생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

이 방법은 페로몬 식별과 같은 화학 생태학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 새로운 화합물을 페로몬 기능에 연결한다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 섭씨 16-18도로 유지되는 250리터의 폭기 휴런 호수 물이 공급되는 탱크에 성적으로 성숙한 수컷 칠성장어를 15-30마리 놓습니다.

고체상 추출로 조절된 물을 추출하려면 펌핑 시스템을 통해 탱크에서 컬럼 상단으로 통과시키십시오. 물은 일련의 4개의 1리터 용량의 유리 기둥에 포함된 2kg의 중간 극성 고분자 이온 교환 수지 베드를 통과합니다. 다음으로, 유기 용매를 제거하고 섭씨 40도에서 감압 하에서 5 시간 동안 회전 증발에 의해 추출물을 수확합니다.

분획 풀을 분리하려면 실리카겔을 초기 이동상에 30분 동안 담가둡니다. 용매가 포함된 겔을 유리 컬럼으로 옮기고 밸브를 열어 이동상이 통과할 수 있도록 합니다. 다음으로, 추출물을 실리카겔과 완전히 혼합하고 실리카겔 베드 위의 액체 크로마토그래피 컬럼에 로드합니다.

95% 클로로포름에서 메탄올로 100% 메탄올로 그라데이션으로 용리하여 총 2.5리터를 만든 다음 개별 10ml 바이알에 용리액을 수집합니다. 그 후, 시료를 출발선에 도포하고 플레이트의 출발선을 현상 용매에 밀봉된 유리 탱크에 담궈 사전 코팅된 실리카겔 플레이트에서 TLC 실험을 수행합니다. 현상 용매가 엔드 라인에 도달한 후 탱크에서 플레이트를 꺼내고 용매가 증발할 때까지 10분 동안 기다립니다.

먼저 254나노미터의 자외선 아래에서 반점을 시각화한 다음 크로마토그래피 분무기를 사용하여 5% 아니알데히드의 산성 메탄올 용액을 분무하고 섭씨 85도에서 3분 동안 가열하여 플레이트를 염색합니다. 그 후, 약 30 분 동안 섭씨 40 도의 감압 하에서 회전 증발에 의해 잔류 물에 분획을 농축한다. EOG 기록을 수행하려면 마이크로피펫을 사용하여 은-은 염화물 펠릿으로 사전 제작된 폴 모세관 전극과 고체 전극 홀더를 3몰 염화칼륨으로 채웁니다.

그런 다음 전극 홀더에 폴 전극을 삽입합니다. 다음으로, 부피 플라스크에서 탈이온수에 10에서 2 몰 L-아르기닌 원액을 뺀 5몰 L-아르기닌 용액에 100 밀리리터를 준비합니다. 농도 반응 곡선의 경우, 분획 풀의 10배 희석액 10ml를 준비합니다.

이제 마취된 램프를 V자형 스탠드에 넣고 젖은 종이 타월로 감싸 건조를 방지합니다. MS222 리터당 50밀리그램이 들어 있는 재순환 폭기수 튜브를 협측강에 삽입합니다. 유속을 조정하고 아가미 구멍을 통해 물이 빠져 나가는지 확인하여 아가미를 지속적으로 관개합니다.

여과된 물로 냄새 전달 튜브를 세척하고 미세 조작기에 장착된 밸브에 연결합니다. 다음으로, 냄새 전달 모세관 튜브를 후각 상피강에 삽입하여 여과된 물을 후각 상피에 전달하여 냄새 물질을 투여하지 않을 때 건조를 방지합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터에 기록 및 참조 전극을 장착합니다.

기준 전극을 콧구멍 근처의 외부 피부로 내립니다. 실체 현미경을 사용하여 기록 전극을 내려 후각 상피 표면에 거의 닿지 않도록 합니다. 그런 다음 배경 여과 된 물에서 10, 마이너스 5 몰 L- 아르기닌 용액으로 냄새 전달 튜브의 흡수를 옮깁니다.

컴퓨터, 증폭기, 필터 및 디지타이저를 켭니다. 밸브 드라이버 소프트웨어를 사용하여 T1 상자를 선택하고 T를 4초로 설정하고 데이터 수집 소프트웨어 T2.In 상자를 선택하여 4초 단일 냄새 펄스를 관리하는 절차를 프로그래밍하고 수집 모드를 고속 오실로스코프로 설정합니다. Play(재생) 아이콘을 클릭한 다음 밸브 드라이버에서 Start(시작)를 클릭하여 냄새 펄스를 트리거합니다.

블랭크 대조군인 L-아르기닌을 기록하기 시작한 다음 저농도에서 고농도로 냄새 물질을 기록하기 시작하여 도포 사이에 여과수를 2분 동안 플러시합니다. 행동적으로 활동적인 분획을 식별하려면 성적으로 성숙한 암컷 갯벌을 미로의 방출 케이지에서 5분 동안 적응시킵니다. 갯벌을 풀어주고 각각 강물을 포함하는 실험 및 제어 수로에서 칠성장어가 10분 동안 보내는 누적 시간을 기록합니다.

다음으로, 5분 동안 분당 200밀리리터의 일정한 속도로 연동 펌프를 사용하여 차량의 무작위로 할당된 실험 채널에 테스트 자극을 제어 채널에 적용한 다음 추가로 10분 동안 차량에 테스트 자극을 적용하고 lamprey가 실험 및 제어 채널에서 소비하는 누적 시간을 기록합니다. 이 절차에서는 sephadex LH-20 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 활성 분획을 화합물로 추가로 정제합니다. 초기 이동상의 0.5 ml에서 샘플을 준비하여 클로로포름-메탄올 컬럼에 로드한 다음 메탄올 컬럼에 로드하고 활성 분획을 용리하여 화합물을 생성합니다.

HPLC의 초기 이동상에서 정제된 화합물을 용해하고 희석하여 밀리리터당 약 1마이크로그램의 10마이크로리터 용액을 형성합니다. 다음으로, 샘플 용액을 HPLC 바이알로 옮기고 HPLC의 자동 샘플러에 넣습니다. 샘플을 전기 분무 이온화 질량 분석기에 주입하고 크로마토그래피 질량 분석기를 사용하여 고분해능 전기 분무 이온화 질량 분석기 스펙트럼을 기록합니다.

선택한 중수소화 용매에 샘플을 완전히 용해시켜 밀리리터당 약 0.1 - 10밀리그램 범위의 농도를 가진 용액을 형성합니다. 샘플 용액을 NMR 튜브로 옮겨 900메가헤르츠 NMR 분광계에 1D 및 2D NMR 스펙트럼을 기록합니다. 여기에 표시된 것은 600MHz NMR 분광계입니다.

5개의 새로운 것으로 추정되는 바다 칠성장어 페로몬이 확인되었으며 그 구조는 분광 및 분광 방법으로 설명되었습니다. 이러한 추정 페로몬은 성인 갯벌 후각 상피를 자극했으며 전기 후각 사진 기록에서 검출 역치가 낮았습니다. 두 가지 선택 미로 행동 분석에서 배란된 암컷 갯벌은 Petromyzone A, Petromyzene A 및 Petromyzene B에 유인되고 Petromyzone C에서는 격퇴되었습니다. 이 학제 간 절차를 시도하는 동안 이 반복적인 프로토콜을 수행하기 위해 화학 및 생물학적 실험을 조정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 X선 결정학 및 유도체화 반응과 같은 다른 방법을 수행하여 화합물의 입체화학과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 천연 제품 및 신경 행동학 분야의 연구자들이 칠성장어와 같은 수생 생물에서 페로몬의 그럴듯한 생합성과 생물학적 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 시약을 취급하는 동안 항상 화학 물질 후드에서 작업, 장갑 및 보안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.