 합니다. 각 작은 물방울에 대 한 얻은 형광 데이터 WT 및 MUT 프로브 다른 차원에 의해 방출 하는 형광을 나타내는 산 점도에 구상 될 수 있다. 기존의 ddPCR 분석 결과 대 한 일반적인 결과의 도식 표현 그림 1A에 제공 됩니다. 이 예제에서는 블루 클라우드 빨간 구름 방울 있는 MUT 대립 유전자 증폭 되었고 MUT 프로브에 의해 식별에 해당 하는 반면 WT 프로브로 식별 하는 WT 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 반응에서 로드 하는 DNA의 양에 따라서 WT와 MUT amplicons 포함 된 더블 긍정적인 방울 (녹색 구름) 나타날 수 있습니다. 빛 회색 구름 빈 물방울에 해당합니다.
대부분의 플랫폼 fluorophores (보통 2, 최대 5만)의 제한 된 수의 검출에 대 한 허용, 기존의 ddPCR의 처리량 제한 됩니다. 따라서, 여러 개의 인접 한 돌연변이와 영역을 대상으로 기술적으로 도전적인 멀티플렉스 ddPCR 분석 실험 또는 동시에 각 돌연변이 대상으로 하는 여러 반응의 사용의 디자인을 필요 합니다. 그것은 잠재적으로 독특한 WT 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 대상 지역 내에서 어떤 유전 변경 감지 수 있습니다 드롭 ddPCR 전략이이 제한 극복. 첫 번째 프로브 (Probe 1) 커버 비 변수 시퀀스, 대상 지역 및 두 번째 프로브 (Probe 2)은 돌연변이 대상 영역의 WT 시퀀스에 보완 예정 (그림 1B). 첫번째 조사 반응에 amplifiable 분자의 총 금액을 단정, 하는 동안 두 번째 프로브 WT 및 MUT 대립 유전자 돌연변이 시퀀스에 최적의 교 잡에 의해 차별. 프로브 2 대상 지역 (단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드 대체, 삭제, 등)6에 돌연변이의 여러 종류를 식별할 수 있습니다. 기존의 ddPCR에서 빛 회색 구름 없는 DNA 분자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 이 유형의 분석 결과에 WT MUT 구름의 최적의 분리는 DNA WT와 MUT 대상 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울만 WT를 포함 하는 작은 물방울에서 구분할 수 없습니다 이후 반응, 로드의 수량에 따라 기억 하는 것이 중요 하다 양식입니다. 따라서,이 분석 결과 대부분 물방울 타겟된 유전자의 둘 이상의 복사본을 포함 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>K2EDTA 튜브 (색상 코드 : 라벤더)</td><td>BD</td><td>367863</td><td>EDTA 튜브는 전혈 또는 EDTA 혈장 샘플을 얻는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (수동 프로토콜)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>인간 플라즈마에서 자유 순환 DNA 분리용</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (자동 프로토콜)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>인간 플라즈마에서 자유 순환 DNA를 분리하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>QIAsymphony SP 시스템</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>cfDNA, DNA 또는 RNA 정제를 위한 완전 통합 및 자동화 시스템</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>최대 24개의 cfDNA를 동시에 정제하기 위한</td></tr><tr><td>Qubit 형광측정기</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td> Qubit 형광측정기는 DNA QX100 또는 QX200 리더 Bio-Rad<td>의 정량을 위한 벤치탑 형광측정기입니다</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td>186-3003 또는 186-4003, 각각</td><td>판독기는 각 액적의 형광 강도를 측정하고 액적이 검출기를 통과할 때 크기와 모양을 감지합니다</td></tr><tr><td>QX100 또는 QX200 액적 발생기</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 또는 186-4002, 각각</td><td>액적 생성에 사용되는 기기</td></tr><tr><td>C1000 열 순환기</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>모듈식 열 순환기 플랫폼, C1000 Touch 열 순환기 섀시, 96-웰 빠른 반응 모듈</td></tr><tr><td>플레이트 실러</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; PCR 플레이트 실러</td></tr><tr><td>DG8 카트리지 홀더</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>액적 생성용 기기에 DG8 카트리지를 배치하고 고정</td></tr><tr><td>합니다 액적 발생기 카트리지 및 개스킷</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>샘플과 오일을 혼합하여 액적을 생성하는 데 사용되는 미세유체 DG8 카트리지; DG8 개스킷은 카트리지를 밀봉하여 증발을 방지하고 액적 형성에 필요한 압력을 가합니다</td></tr>: <tr><td>PCR 슈퍼믹스</td>, <td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td>, <td>프로브용 ddPCR 슈퍼믹스(dUTP 없음),</td></tr> <tr><td>96웰 PCR 플레이트</td>, <td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>96웰 세미 스커트 플레이트</td></tr><tr><td>, 호일 씰</td>, <td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td>, <td>피어싱 포일 열 밀봉</td></tr>, <tr><td>ddPCR 액적 리더 오일</td>, <td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>프로브용 액적 생성 오일</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>액적 생성용 오일</td></tr><tr><td>DNA loBind 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Eppendorf LoBind Tubes는 시료와 표면의 결합을 크게 줄여 시료 회수</td></tr>율을 극대화합니다. <tr><td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Multiplex I cfDNA Reference Standards는 체세포 돌연변이를 검출하는 cfDNA assay의 성능을 평가하는 데 사용되는 고도로 특성화된 생물학적으로 관련성이 높은 reference material</td></tr>입니다 <tr><td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>HS assay는 RNA를 통한 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 대해 매우 선택적이며 10pg/&micro의 초기 샘플 농도에 대해 정확하도록 설계되었습니다. L - 100 ng/&마이크로; L</td></tr><tr><td>큐비트 어세이 튜브</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>큐비트 어세이 튜브는 500 &마이크로입니다. Qubit 형광측정기와 함께 사용하기 위한 L 얇은 벽의 폴리프로필렌 튜브</td></tr></tbody></table>

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

드롭릿 디지털 연쇄 반응 (ddPCR)은 나노 크기의 물에서 기름 개별 반응의 수천에 샘플 분류에 따라 매우 민감한 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법. 최근에, ddPCR는 순환 종양 DNA (ctDNA) 검색에 대 한 가장 정확 하 고 중요 한 도구 중 하나가 되고있다. 표준 ddPCR 기술의 주요 한계 중 하나는 각 가능한 유전자 버전을 인식 하는 특정 가수분해 프로브는 필요 반응, 당 상영 될 수 있는 돌연변이의 제한 수입니다. 다른 방법론, 드롭 오프 ddPCR만 한 쌍의 프로브를 감지 하 여 잠재적으로 모든 유전 변경 대상된 지역에서 계량 하므로 처리량을 증가 합니다. 드롭 오프 ddPCR 단일 반응에서 돌연변이의 더 많은 수를 감지의 장점과 함께 기존의 ddPCR 분석 실험에 유사한 감도 표시 합니다. 그것은 비용 효율적인, 귀중 한 시료를 보존 이며 또한 경우 사용할 수 있습니다 검색 도구로 돌연변이 선험적으로알려져 있지 않습니다.

개념 증명 연구에서 KRA exon 2 돌연변이 (codons 12, 13)와 EGFR exon 19 삭제 FFPE 직물 및 드롭 오프 ddPCR 전략6을 사용 하 여 암 환자에서 혈장 샘플에 조사 되었다.
KRA 이탈 프로브 심문 알려진된 KRA 돌연변이 인간 암11의 95% 이상 항구는 KRA 유전자의 엑손 2에서에서 여러 돌연변이 포괄 16 bp 지역. 참조 조사 이었다 20 길이 위치 3에서 혈압 혈압 하류. 우리의 분석 결과 최적화 하려면 사용 하는 가장 자주 돌연변이 KRA 아미노산의 2를 포함 하는 셀 라인에서 추출한 DNA: G12V (c.35GT, SW480)와 G13...

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

이 방법은 순환 종양 DNA를 분석하기 위한 암진단 도구로 사용될 수 있다. 이 기술은 단 하나 반응에 있는 클러스터 돌연변이의 지구에 있는 다중 유전 변경을 심문합니다. 이것은 귀중한 참을성 있는 견본을 저장하는 것을 돕습니다.이 방법은 그것의 돌연변이 단면도에 종양 부담에 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 핵산 표적 서열의 절대정량화를 얻기 위해 qPCR에 대한 대안으로서 분자 분석에 적용될 수 있다. 7 밀리리터 EDTA 튜브에서 혈액 샘플을 수집합니다.2개의 관은 플라즈마의 약 4밀리리터를 수집하는 것이 좋습니다. 혈액 시료를 820배의 중력에서 10분 동안 원심분리하여 적혈구, 백혈구 및 혈장분리를 유도합니다. 샘플링과 원심 분리 사이의 시간은 백혈구에서 방출되는 DNA로 오염되지 않은 고급 T 세포없는 DNA를 얻는 데 중요합니다.원심 분리에 따라, 백혈구 층을 만지지 않고 상체피수집을 위해 서학적 파이펫을 사용합니다. 플라즈마의 약 2 밀리리터는 일반적으로 EDTA 튜브 당 복구됩니다. 플라스를 2밀리리터 튜브로 옮김한 후, 16번, 000배의 중력을 15도에서 10분 동안 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다.조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 플라즈마를 수집하고 두 밀리리터 극저온 튜브로 전송합니다. 필요할 때까지 음수 섭씨 80도에 보관하십시오. 50 밀리리터 튜브에 400 마이크로리터의 단백질제 K를 첨가하십시오.이어서, 추출 키트로부터 1마이크로그램의 담체 RNA를 함유하는 플라즈마 4밀리리터와 ACL 리시스 버퍼 3.2 밀리리터를 첨가한다. 튜브를 닫고 30초 동안 소용돌이를 통해 혼합하여 균질성 용액을 얻습니다. 그런 다음 섭씨 60도에서 30 분 동안 배양하십시오.인큐베이션 후, 리세이트에 완충ACB7.2 밀리리터를 추가하여 실리카 멤브레인에 순환하는 핵산의 결합을 최적화한다. 15~30초 동안 소용돌이에 섞으세요. 그런 다음 5 분 동안 얼음에 튜브를 배양합니다.컬럼과 20밀리리터 익스텐더를 진공 펌프에 부착합니다. 사용하지 않은 부분을 닫아 진공 포부를 허용합니다. 튜브를 잠시 원심분리한 후 튜브 익스텐더에 혼합물을 조심스럽게 도입하십시오.그런 다음 진공 펌프를 켜고 용하가 열을 통해 완전히 그려질 수 있도록 합니다. 튜브 익스텐더를 제거하고 폐기합니다. 다음으로 600마이크로리터의 버퍼 ACW1을 열에 적용합니다.버퍼 ACW1이 컬럼을 통해 그려지면 ACW2 버퍼750 마이크로리터를 추가하고 마지막으로 96~100%의 마이크로리터 750을 추가합니다. 그런 다음 열을 깨끗한 2 밀리리터 수집 튜브와 원심분리기를 3분 동안 최고 속도로 배치하여 에탄올을 제거합니다. 컬럼을 새로운 2밀리리터 수집 튜브에 넣은 후 뚜껑을 열고 섭씨 56도에서 10분 동안 배양하여 멤브레인을 완전히 건조시킵니다.인큐베이션 후 컬럼을 깨끗한 1.5 밀리리터 저결합 튜브에 넣습니다. 0.04%의 나트륨 아지드를 장착한 RNase 가 없는 물 36마이크로리터를 조심스럽게 적용하십시오. 그런 다음 뚜껑을 닫고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.핵산을 털어내려면 1분 동안 다시 최고 속도로 원심분리기를 합니다. 그런 다음 필요할 때까지 음수 섭씨 20도에 보관하십시오. 먼저 반응 성분을 깨끗한 PCR 후드의 실온에 해빙하고 평형화합니다.그런 다음 RNase 및 Dnase 프리 증류수에서 프라이머와 프로브를 20배 혼합하여 각 프라이머를 18 마이크로몰라 농도로, 각 프로브는 5개의 마이크로몰라 농도로 준비합니다. 모든 개별 PCR 반응의 경우, 2회 ddPCR 슈퍼믹스10마이크로리터, 프라이머 와 프로브 믹스 20배의 마이크로리터 1개, 증류수 20마이크로리터에 DNA 샘플의 최대 10나노그램을 결합하여 샘플 믹스를 준비한다. 균질성을 보장하기 위해 반응 혼합물을 철저히 소용돌이시다.그리고 간략하게 원심분리기를 분배하기 전에 튜브 의 바닥에 있는 내용을 수집합니다. ddPCR 카트리지를 홀더에 삽입하고 20 마이크로리터의 샘플 반응 믹스를 카트리지의 중간 우물에 적물물 생성을 할 수 있습니다. 70 마이크로리터의 액적 발생기 오일을 하단 우물에 넣습니다.개스킷이 있는 카트리지를 물방울 발생기에 삽입합니다. 물방울은 카트리지의 상단 우물에서 생산됩니다. 카트리지에서 40 마이크로리터를 천천히 부드럽게 흡인시키고 96웰 PCR 플레이트에 분배합니다.증발을 피하기 위해 물방울을 옮은 직후 플레이트 실러를 사용하여 알루미늄 호일로 최종 PCR 플레이트를 밀봉하십시오. 우물 바닥에 있는 내용을 수집하기 위해 접시를 간단히 원심분리합니다. 열 사이클러에서 기존의 PCR 증폭을 실행합니다.달리기가 완료되면 접시를 잠시 원심분리하여 우물 바닥에 있는 내용물을 수집합니다. PCR 증폭 후, 소책자 판독기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 PCR 양수 및 PCR 음수 방울을 계산합니다. 다음은 드롭오프 ddPCR 분석기의 최적화 단계에서 얻은 대표적인 결과입니다.이 이미지는 100% 돌연변이 DNA, 5% 돌연변이 DNA 및 100% 야생형 DNA를 포함하는 반응에서 돌연변이 DNA 및 야생형 DNA의 검출을 보여줍니다. 본 이미지는 KRAS 및 EGFR 드롭오프 ddPCR 분석으로 분석된 플라즈마 샘플의 예를 보여 주며, 단일 뉴클레오티드 및 다중 대체체의 검출을 KRAS 2의 KRAS 및 EGFR 엑슨 19에서 삭제하는 것을 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안 이 방법의 중요한 단계인 액적 생성에 특별한 주의를 기울여 각 단계에서 신중하게 진행하는 것이 중요합니다.개발 후, 이 기술은 액체 생검을 사용하여 종양 돌연변이 분석을 최적화하기 위하여 암 연구 분야의 연구원 그리고 임상의를 위한 도로를 포장했습니다.

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR)으로 표적 핵산을 검출하기 위해 유화된 나노 액적을 생성하는 단계별 절차를 제시합니다.

액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

이 동영상은 DNA 샘플에서 indel 돌연변이를 식별하는 데 있어 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응의 역할을 보여줍니다. ddPCR의 높은 정밀도와 감도는 낮은 수준에서도 샘플에 존재하는 희귀 돌연변이를 정확하고 일관되게 검출할 수 있습니다. 게놈의 여러 영역에서 indel 돌연변이를 식별하고 정량화할 수 있으며, 이를 통해 돌연변이의 메커니즘과 이러한 돌연변이의 기능적 결과에 대한 귀중한 통찰력을 얻을  수 있습니다.

타겟 유전자의 Indel 돌연변이 검출을 위한 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응

이 비디오에서는 두 개의 서로 다른 유전자 마커를 동시에 검출하는 데 유용한 기존 PCR 기술을 변형한 ddPCR(duplex digital PCR) 기술을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적으로 증폭되는 나노리터 크기의 유화 액적으로 분할되며, 액적 분획에서 서로 다른 색상의 형광 증폭 신호를 검출하는 것은 표적 염기서열의 초기 농도를 계산하는 데 사용됩니다.

이중 유전자 마커의 동시 정량을 위한 Duplex Digital PCR

이 동영상은 임상 진단 및 예후를 위한 조기 바이오마커로서 서로 다른 백혈구 집단에서 메틸화된 DNA 영역을 동시에 정량화하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응 기술을 보여줍니다.

백혈구에서 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응

이 비디오는 DNA 샘플에서 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하기 위한 chip-in-a-tube 형식의 디지털 PCR의 유용성을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적인 PCR 반응으로 작용하는 챔버로 분할되며, 챔버 내 증폭된 표적에서 형광 신호를 검출하는 것은 샘플 내 변이 대립유전자의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

Wild-type blocking PCR에 이어 직접 염기서열분석(direct sequencing)은 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 매우 민감하게 검출할 수 있는 방법을 제공합니다.

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

디지털 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 이체와 DNA 복사 번호 이체의 고감도 검출을 위한 유용한 도구입니다. 여기, 칩에 튜브 형식으로 디지털 PCR를 사용 하 여 인간 게놈에 있는 드문 이체를 측정 하기 위한 주요 고려 사항을 설명 합니다.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

이 기사에서는 혈관면역모세포 림프종에서 Sanger 염기서열분석을 기반으로 하는 저주파 검출 방법의 적용을 소개합니다. 이 방법을 다른 질병에 적용할 수 있는 근거를 제공합니다.

저빈도 체세포 돌연변이 검출을 위한 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR

액체 크로마토 그래피 / 질량 분석법에 의해 복어 종 유전형하는 개선 된 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 단편 길이 다형성 방법을 설명한다. 역상 실리카 모노리스 컬럼 절단 증폭 산물의 분리에 이용된다. 이 방법은 기본 구성을 식별하는 데 유용 올리고 뉴클레오티드의 모노 이소 ​​토픽 질량을 규명 할 수 있습니다.

액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 유독 복어의 개선 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 조각의 길이 다형성 유전자형

배우세요 drop-off ddPCR 기술을 사용하여 액체 생검에서 순환 종양 DNA의 다중 돌연변이를 동시에 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 KRAS 및 EGFR 유전자 변이 분석에 활용되며 정량적 암 진단에 필수적입니다.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

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