Name: 토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 토끼에서 최소 침습적 배아 이식 기법과 냉동 보존 프로토콜을 이용한 생식 생물학 연구 방법. 이 기술은 인간 생식 연구에 활용 가능한 신뢰할 수 있는 동물 모델을 제공합니다.

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이 저작물은 스페인의 경제 및 경쟁력을 갖춘 기금 (AGL2017-85162)과 발렌시아 나 연구 2014/036 프로그램에서의 자금으로 지원 되었습니다. N. 마 오 완 영어 텍스트 버전 수정

이 연구에서 사용 된 모든 실험 절차는 동물 실험을 위한 지침 2010/63/EU EEC에 따라 수행 되었으며, 시고요 Politècnica 드 València의 동물 들과 실험을 위한 윤리적 위원회에 의해 검토 및 승인 되었습니다. 스페인 (연구 코드: 2015/VSC/완두콩/00170) XGD, FMJ, MPVC 및 JSV는 동물 실험을 위해 발렌시아 정부 행정부가 발급 한 인증 인증서를 보유 하 고 있습니다. XGD는 실험 중에 동물의 복지와 보살 핌을 현장에서 감독 하도록 승인 된다.
1. 배아 이식
<ol><li>수용자 여성 준비
	<ol>
<li>성적으로 성숙한 여성만 사용 (&gt; 4.5 개월).</li>
		<li>1 주일 전, 여 포 성장 및 향상 된 여성 감수 성을 시작 하는 16 시간 빛/8 h 어둠 정권에 여성을 적응.</li>
		<li>여성을 선택 하 고 외 음부의 색을 관찰 합니다. 외 음부는 turgid와 붉은 경우, 여성은 수용.</li>
		<li>의 단일 근육 주사에 의해 의사 임신을 유도 (배 란) 1 µ g의 buserelin 아세테이트 (생식 샘 자극 호르몬의 합성 아날로그) 체중에 관계 없이. 참고: 일반적으로 0.8 µ g는 중간 크기의 토끼 (4-5 kg)에서 배 란 유도에 적합 한 용량 이므로 1 µ g는 일반적으로 배 란을 보장 합니다.</li>
		<li>배아의 나이가 전이 될 때까지 며칠 전에 미리 배 란을 유도 한다 (예를 들어, 70-72 h는 신선한 모 룰라 ET).</li>
	</ol></li>
	<li>마 취 및 진통
	<ol>
<li>토끼를 무게와 다음 마 취 제 및 진통제를 로드 합니다.<ol>
<li>30Ml/kg의 바늘을 넣은 1 mL 주사기와 부 프레 노르 틴 염 산 (0.03 mg/kg)을 사용 하십시오. 다른 1Ml의 주사기에 23G의 pericranial 바늘, 하 중 케 타 민 히드로 클로 라 이드 (35 mg/kg).</li>
		</ol>
</li>
		<li>토끼를 잡고 xylazine-부 프레 노르 핀 혼합물을 피하에 주입 하십시오.</li>
		<li>Pericranial 바늘을 한계 귀 정 맥에 케 타 민 삽입 하 고, 모든 주사기 내용물을 정 맥 내에 서서히 도입 합니다.</li>
		<li>바늘을 고정 하 고 필요한 경우 더 마 취를 관리 할 수 있는 나머지 단계를 통해 삽입 남겨.</li>
		<li>따뜻한 무대에서 (깨끗 하 고 다른 동물 없이) 케이지에 토끼를 남겨 주세요.</li>
		<li>일단 무 의식, 눈의 건조를 방지 하 고 palpebral freflex의 부재를 확인 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다. 참고:이 프로토콜은 최소 30 분 동안 수술 마 취 평면을 제공 합니다. 더 긴 시간이 필요한 경우, 1.2.1에 설명 된 케 타 민 히드로 클로 라 이드의 양의 절반으로 추가 용량을 주입 30 분 후.</li>
		<li>페달 반사와 호흡 운동을 확인 하 여 마 취의 깊이를 모니터링 합니다. 불규칙 하 고 빠른 속도로 호흡 패턴의 변화는 마 취의 적절 한 평면의 손실을 나타냅니다.</li>
		<li>점 막 (눈, 입술 등)의 색을 모니터 하 고 호흡 률 (120-325 분당 30-60 호흡)과 직장 온도 (38-39.6 ° c)를 모니터링 합니다.</li>
		<li>전송 8 시간 전에, ET 과정이 끝날 때까지 큰 창 자 크기와 활동을 피하기 위해 동물에서 음식을 보류. 물에 대 한 무료 액세스를 남겨 주세요.</li>
	</ol></li>
	<li>배아 준비
	<ol>
<li>배아 조작 매체를 25°c로 따뜻하게 하 여 소 혈 청 알 부 민의 0.2% (w/v)로 보충 되는 Dulbecco의 인산 완충 식 염 수 (DPBS)로 구성 된 베이스 배지 (BM).</li>
		<li>실체 현미경으로 작업 하는 경우에는 BM을 사용 하 여 신선 또는 동결 해제 (2 단계) 배아를 씻어 냅니다.</li>
		<li>멸 균 장갑을 사용 하 여 1 mL 주사기에 적절 하 게 구성 된 17G 경 막 외 카 테 터를 부착 하십시오.</li>
		<li>작은 기포 다음에 카 테 터에 BM의 1 센티미터를 흡입.</li>
		<li>BM의 10 µ L의 부피에서 5-7 배아를 흡 인 하 고 또 다른 작은 기포를 따른다.</li>
		<li>BM의 1cm를 흡입 하 여 카 테 터 로드를 마칩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>배아 이식
	<ol>
<li>멸 균 장갑, 가운 및 마스크를 사용 하 여 무 균 환경을 보장 하십시오.</li>
		<li>수술 도구를 소독 하 고 수술이 수행 될 표면을 청소 하 고 70% 에탄올로 닦아 냅니다.</li>
		<li>이전에 상세한 대로 마 취를 수행 (단계 1.2), 반사의 손실에 대 한 검사.</li>
		<li>배 복 부에서 털을 전기 면도기로 면도 합니다.</li>
		<li>복 부를 무 균 적으로 준비 합니다.<ol>
<li>수술 부위를 청소 하 고 남은 모발을 제거 합니다. 수술 부위를 클 로르 헥 딘 글 루 콘 글 루 콘 비누로 씻으십시오. 클 로르 헥 세 딘 용액과 에탄올 96 º (3 회)으로 부위를 소독 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>트 렌 버그의 위치 (45 ° 아래로 머리)에 있는 따뜻한 수술 용 탁자 위에 동물을 놓고 위장과 내장이 위치 하 고 있는지 확인 하십시오. 방광의 대피를 고려 하십시오. 이 과정에서 내장이 손상 되 면 동물이 죽을 수 있습니다. 따라서 적절 하 게 배치 하는 것이 중요 합니다 (그림 1).</li>
		<li>어떤 잠재적인 오염 지역에서 수술 부위를 분리, 면도 영역을 노출 구멍 (fenestration)와 함께 멸 균 타월을 사용 하 여 영역을 커버.</li>
		<li>내 시경 트로 카 1 개를 복 강에 5cm 삽입 하 고 장티푸스 공정에 2cm 꼬리을 주입 하 고 압력 조절 기계식 취 입 기를 사용 하 여 복 막 캐비티를 통과 시킵니다. 참고: 복 부 내부 압력은 CO2와 8-12 mmHg 이어야 합니다 .</li>
		<li>내 시경 트로 카를 통해 내 시경 카메라를 삽입 합니다 (그림 1b). 참고: 생식 기관을 확인 하 고, 다음 단계를 용이 하 게 하기 위해 ET 이전의 상태와 중 위 수의 위치를 결정 합니다.</li>
		<li>17 G 경 막 외 바늘을 사 타 구니 부 위에 2-3 cm 사이에 삽입 하십시오 (그림 1b).</li>
		<li>의 입구를 확인 합니다 (그림 2a, 2b).</li>
		<li>로드 된 카 테 터 (단계 1.3)를 경 막 외 바늘을 통해 복 부에 삽입 합니다 (그림 1c).</li>
		<li>암 울 라 (그림 2a-2c)의 안 위를 통해에 피 덕트를 찾아 경 막 외 카 테 터의 1-2 cm를 삽입 합니다. 손상 및 출혈을 방지 하기 위해 아주 멀리 난관로 진행 하지 마십시오.</li>
		<li>배아를 카 테 터에 결합 된 주사기의 플런저를 가볍게 눌러 난관로 방출 한다 (도2d-2f). 두 기포가 카 테 터를 종료 해야 합니다.</li>
		<li>배아가 방출 된 직후 카 테 터를 제거 하십시오.</li>
		<li>카 테 터를 헹 구 고 조절 배지를 풀어 배아가 없는지 확인 하 고 성공적인 전달을 확인 하십시오.</li>
		<li>원하는 경우 자 궁의 다른 쪽에서 1.4.16 1.4.11 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>경 막 외 바늘 및 내 시경 카메라를 제거 합니다.</li>
		<li>내 시경 트로 카를 통해 co2를 방출 합니다. 과잉 가스가 동물의 복 부에 남아 있으면 통증과 불편 함이 있을 것입니다.</li>
		<li>복 강에서 내 시경 트로 카를 제거 합니다. 수술 용 타월을 제거 하십시오.</li>
		<li>마 취를 중단 하십시오.</li>
		<li>트로 카가 만든 절 개를 클 로르 헥 딘 용액으로 청소 하십시오. 트로 카가 만든 절 개를 미 분화 알루미늄과 플라스틱 드레싱으로 닫습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수술 후 관리
	<ol>
<li>항생제로 동물을 치료: 엔로 플 록 사신 10 밀리 그램/kg, 피하, 5 일 동안 매 24 시간.</li>
		<li>진통제 관리: 부 프레 노르 틴 염 산 (0.03 mg/kg), 피하, 각 12 시간 3 일 동안; 멜 록 시 캄 (0.2 밀리 그램/kg), 피하, 3 일 동안 매 24 시간.</li>
		<li>수술 후 적어도 30 분 동안 동물을 모니터링 하십시오 (동물 및 마 취의 복용량에 따라 다름) 그들의 생리 적 상태를 회복 시킵니다.</li>
		<li>적절 한 환경 조건으로 깨끗 한 케이지에 있는 받는 사람 (예: 귀 타 투) 및 집 동물을 개별적으로 식별 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig1.jpg"> 그림 1: 복 강경 검사 (외부 보기)에 의해 보조 된 복 강경 배아 전달. A) 내 시경 트로 카 삽입 (1 포트) B) 내 시경 카메라와 경 막 외 바늘 (검정색 화살표)의 삽입. C) 경 막 외 바늘을 통과 하는 배아 이식 카 테 터 (백색 화살표)의 삽입. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig2.jpg"> 그림 2: 복 강경 검사 (내부 보기)에 의해 지원 복 강경 배아 전송. A: 복 부 구역에 경 막 외 바늘을 통해 카 테 터 삽입. 별표는 인 푼 디 bulum을 나타냅니다. B, C, D: 배아와 함께 적재 된 카 테 터는 전체에 걸쳐 ampulla 지역에 삽입 됩니다. E, F: 배아의 방출은, 팽 윤 된 oviduct의 가시화에 의해 확인 되었다. 이 그림은 마르코-지 메 네즈 외에서 조정 되었습니다 . 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
2. 태아의 비 삼중 화와 온난화
<ol><li>상 온 (22 ° c 전후)에서 모든 조작을 수행 하 여 따뜻한 온도에서 유리 화 용액 독성을 감소 시킵니다. 참고: 배아는이 프로토콜에서 0.1-2 µ L 자동 피 펫을 사용 하 여 움직일 수 있지만, 다른 유사 장치는 배아를 이동 시켜 최소 부피를 드래그 하는 것이 적합할 수 있다.</li>
	<li>2 단계 추가 절차에서 배아를 vitrify:<ol>
<li>Equilibrating에 10%의 에틸렌 글리콜과 10% (v/v) 디 메 틸 설 폭 사이드로 이루어진 용액에 2 분간 배아를 넣고 BM에 용 해 시켰다.</li>
		<li>단계 2.2.1에서 배아를 1 분간 20%의 에틸렌 글리콜과 20% (v/v) 디 메 틸 설 폭 사이드로 구성 된 유리 화 용액으로 이동 시켜 BM에 용 해 시켰다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>125 µ L 플라스틱 미니 밀 (면 마 개 플러그와 한 개의 열린 극단으로 한 개의 닫힌 끝이 포함 되어 있습니다)에 배아를 로드 합니다. 이 과정은 그림 3에서 스키마 화할 것입니다.<ol>
<li>0.125 μ l 미니 스트로의 닫힌 말단을 적절 한 마이크로 디스펜서 (예: Captroll III®)와 함께 사용 하십시오.</li>
		<li>작은 기포에 의해 다음 빨 대 길이의 1/3까지 BM을 흡 기.</li>
		<li>40 µ L의 부피로 배아를 흡 인 하 고, 또 다른 작은 기포를가 하였다.</li>
		<li>첫 번째 액체 분 획까지 BM을 흡입 합니다 (단계 2.3.2)가 면에 도달 합니다.</li>
		<li>빨 대 플러그가 있는 오픈 엔드를 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.3 단계를 수행 하는 동안 2.2.2 단계에서 1 분 이상 경과 하지 않으면 배아에 독성이 있을 수 있습니다.</li>
	<li>미니 스트로를 액체 질소에 직접 플런지 하 여 유리 화를 얻습니다.</li>
	<li>원하는 시간 동안 질소에 대 한 dewar에 미니 밀을 저장 합니다.</li>
	<li>배아를 단일 단계로 해 동 한다.<ol>
<li>20-30 s에 대 한 액체 질소 증기에서 수평으로 10cm의 미니 밀을 배치 합니다.</li>
		<li>결정 화 과정이 미니 스트로 내부에서 시작 될 때, 10-15의 경우 25 ° c의 수조에 미니 스트로를 담가 보십시오.</li>
		<li>미니 스트로 플러그를 분리 하 고 코 튼 플러그를 자릅니다.</li>
		<li>결합 된 마이크로 디스펜서를 사용 하 여 모든 미니 밀의 내용물을 BM의 25 ° c에서 0.33 M 자당 용액을 포함 하는 플레이트에 5 분간 배출 합니다. 참고:이 단계는 유리 화 솔루션에 대 한 배아 노출을 줄이기 위해 신속 하 게 수행 해야 합니다.</li>
		<li>다른 5 분 동안 BM 용액을 포함 하는 새로운 플레이트에 배아를 이동.</li>
		<li>ET를 계속 하려면 손상 되지 않은 배아만 고려 하십시오 (온전한 뮤 신 코트와 조 나 펠 루시와 함께). 참고: 해 동 배아에서 비동기 전송 (예 : 모 룰라 전송에서 60-62 h)은 배아와 모계 endometrium 간의 재 동기화를 허용 하 여 결과를 향상 시킬 수 있음을 고려 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig3.jpg"> 그림 3: 올바르게 로드 된 빨 대의 식 각. A) BM은 비 삼중 화 중에 사용 되는 배아 조작 매체를 지칭 한다. 배아는 유리 화 용액으로 로딩 되어야 한다. B) 배아 위치에 대 한 확대 된 디테일과 함께 로드 된 짚의 거시적 모습. 이 대용량 장치를 사용 하면 최소 볼륨 장치와 달리 많은 수의 배아를 vitrify 할 수 있습니다. 또한,이 장치의 처리는 최소 부피 장치에 비해 용이 하며, 결과는 토끼41에서 유사 하다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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최초에 기록 된 살아있는 출생 사건부터 배아9까지,이 기술과 토끼 종은 생식 연구에서 매우 중요 한 역할을 하 게 되었습니다. 게다가, 조작, 생산, 냉동 보존 등 을 포함 하는 배아 연구 연구는 건강 한 전체 기간 자식을 생성 하는 배아 용량의 평가를 마지막 단계로 요구 합니다. 따라서 배아 전달 기법은13,28에 필수적 이다. 수 년에 걸쳐, 태아를 모계 자 궁으로 이전 하기 위하여 처음에 채택 된 외과 방법은13종의 대다수에 있는 더 적은 침략 적인 방법으로 점차적으로 대체 되 고,14,15, 21 , <sup cl...

인간 불모를 우회 하거나 높은 유전 가치를 가진 가축의 보급을 개량 하 고 동물성 유전 자원을 보전 하는의 목표를 가진, 일련의 기술의 세트는, 초 배 란과 같은 원조 재생산 기술 이라고 불렀습니다 시험관 내 시비, 배아 배양 또는 냉동 보존은1,2로 개발 되었다. 현재, 호르몬 치료는 난소를 자극 하 고 다 수의 배 승 난소 모 낭을 생성 하기 위하여 주어 집니다1. 이들 여 포 로부터 채취 된 난 모 세포는 냉동 보존 되거나 대리 모 (3)로 이송 될 때까지 시험관 내에서 성숙, 수정 및 개발 될 수 있다. 그러나, 이러한 치료법 중에,가 및 zygotes는 이러한 조건4,5에서 생존 하기 위해 배아 적응이 필요할 수 있는 일련의 비 생리 적 과정에 노출 된다. 이 적응은 유전자 발현 및 발달 프로그래밍6에서 배아 변화를 허용 하는 초기 배아가 소성으로 인해 가능 합니다. 그러나, 이러한 수정은 성인이 될 때까지 배아 발달의 후속 단계에 영향을 미칠 수 있고, 지금 널리 방법, 타이밍, 냉동 보존 절차 또는 배양 조건이 배아 운명에 다른 결과를 보여줍니다7 , 8. 따라서 예술의 특정 한 유도 효과를 밝히기 위해 잘 특성화 된 동물 모델을 사용 하는 것은 불가피 합니다.
포유동물 배아의 전사 로부터 발생 되는 최초 기록 된 살아있는 출생은 18909에서 일어났다. 오늘날, 대리 여성에 대 한 배아 이식 (ET)은 후속 배아 개발 단계10에 이식 하는 동안 당해 유발 효과를 연구 하는 중요 한 단계 이다. ET 기술은 각 동물의 크기 및 해부학 적 구조에 따라 달라 집니다. 대형 동물 모델의 경우, transcervical 비 수술 ET 기술에 의해 ET을 수행 할 수 있었지만, 자 궁 경부의 작은 크기의 카 테 터는 더 복잡 하 고 외과 기술이 자주 사용 됩니다11. 그러나 외과 ET는 혈액이 자 궁 루멘을 침범 하 여 태아 죽음10을 일으키는 원인이 되기 때문에 이식 및 배아 발달을 손상 시킬 수 있는 출혈 발생할 수 있습니다. Transcervical 비 수술 적 ET 기술은 인간, 개 코 원숭이, 소, 돼지 및 생쥐12,13,14,15,17에 여전히 적용 되지만 외과 ETs는 여전히 염소, 양 또는 기타 동물 들과 같은 종에서 사용 되 고 있으며이는 추가로 어려움을 겪고 있다10,18,19,20토끼와 같은 (2 독립 cervices) 또는 마우스 (작은 크기). 그럼에도 불구 하 고, 외과 적 전달 방법은 점차적으로 덜 침 습 적 방법으로 대체 되는 경향이 있습니다. 내 시경은 토끼, 돼지 및 작은 반추 위 제18,19,20등에서 배아를 전달 하는데 사용 되었다. 이러한 최소 침 습 내 시경 검사 법은 토끼에 필수적 이며 일부 종20에서 유익한 효과를 입증 한 infundibulum을 통해 암 울 라로 배아를 전달 하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 oviduct에 있는 초기 배아 단계 도중 태아와 어머니 사이 정확한 대화의 중요성에 근거를 두고 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 배아를 통해 이식 하는 동안 토끼에서 일어나는 배아 리 모델링은 이식22,23을 할 수 있는 배아를 달성 하는 것이 필수적 이다.
소 등의 대형 동물 모델은 생화학 적 및 이식 기능이 인간 종24와 유사 하기 때문에 흥미롭습니다. 그러나, 큰 동물은 예비 실험에서 사용 하기에는 너무 비싸지 고, 설치류는 실험실 연구25에 대 한 이상적인 모델로 간주 됩니다 (76% 모델 생물은 설치류). 그럼에도 불구 하 고, 토끼 모델은 생식 연구에서 설치류에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다, 인간에 의해 전시 된 일부 생식 생물학 과정은 쥐 보다 토끼에서 더 유사 하다. 인간과 토끼는 유사한 연대순으로 배아 게놈 활성화, gastrulation 및 혈우병 태 반 구조를 제시 한다. 또한, 토끼를 사용 하는 것은 그들의 배 란 (25)의 유도로 인 한 풍부 하 게 함 및 임신 단계의 정확한 타이밍을 알 수 있다. 토끼 라이프 사이클은 짧고, 31 일에 임신을 완료 하 고 약 4-5 개월에 사춘기에 도달; 동물의 유 순 및 비 공격적인 행동으로 인해 취급이 용이 하 고, 그 유지는 큰 동물의 비용에 비해 매우 경제적 이다. 더욱이, 토끼는 두 개의 독립적인 서 비 세스11,25를 가진 이중 자 궁을가지고 있다는 것을 언급 하는 것이 중요 합니다. 이것은 다른 실험 군의 배아가 동일한 동물로, 그러나 다른 자 궁 경적으로 전달 될 수 있기 때문에, 특혜 위치에 토끼를 배치 합니다. 이것은 우리가 결과에서 모성 요인을 감소, 두 실험 효과를 비교할 수 있습니다.
오늘, 비 외과 ET 방법은 토끼에 사용 되지 않습니다. Transcervical ET 기술을 사용 하 여 90 년대 후반에 수행 된 일부 연구는 외과 적 방법으로 5.5% ~ 20.0%,26 ~ 50-65%에 이르는 낮은 납품 율을 초래 했으며, 그 중에서 복 강경 수술 절차 베 센 펠 더와 브 렘18. 토끼에서 이러한 비 수술 ET 방법의 낮은 성공률은 transcervical ET에서 피할 수 있는 oviduct에 필요한 배아 리 모델링의 부족과 일치 합니다. 여기서, 우리는 모델 유기 체로 서 토끼를 사용 하는 효과적인 최소 침 습 복 강경 ET 절차를 설명 한다. 이 기술은 큰 동물 및 인간에서 추가 생식 연구를 위한 모델을 제공 합니다.
토끼는 특히 배아 이식에 대 한 좁은 시간 윈도우를가지고 있기 때문에,이 종에서는 ET에서 배아의 발달 단계와 수용자 (27)의 생리 적 상태 사이에 높은 수준의 동기화가 필요 하다. 어떤 경우에는 배아 개발을 느리게 하는 생식 치료 (예: 시험관 내 문화) 또는 자궁내 막 감수 (예: 배 란 치료)를 변경 하는 경우 배아와 모계 자 궁 사이에는 동기화가 없습니다. 이러한 상황은 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 맥락에서 응답 하기 위해, 우리는 실험을 일시 중지, 구성 및 재개 할 수 있는 효과적인 토끼 모 룰라 유리 화 프로토콜을 설명 합니다. 이 과정은 재생산 연구를 위해로 서 바람직 하 고 우리에 게 그들의 수송을 허용 하는 배아의 장기 저장을 위한 능력을 줍니다. 복 강경 절차 및 냉동 보존 전략은 적은 동물 연구의 더 나은 계획을 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법론은 위생 적이 고 경제적 인 이점을 제공 하 고 실험 동물의 인간 치료를 개선 한다는 명시 된 목표로 동물 연구의 3Rs (교체, 감소 및 정제)의 개념을 준수 합니다. 따라서, 이러한 방법으로, 토끼는 생체 내 생식 분석을 위한 이상적인 모델 유기 체를 구성 한다.

<table><tbody><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 염산염</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>626</td><td>면허가 있는 수의사의 지시를 받아야 합니다.</td></tr><tr><td>Buserelin 아세테이트</td><td>시그마 Aldrich</td><td>B3303</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 디글루코네이트 비누</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCJ500B</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 디글루코네이트 용액</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCA500B</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Air Liquide</td><td>99921</td><td>CO2 N48.</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Fisher scientific</td><td>15385194</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387509</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5773</td><td>염화칼슘 없음.</td></tr><tr><td>전기 면도기</td><td>Oster Golden A5</td><td>078005-140-002</td><td></td></tr><tr><td>내시경 카메라</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>OP-714</td><td></td></tr><tr><td>내시경 투관구 실리콘 리플릿 밸브</td><td>Karl Storz 내시경 Ib&eacute; 리카 SA</td><td>30114GK</td><td>경량 투관침 모델.</td></tr><tr><td>엔로플록사신</td><td>알벳 에스카르트&아큐트;</td><td>9993046</td><td>면허가 있는 수의사의 지시를 받아야 합니다.</td></tr><tr><td>Epicraneal 바늘 23G</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>514056353</td><td>작은 바늘도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>경막외 카테터</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>경막외 바늘</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>시그마 Aldrich</td><td>102466-M</td><td></td></tr><tr><td>눈 연고</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>5273</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>184</td><td>면허가 있는 수의사의 지시를 받아야 합니다.</td></tr><tr><td>복강경 장비</td><td>Karl Storz 내시경 Ib&eacute; 리카 SA</td><td>26003 AA</td><td>홉킨스&reg; 복강경, 0&ordm;-mm 직선 관찰 복강경, 길이 30cm, 5mm 작업 채널.</td></tr><tr><td>광원</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>Fibrolux 250</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>공기 액체</td><td>P1505XXX</td><td></td></tr><tr><td>기계적 CO2 insufflator</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; 리카 SA</td><td>엔도플래터&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993501</td><td>면허가 있는 수의사의 지시를 받아야 합니다.</td></tr><tr><td>페트리 접시, 35-mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165-500EA</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 드레싱 (Nobecutan)</td><td>IBOR medica</td><td>7140028</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 빨대 0.25 mL</td><td>IMV - 기술</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Povidone 요오드 솔루션</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>02656DPYS500S</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>일반 수술 등급의 강철 작은 직선 가위가 작동합니다.</td></tr><tr><td>insufflator</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute용 실리콘 튜브; 리카 SA</td><td></td><td></td>20400040</tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>Leica MZ8 또는 Nikon SMZ-10 또는 SMZ-2B와 같은 저렴한 옵션이 있습니다.</td></tr><tr><td>멸균 장갑</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>087GL010075</td><td></td></tr><tr><td>멸균 가운</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td></td><td></td>12261501</tr><tr><td>멸균 마스크</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>058B15924B</td><td></td></tr><tr><td>빨대 플러그</td><td>IMV - 기술</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 1-mL</td><td>Fisher scientific</td><td>11750425</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 5-mL</td><td>Fisher scientific</td><td>11773313</td><td></td></tr><tr><td>요로 카테터</td><td>IMV - 기술</td><td>17722</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>RAYPA</td><td>BAE-4</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>525225</td><td>면허가 있는 수의사의 지시를 받아야 합니다.</td></tr><tr><td>토끼</td><td>Universitat Polit&egrave; cnica de Val&egrave; ncia</td><td>Line A</td><td>Line V 또는 Line HP와 같은 다른 모계 라인을 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

시험관 내 배아 배양 또는 배아 동결 보존과 같은 보조 생식 기술 (ARTs)은 출산 및 출생 후의 결과와 함께 자연 개발 패턴에 영향을 미칩니다. 예술 응용 프로그램의 무해 함을 보장 하기 위해 동물 모델에 대 한 연구가 필요 합니다. 또한, 마지막 단계로, 태아 발달 연구는 완전 한 건강 한 자손을 개발 하는 그들의 능력의 평가를 요구 합니다. 여기에서 자 궁으로의 배아 전달은 예술 관련 실험을 수행 하는 데 필수적입니다.
토끼는 한 세기 이상 동안 포유류 재생을 연구 하는 모델 유기 체로 사용 되었습니다. 인간 종과 그것의 작은 크기 및 낮은 유지 관리 비용에 대 한 계통 적 근접성 외에도 유도 배 란, 인간과 유사한 초기 배아 개발의 연대기 및 짧은 임신과 같은 중요 한 생식 특성을가지고 있습니다. 그것은 우리가 쉽게 예술 응용 프로그램의 결과를 연구 할 수 있도록. 더욱이, 예술 (예를 들어, 내과 세포 정자 주사, 배아 배양 또는 동결 보존)은이 종에서 적절 한 효율로 적용 된다.
본 기사에 제시 된 복 강경 배아 전달 기술 및 동결 보존 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 1) 쉽게, 최소 침 습 적 기술 및 2) 토끼의 장기 저장을 위한 효과적인 프로토콜을 통해 배아를 전달 하는 방법을 설명 배아는 시간-유연한 물류 용량 및 샘플을 수송 할 수 있는 능력을 제공 한다. 다른 발달 단계에서 토끼 배아를 양도 한 후 얻어진 결과는 모 룰라가 토끼 배아 회복 및 전달에 이상적인 단계 임을 나타냅니다. 따라서, 외 과적 배아 전달은 수술 절차를 정당화 해야 합니다. 또한, 토끼 모 루 애는 성공적으로 유리 화 되 고 복 강경 전이 되어 기술 된 기술의 효과를 입증 합니다.

최소 침 습 복 강경은 생식 연구를 위한 가장 좋은 모델 동물 중 토끼를 배치 하는 신선 또는 유리 화 된 배아의 전송. 표 1 은 전이 된 배아의 상이한 발달 단계 (도 4)에서의 신선한 ET의 결과를 보여준다. 출생 시 생존 율 (새끼를 초래 하는 배아의 퍼센트)은이 논문에 기술 된 복 강경 기법의 효능을 입증 했습니다. 더 높은 값은 초기에 또는 조밀한 morulae의 모 룰라 단계에 있는 배아를 가진 ET가 수행 될 때 달성 되었습니다. 이러한 결과 들에 기초 하 여, 우리는 이러한 배아 들의 유리 화 후 생존 율을 입증 하기 위해 두 번째 실험을 수행 하였다. 따라서, 표 2 에서 우리는 동시에 회복 된 토끼 모 울 래를 전사 한 후 얻어진 결과를 보여주고, 양호한 정도의 다짐 정도에 도달한 배아 들을 분화 여부를 구별 한다. 출생 시 생존 율은 다...

보조 생식 기술 (ARTs)은 결과를 개선 하 고 관련 위험을 줄이기 위해 지속적인 평가를 하 고 있습니다. 이 원고는 인간 재생의 이상적인 동물 모델로 서 토끼의 사용을 허용 하는 효율적인 냉동 보존 프로토콜을 가진 최소 침 습 배아 전달 절차를 설명 합니다.

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

이 실험의 주요 목표는 토끼의 복강경 배아 전달 절차를 모델로 설명하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은이 사람이 쉽고 최소 침습기술을 사용하여 배아를 옮기기 위해 작용한다는 것입니다. 더욱이, 여기서 설명된 효과적인 배아 냉동 보존 프로토콜은 또한 토끼 배아를 장기간 저장하여 시간 유연한 물류 능력과 시료를 수송하는 능력을 제공한다.우리가 알다시피, 보조 생식 기술은 결과를 개선하고 관련 위험을 줄이기 위해 지속적인 평가에 있습니다. 따라서 두 기술을 모두 사용하여 토끼는 자손에 대한 체외 배아 조작의 효과와 같은 이 분야의 주요 질문에 답하기 위해 인간 번식의 이상적인 동물 모델로 사용될 수 있다. 이 문제의 시각적 데모는 배아 전달 단계가 배우기 어렵기 때문에 기술의 성공을 보장하기 위해 매우 정밀하게 수행해야하기 때문에 중요합니다.배아 진동을 위해 배아를 2분 동안 평형 솔루션에 담그고, 진동 용액에서 1분 잠복이 발생합니다. 인큐베이션이 끝나면 배아를 125 마이크로리터 플라스틱 미니 짚에 넣고 미니 짚의 닫힌 끝을 적절한 1 밀리리터 마이크로 디스펜더와 결합합니다. 빨대 길이의 1/3까지 의 1/3까지 의 흡인 베이스 중간, 작은 기포가 뒤따릅니다.다음으로, 스테레오마이크로코프를 사용하여 40마이크로리터의 진동용 마이크로리터로 배아를 흡인시키고, 또 다른 작은 기포와 충분한 기본 매체를 사용하여 첫 번째 액체 분획을 미니 짚의 면까지 이동시합니다. 그런 다음 미니 짚의 열린 끝을 밀짚 플러그로 닫고 미니 짚을 액체 질소에 직접 떨어 뜨고 유리화를 달성하고 미니 짚을 액체 질소 데워에 보관하십시오. 배아를 전동용으로 해동하려면 액체 질소 증기로부터 10cm 의 미니 짚을 수평으로 20 내지 30초 간 배치합니다.결정화 과정이 미니 짚 내부에서 시작되면 10~15초 동안 25도의 수조에 미니 짚을 담급니다. 즉시 미니 짚과 면 플러그를 제거하고 결합 된 마이크로 디스펜더를 사용하여 5 분 동안 배아가 있어야하는 0.33 대구 용액으로 보충 된 섭씨 25도 베이스 매체가 들어있는 접시에 미니 밀짚 내용을 추방합니다. 그런 다음 배아를 신선한 베이스 배지 의 접시에 5 분 배양하여 전달합니다.배아의 나이가 옮겨지기까지 며칠 전, 성적으로 성숙한 4.5개월 된 암컷 토끼의 외음부의 터기와 색을 관찰하고, 체중에 관계없이 1마이크로그램의 단일 근육 주사로 수용동물의 배란을 유도한다. 이송 당일, 스테레오현미경으로 37도의 상량 의 기초 배지로 신선하거나 해동된 배아를 헹구고, 적절하게 구성된 17게이지 경막외 카테터를 1밀리리터 주사기에 부착한다. 카테터에 기본 매체의 1 센티미터를 흡인하고, 작은 기포가 뒤따릅니다.그런 다음 5~7개의 배아와 10개의 미루기 매체를 흡인하고, 또 다른 작은 기포와 최종 1센티미터의 기본 배지를 흡입한다. 배아가 적재되면 마취된 받는 토끼를 온난화 단계에 케이지에 넣고 동물의 눈에 연고를 바릅니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 복부에서 모피를 면도, 클로르헨시딘 글루코네이트 비누로 수술 영역을 청소하고, 나머지 머리를 제거.수술 부위에 구멍이 있는 멸균 드레이프로 부위를 덮고, 내시경 트로카 1대를 복강내로 5센티미터, zyphoid 과정에 2센티미터 의 소달을 삽입하고, 복막 구멍을 팽창시키기 위해 기계식 인수프플레이터를 조절하는 압력을 사용합니다. 내시경 카메라를 내시경 트로카를 통해 삽입하고 17 게이지 경막외 바늘을 인구부위에 삽입하여 인펀디불룸에서 2~3cm 떨어진 곳에 삽입합니다. 경막외 바늘을 통해 하중 카테터를 복부에 삽입하고 암풀라의 자금 을 통해 경막외 카테터의 1 ~ 2 센티미터를 삽입하십시오.카테터 플런저를 부드럽게 우울하여 배아를 배아를 oviduct로 방출합니다. 두 기포는 카테터에서 빠져나와야 합니다. 배아가 방출된 직후 카테터를 제거하고, 배아의 부재를 확인하기 위해 나머지 배지를 흡인하고 방출한다.배아의 성공적인 전달을 확인한 후 경막외 바늘과 내시경 카메라를 제거하고 내시경 트로카를 통해 복부 이산화탄소를 방출한다. 클로르헤시딘 용액으로 트로카 절개를 청소하고 미크로니즈 알루미늄과 플라스틱 드레싱으로 상처를 닫습니다. 그런 다음 동물을 적절한 항생제와 진통제로 치료하고 완전히 회복 될 때까지 동물을 모니터링하십시오.최소 침습복면 배아 전달은 새끼의 결과로 전송된 신선한 태아의 높은 백분율로 생식 연구를 위한 제일 동물 모형 중 토끼를 둡시합니다. 특히, 신선한 배아 전이가 초기 또는 소형 모룰라단계에서 배아로 수행될 때 더 높은 값을 달성한다. 유사한 결과는 토끼에 있는 신선한 유리화 배아를 전송하기 위한 이 기술의 효험 그리고 신뢰성을 확인하는, 특히 컴팩트한 morulae를 가진 조기 및 압축된 유리생물 모룰라 전송 후에 관찰됩니다.이 절차에 따라, 조건부 보조 생식 기술과 같은 다른 방법은 나중에 진통 효과에서 밀도의 추가가 발생할 수있는 방법과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 최근 개발 후,이 기술은 토끼와 인간 사이의 가까운 물리 유전 적 거리에 따라 인간에서이 효과를 탐구하는 재생산 분야의 과학자를위한 길을 열어줍니다. 따라서, 이 기술은 다른 포유류 종뿐만 아니라 인간 임상 의학으로 쉽게 전달 가능한 결과를 제공할 수 있다.우리의 방법은 실험 동물의 인간 치료를 개선하기위한 목적으로, 동물 복지, 교체, 감소 및 정제의 세 R의 개념에 부합하는 몇 가지 위생적, 경제적 이점을 제공한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마우스 배아의 에틸렌 글리콜 기반 vitrification 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 단순하고 낮은 배아 독성의 다른 방법에 유리하고, 따라서 근친과 유전자 - 수정된 생쥐를 포함하여 마우스의 여러 변종에 광범위하게 적용하실 수 있습니다.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

이 비디오에서는 에틸렌 글리콜 및 디메틸 설폭사이드를 동결 보호제로, 극저온 빨대를 운반 시스템으로 사용하여 원하는 발달 단계에서 수확된 토끼 배아를 유리화하는 절차를 설명합니다. 유리화된 배아는 생존율이 높으며 사용할 때까지 장기간 보관할 수 있습니다.

극저온 빨대를 사용한 토끼 배아 유리화: 장기 보관을 위해 토끼 배아를 보존하기 위한 초고속 냉각 기술

이 비디오는 유리화 토끼 배아를 해동하는 절차와 최적의 배아 회복을 위한 예방 측정 단계를 보여줍니다.

토끼 배아 해동: 배아 이식을 위해 냉동 보존된 토끼 배아를 회수하기 위한 온난화 절차

이 비디오는 복강경을 통해 수혜자 암컷 토끼의 난관으로 배아를 이식하는 기술을 설명합니다. 그것은 산란관을 통해 이동하는 토끼의 배아 리모델링을 가능하게 하여 결국 성공적인 착상에 도움이 됩니다. 이 기술은 또한 우수한 효율성으로 저장된 배아에 사용할 수 있습니다.

토끼로의 배아 이식: 배란 수혜자 암컷 토끼 모델의 난관으로 배아를 복강경 투시경 유도 이식하는 절차

유전자 타겟팅 도구의 최근 발전은 녹아웃의 생산 (KO) 토끼가 가능하게한다. 본 연구에서는 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN)를 사용하여 다섯 아포 지질 단백질 (아포) C-III KO 토끼를 생성합니다. 이 작품은 ZFN은 KO 토끼를 생산하는 매우 효율적인 방법이라고 설명했다.

징크 핑거 뉴 클레아 제를 사용하여 아포 지단백 C-III 녹아웃 토끼의 생산

자궁 - 난관 배아 입금 자궁 전송을 수행 할 때 발생할 수있는 배아 유출을 방지하는 장벽으로 자궁 - 난관 접합부를 사용한다. 과 vasectomized 남성은 배아 전송 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 두 가지 기술을 설명합니다.

마우스 모델에서 자궁 - 난관 배아 전송 및 정관

MicroSecure Vitrification은 FDA 우수 제조 및 조직 취급 관행을 준수하는 비상업적인 무균 폐쇄 유리화 장치 시스템으로 개발되었습니다. 소수성 플러그 배아 빨대가 업계에서 철수함에 따라 유리화 절차는 표준 내부 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 수정되었습니다.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

배반포 생검 및 유리화는 착상 전 유전자 검사를 효율적으로 수행하기 위해 필요합니다. 조나 펠루시다의 순차적 개방및 5-7일째에 7-8개의 트로페토더세포를 회수하는 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 이하의 환경 조건으로 제한한다.

인간 배반포 생검 및 유리화

이 프로토콜은 배아 착상 과정에 영향을 미치는 관련 분자를 평가하기 위한 간단하고 효율적인 체 외 배아 이식 모델을 수립하기 위한 방법론을 설명합니다.

In vitro 배아 이식 모델 확립

이 프로토콜은 배아 이식 및 유전자 변형 토끼에 대한 임신 및 사료 관리 기술을 설명하며, 신생아 토끼 사망률을 줄이고 유전자 편집 토끼의 준비 효율성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

Pregnancy and Nursing Management for Embryo-Transferred and Genetically Modified Rabbits

여기에서는 홈메이드 주걱으로 구성되고 홈메이드 솔루션을 활용하여 마우스와 양의 착상 전 배아를 유리화하기 위한 Spatula Montevideo 프로토콜을 제시합니다. 배아는 농도가 증가하는 두 개의 동결 보호 용액에서 빠르게 평형을 이루고, 주걱에 적재되고, 액체 질소에 담근 다음, 최종적으로 0.5mL 빨대로 밀봉됩니다.

포유류 배아의 유리화를 위한 주걱 몬테비데오 장치

배우세요 토끼에서 최소 침습적 배아 이식 기법과 냉동 보존 프로토콜을 이용한 생식 생물학 연구 방법. 이 기술은 인간 생식 연구에 활용 가능한 신뢰할 수 있는 동물 모델을 제공합니다.

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

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