Name: 빠른 Bioorthogonal 반응을 통해 변화 항 체 의약품의 세대에 대 한 정식이 아닌 아미노산의 유전자 인코딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 배우세요 사이클로프로펜 유도체를 이용한 항체-약물 접합체(ADC) 생성 방법을. HEK 세포 배양, 생물정합 반응, HPLC 및 LC-MS 분석 기법을 통해 고수율의 안정적인 접합체를 제조하는 프로토콜을 익히세요.

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이 작품은 영국 의료 연구 위원회에 의해 지원 되었다. 사운드 미 EMBO 친교 (ATLF 158-2016)를 보유 하 고 헤 펠 럼 및 지원, jw 메리어트 턱 및 G. 김, C. W. 모건과 O. Perisic 도움과 조언을 위해 감사.

1. 생산 및 항 체의 특성
<ol><li>항 체를 표현<ol>
<li>표현 매체와 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 250 ng/mL 암포 8% CO2 에서 37 ° C에서 셀 습도 incubators 장착 B. 유지 보충의 50 mL를 포함 하는 250 mL 플라스 크에 HEK 현 탁 액 셀의 유리병을 녹여 125 rpm에서 쉐를 커와 함께 Transfecting 전에 셀 0.3-0.5 x 106 셀/mL (2-3 일 마다)을 2 회 이상 분할.</li>
		<li>때 2.5 x 106 셀/mL의 조밀도 도달된 (2-3 일 분한 후), 100 mM CypK의 신선한 솔루션을 준비입니다. 이 목적을 위해 CypK의 64 밀리 그램의 무게, 복구 모든 소화 입자를 sonicate 내려 0.1 나트륨 수산화, 소용돌이, 스핀의 2.5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>항생제로 보충 하는 표현 매체의 42.5 ml CypK (0.1 M NaOH에 100 m m)의 2.5 mL를 추가 합니다. 잘 섞어, 0.1 M HCl의 250 µ L을 추가 하 고, 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독.</li>
		<li>HC 및 LC pKym1 플라스 미드21 감소 된 혈 청 매체와 2.5 mL를 50 µ g을 희석. 별도 튜브에 감소 된 혈 청 매체와 2.5 ml transfection 시 약의 135 µ L를 희석.</li>
		<li>솔루션을 준비 후 5 분 믹스는 플라스 미드와 transfection 시 솔루션 및 DNA와 transfection 시 사이 단지의 형성 수 있도록 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>한편, x 500g에 5 분 동안 대상 밀도에서 125 백만 세포를 원심, CypK를 포함 하는 표현 매체와 resuspend 고 DNA-transfection 시 혼합물을 추가 합니다. CypK 구입 하거나 이전18보고 합성 될 수 있습니다.</li>
		<li>20 h에 대 한 셀을 잠복기 후 transfection 시 강화 키트에 포함 된의 250 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>CypK (매체의 변화가 식은 동안 필요)의 추가 후에 표면에 뜨는 6-7 일에서 항 체를 수확. * 또는 높은 하 고 더 일관 된 수익률을 얻으려면, 안정적인 셀 라인 생성 될 수 있습니다 Oller 샐비어 외 에 설명 된 대로 201821. 이 경우에, trastuzumab(CypK)2 식 매체 m m CypK 5의 추가 의해 간단 하 게 표현 된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>항 체 정화<ol>
<li>3000 x g에서 15 분 동안 셀 원심</li>
		<li>필터는 0.45 또는 0.22 μ m 필터 상쾌한. 필터 차단 되는 경우 새로운 한 그것을 대체 하 고 필터링을 계속 합니다. 이 몇 밀리 리터 후 경우, 원심 7000 x g에서 추가로 15 분에 대 한 상쾌한.</li>
		<li>빈 폴 리 프로필 렌 크로마토그래피 칼럼에서 단백질 A 수 지 (2 mL/100 mL의 상쾌한)를 추가 하 고 비드 워시 버퍼 (0.1 M 인산 나트륨, 150 mM NaCl)의 적어도 5 볼륨 수 지 equilibrate.</li>
		<li>두 50 mL 원뿔 관으로는 상쾌한 분할 하 고 뒤에 미리 equilibrated 단백질 A 수 지 비드 워시 버퍼 (0.5 M 나트륨 인산 염, 150 mM NaCl) x 5를 추가 합니다. 풀 다운은 상쾌한에 항 체를 상 온에서 3 h에 대 한 롤러에 원뿔 튜브를 놓습니다. 또는: 수 지의 권장 량이 적어도 두 배 열에는 상쾌한을 추가 하 고를 통해 흐름을 허용. SDS 페이지 상쾌한에 남아 있는 항 체의 상당한 아니다 다는 것을 확인 하십시오. 있다면, 다시 한 번 수 지 통해 상쾌한 elute.</li>
		<li>열에는 상쾌한 수 지 단백질 A 전송 하 고 액체를 통해 흐름을 허용.</li>
		<li>워시 버퍼 (또는 적어도 10 수 지 볼륨) 25 mL를 추가 하 고를 통해 흐름을 허용.</li>
		<li>4 mL의 0.1 M 나트륨 구 연산 염, 3, 1 M 인산 염 버퍼, 150 mM NaCl의 1 mL에 pH와 항 체 elute</li>
		<li>PBS의 10 mL와 항 체 희석, 0.5-1 집중 원심 여과 및 exchange 버퍼 PBS 세 번 하 여 mL.</li>
		<li>FPLC 0.5 mL/min와 0-100의 흐름으로 부 틸 HIC 열을 사용 하 여 샘플을 정화 높은 소금 버퍼에 낮은 소금 버퍼 (50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 20% 소 프로 파 놀)의 30 분 기온 변화도 % (1.5 M (NH4)2등4, 50 m m 인산 나트륨 pH 7.0 5% 소 프로 파 놀). 모든 분수를 수집 하 고 모니터링 280에서 차입 nm. 소량 (< 1 mg) 수율 및 순도 최대화 하기 위해 2.4에 설명 된 조건에서 HPLC HIC와 정화 수 있습니다.</li>
		<li>포함 하는 항 체, PBS 가진 적어도 4 mL에 희석 원심 여과 및 교환 버퍼 PBS 세 번 하 여 집중 분수 풀.</li>
	</ol>
</li>
	<li>항 체를 계량<ol>
<li>280에서 흡 광도 측정 하 여 대략적인 농도 구하는 nm 마이크로 볼륨 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>정확 하 게 측정 해야 하는 경우 인간의 IgGs를 측정 하는 ELISA 키트를 사용 합니다. 대략적인 견적에 대 한 SDS 페이지 Coomassie 기반 얼룩으로 다음과 같이 사용.<ol>
<li>1 mg/mL에서 ELISA에 의해 계량 trastuzumab 표준 6 배 두 배를 diluting 하 여 표준을 준비 합니다.</li>
			<li>표준 및 샘플을 로딩 버퍼 줄이는 약 0.25 mg/mL에서 끓인 다.</li>
			<li>사용 하 여 4-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지에 그들을 실행 MES SDS 버퍼와 Coomassie 기반 염료와 얼룩. 마지막으로 빛 또는 무거운 체인 ImageJ를 사용 하 여 해당 밴드의 색상 밀도 측정 하 고 표준 곡선의 샘플에서 신호 보간.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° c.에 항 체를 저장</li>
</ol>2. 항 체 단백 결합 하 고 ADC를 특성화
<ol><li>Tetrazine-방위 분자와 항 체 켤레<ol>
<li>20 µ L의 이기와 작은 원뿔 튜브 (예를 들어,PCR 튜브)에 PBS의 76 µ L tetrazine-vcMMAE (4 µ L, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 3.4 m m)의 10 어 금 니 동등을 희석.</li>
		<li>Trastuzumab(CypK)2 (100 µ L, 2mg/mL PBS에)의 1 어 금 니 동등을 추가 하 고, 철저 하 게 혼합 trastuzumab(MMAE)2를 실 온 (25 ° C)에서 3 h 반응 허용. 참고: tetrazine-5-TAMRA 같은 다른 분자는 tetrazine-vcMMAE이이 프로토콜을 사용 하 여 대신 항 체에 연결할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ADC를 정화<ol>
<li>사전에 제조업체의 지침에 따라 PBS를 가진 크기 제외 스핀 열 equilibrate.</li>
		<li>스핀 열과 1 분 1500 x g에서 원심 분리기에는 반응의 전체 볼륨을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SDS 페이지 여 켤레를 분석 하 고 ADC를 계량<ol>
<li>1.3.2에 설명 된 대로 ADC를 계량. SDS 페이지에 빛 체인의 색상 밀도 측정 하 여 표준 곡선에 대 한 수정 되지 않은 항 체를 사용 하 여.</li>
		<li>무거운 사슬 한다 약간 이동 했다는 활용에 따라 분자 무게가 증가 보여주는. 참고: trastuzumab(TAMRA)2와 같은 fluorophore와 항 체를 수정 하는 경우만 해당 하는 무거운 체인 밴드 얼룩이 지기 전에 젤에 형광을 표시 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HPLC hic 공액 분석<ol>
<li>100% 버퍼 A와 HPLC HIC 열 equilibrate (1.5 M (NH4)2등4, 50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 5% 소 프로 파 놀) 5 분.</li>
		<li>혼합 15 µ L (67 pmol) trastuzumab (CypK) 2 15 µ L의 2 배와 1 mg/mL 해결책의 버퍼는 유리병에 A. 다음에 HPLC에서 10 µ L 주입 프로그램.</li>
		<li>1 분 뒤 15 분 그라데이션 100에서 버퍼 A b (50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 20% 소 프로 파 놀)의 0% 100% 버퍼 A와 isocratic 1 mL/min 흐름에서 elute. 280에서 차입 모니터링 nm.</li>
		<li>스 피크에 해당 각 종 하 고 다음 식을 결과 영역을 사용 하 여 통합 하 여 계산. DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2) /(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 , trastuzumab(MMAE)2) Trastuzumab(CypK)2 에 대 한 예상된 보존 시간 trastuzumab (CypK, MMAE)은 9.1-9.6 분, 그리고 trastuzumab(MMAE)2 는 10.5 11.0 분 7.5-8.0 분입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LC-MS에 의해 공액 분석<ol>
<li>Deglycosylate 30 µ L 1 mg/mL ADC 및 비 감소에 수정 되지 않은 항 체의 적어도 6 h 37 ° c.에 대 한 250 PNGase F 단위를 사용 하 여 조건</li>
		<li>항 체는 c 4에서 질량 분 서 계에 물에 2% ~ 80% 이기의 20 분 그라디언트를 사용 하 여 1-5 µ m 1.0 x 100 m m 열 elute. 콘 전압 150v의 긍정적인 이온 모드에서 350-4000의 m/z 범위 데이터를 취득.</li>
		<li>적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 원시 데이터 deconvolute 수정 하 고 수정 되지 않은 항 체 질량에서 차이 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 분석 결과 혈 청에서 Trastuzumab(TAMRA)2 Dihydropyridazine 링크의 안정성
<ol><li>무 균 조건 하에서 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 혈 청을 필터링 합니다. 100 단위/mL 페니실린, 및 100 μ g/mL 스를 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 외부 우물 물으로 채우십시오. 중앙 우물에서 0.1 mg/mL의 최종 농도에 PBS에 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 의 10 µ L로 필터링 된 혈 청의 triplicate 90 µ L에 혼합. 37 ° C와 4-5% CO2습도 포화 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>5 일, 피펫으로 각 전역 마다 24 시간 잘 철저 하 게 혼합, 5 µ L aliquot, 액체 질소, 플래시 동결과-80 ° c.에 저장</li>
	<li>일단 모든 샘플 수집 되어, 해 동이 aliquots 및 분석 간접적인 ELISA를 사용 하 여 이전으로 보고12 일부 수정:<ol>
<li>0.25 µ g/mL HER2 4 ° c.에와 하룻밤 96 잘 접시 코트 다른 모든 단계는 상 온에서 수행 됩니다.</li>
		<li>다음 날, PBS 0.05% 트윈 (PBS-T)와 5 번을 세척 하 고 1% 소 혈 청 알 부 민 1 h와 차단 합니다.</li>
		<li>세척 하 고 2 시간에 대 한 PBS에 1:10000 희석에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>세척 하 고 안티 TAMRA 항 체 1: 2000 PBS-T h 1에 대 한 0.5 %BSA에서 희석에서 마우스에서 품 어.</li>
		<li>세척 하 고 PBS-T h 1에 대 한 0.5 %BSA에서 반대로 마우스 HRP 어원이 1:1000를 품 어.</li>
		<li>TMB을 추가 하 고 5-10 분 반응 허용.</li>
		<li>그래서 50 µ H L2반응 중지 450에서4 1 M과 측정 흡 광도 nm. 570에서 측정 배경 빼기 nm.</li>
		<li>표준 희석에 4-매개 변수 로지스틱 회귀 곡선을 적합 하 고 샘플에서 측정을 보간. 참고: trastuzumab(MMAE)2 의 안정성 수 부과 상업 ELISA 키트 3.3에서 설명 하는 분석 결과 변경 하 여 동일한 프로토콜을 사용 하 여 ADC의 농도 측정 하.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ADC의 세포 독성 평가
참고:이 프로토콜은 이전에 보고 된 분석 실험23,26 일부 수정에 기반.
<ol><li>SK-BR-3 및 MCF-7 셀 thaw 고 10% 열 보충 DMEM 비활성화 소 태아 혈 청, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 µ g/mL 스 완전 한 매체를 포함 하는 것은 즉 p25 플라스 크에 정착 하도록 허용.</li>
	<li>80-90% 합류 (매 3-4 일) 분석 결과 전에 적어도 2 번에 셀을 분할 합니다.</li>
	<li>분석 결과, 이전 2 일 96 잘 접시의 외부 우물 물을 채우십시오. 0.5 m EDTA, 분리기 250g x 3 분 m에서 0.05 %trypsin 리프트 셀 새로운 매체에 resuspend 그리고 3000 셀 (빈) 잘 96 잘 접시에서 당 100 µ L 씨.</li>
	<li>셀, 시드 후 2 일 완전 한 매체에서 0.1 %DMSO 3 중에서 모든 샘플의 10 연속 희석을 준비 합니다. 다음 샘플 및 컨트롤을 고려 하십시오: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab 야생 타입, tetrazine vcMMAE, MMAE.</li>
	<li>각 잘에서 각 샘플의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C와 4-5% CO2에서 5 일 동안 품 어.</li>
	<li>5 일에 세포 생존 능력을 측정 합니다. 이 위해 상업 키트를 사용 하 여 세포를 lyse 발표 ATP 측정을. 0.1 %DMSO 치료 하는 제어 셀 기준 신호 백분율을 플롯 합니다. 참고: Adc 혈 청에서 5 일 동안 알을 품을 고 기능 안정성을 증명 하기 위해 세포 독성에 대 한 분석 될 수 있습니다. 주의: MMAE은 매우 독성이 있습니다. 따라서 사용 장갑 및 고글 MMAE 파생 상품을 취급 합니다. 사용 하는 경우 수정 되지 않은 MMAE 컨트롤로 실험에서 DMSO에 재고 솔루션을 준비할 때, 증기 두건 안쪽 고체 제품을 처리 합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 설명 하는 trastuzumab(CypK)2 를 생산 하기 위해 과도 식 절차 간단 하 고 높은 모듈화에 대 한 수 있습니다. 획득 수익률은 학문 설정27 에서 예상 하는 것 고 안정적인 셀 라인 추가21의 생산 수율 향상을 생성할 수 있습니다. 식, 동안 CypK의 농도가 낮은 5 m m 낮은 ncAA 법인으로 발생할 수 있습니다 보다 더 높은 금액 세포 성장에 영향을 줄 수 있으며 항 체 생산량 감소. CypK 무료 아미노산으로는 낮은 물 가용성, 따라서 그것은 해야 될 처음 녹 0.1 M NaOH에 100 m m이 고 문화 매체에 추가. 매체에서와 셀에 추가 하기 전에 CypK를 diluting, 후 소독 HCl와 필터 매체를 중화에 중대 하다. 그 후, transfection 시 약을 사용 하 여이 프로토콜에 지정 된 이며 제조 업체에서 권장 보육 시간에 따라 높은 항복 식에 대 한 중요 한. 에 대 한 추가 내용은 인간 항 체의 과도 식, 독자가 다른 게시 된 프로토콜31,32이라고 합니다.
항 체 정화 때 단백질 A 수 지의 높은 초과 전체 항 체 풀 다운은 상쾌한에서 되도록 표시 필요 합니다. 방지 하기 위해 차입 중 trastuzumab의 강수량, 높은 용량, PBS와 즉시 희석 버퍼링 솔루션을 사용 하 여 과도 한 집중을 피하고 버퍼 교환 추천입니다. 항 체를 항상 유지 < 5 mg/mL.
Tetrazine-vcMMAE와 trastuzumab(CypK)2 의 활용은 Adc에 대 한 다른 bioorthogonal 핸들을 보고 대부분 반응 보다 빠릅니다. 또한,이 cycladdition 매우 온화한 조건에서 발생 합니다: 실내 온도 또는 낮은 및 생리 적 pH. PBS와 항 체;의 추가 이전 이기와 반응의 DMSO 재고 솔루션을 희석 하는 것이 중요 하다 그렇지 않으면 tetrazine 파생 상품 침전 됩니다. 이기는 MMAE와 TAMRA, 높은 hydrophobicity 때문 에서만 필요 하지만 적은 소수 성 분자의 공동 용 매 추가 필요 하지 않을 수 있습니다. 또는 tetrazine vcMMAE 이기와 단 2 어 금 니의 tetrazine-vcMMAE 20 h 이내 없이 활용 될 수 있습니다. 이 작은 양의 독 소의 ADC 현재 ncAA 기반 기술에 비해 제조 비용에서 상당한 감소를 포함할 수 있었다. Trastuzumab(CypK)2 는 4 ° c.에 보존 하는 때 적어도 4 개월 동안 완전히 반응
HPLC HIC MMAE 매우 소수 이며, 0, 1 및 2 독 항 체 어원이 같은 말에 해당 하는 봉우리의 뛰어난 해상도 제공 합니다 이후 다 르의 정확한 결정을 수 있습니다. Unreacted tetrazine-vcMMAE 13.7 분 약을 elutes 고 280에서 감지 되 면 nm. 이 기술은 높은 순수성을 가진 시작 물자를 요구 한다. 또한, 그것 때문에 그들은 보존 시간과 봉우리의 모양을 변경할 수 있는 BCN-오 등 다른 tetrazine-반응성 분자와 반응을 풀기 위해 추천 되지 않습니다. 그것은 샘플의 소금 농도 맞는 모바일 단계에 하나 그라데이션의 시작에 좋은 분리를 얻기 위하여 10-20 µ L 주입 하는 경우에 특히 중요.
LC MS 분석에 대 한 항 체 샘플의 deglycosylation는 원시 스펙트럼의 deconvolution 시 단일 피크를 얻을 필요 합니다. 총 항 체와 ADC의 정확도 악기의 callibration에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 수정에 대 한 질량을 계산 하기 위해 ADC에 대 한 얻은 것에서 수정 되지 않은 항 체에 대 한 얻은 질량을 뺍니다. 현대 고해상도 질량 분석기는 1:10000 아래 상대적 오류를 제공 해야 합니다. LC MS 다른 종 사이의 비율을 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다, 있지만이 값은 일반적으로과 수정 생성 된 종의 이온화 용량에 영향을 미칠 수 있기 때문에 낮은 양의 불순물 감지 되지 않을 수 있습니다.
약물의 조기 출시 높은 독성과 낮은 효능;에서 발생 하기 때문에 Adc에서 링커의 안정성은 중요 한 무료 cytotoxin 건강 한 조직을 손상 하 고 벌 거 벗은 항 체 병 셀에 대상 바인딩 사이트에 대 한 무장 한 경쟁 한다. 안정성 분석 결과의 가변성은, 5% 아래 릴리스 예상 되어야 한다.
마지막으로,와 같은 trastuzumab(MMAE)2 SK-BR-3 셀 (HER2 높은)에서 세포 독성을 비교 하 여 평가 될 수 있습니다 후자의 이후 MCF-7 세포 (낮은 HER2) 표현 전28 보다 적은 15 HER2 수용 체 HER2를 표적으로 하는 ADC의 선택도 . immunoconjugate 2 배나 SK-BR-3 MCF-7에 비해 낮은 세포 생존 능력으로 발생 하는 것으로 예상 된다. SK-BR-3에서 EC50 이 ADC29,30의 높은 힘을 반영 하는 두 자리 nanomolar 범위에 있어야 합니다. 수정 되지 않은 항 체 trastuzumab(MMAE)2 또는 trastuzumab,이 분석 결과에 아무 독성을 표시 해야 합니다. Tetrazine-vcMMAE peptidomimetic 독 소의 활동을 제거 하는 링커 이후는 효과가 3 배나 ADC 보다 낮은 있어야 합니다. 반대로, MMAE 세포 막30침투를 수 있기 때문에, 그것은 야 ADC에 유사한 독성 하지만 HER2 높은 HER2 낮은 셀 라인 사이 차별 표시. 또한,이 분석 결과 혈 청에서 ADC의 5 일 배양 후 수행 하는 경우 사용할 수 있습니다 링커의 안정성의 기능 증거를 제공 하기: 릴리스 독 소의 결과 중에 SK-BR-3에서 ADC 효율 감소 MMAE p로 릴리스 되었습니다 하는 경우 링커 또는 링커 traceless 방식에서 죽 습 했다 경우 선택도 감소의 예술.
여기에 설명 된 ADC 기술 IgG1s에 신의 cyclopropene 파생의 효율적이 고 사이트 설립이 있습니다. 손쉬운 정화 다음 항 체 빠르게 tetrazine 포함 된 분자로, 동종 제품 저조한 활용 될 수 있습니다. 작은 크기 및 cyclopropene 최소 핸들의 높은 반응성 때문에이 방법은 sterically 방해 페이로드의 활용을 사용 해야 합니다. 결과 immunoconjugates은 혈 청에서 안정 되며 매우 강력 하 고 선택. 전반적으로, CypK 항 체 및 치료 또는 진단에 사용 될 다른 단백질 어원이 같은 말, 사이트별 빠르고 안정적인 bioorthogonal 결합을 수 있습니다.

마약 항 체 어원이 같은 말 (Adc) biotherapeutics의 선택도 및 작은 세포 독성 분자의 힘을 결합 한다. 대부분의 Adc는 암 세포1DNA 또는 microtubule 중 합에 영향을 주는 약물을 대상으로 전통적인 화학 요법의 부작용을 감소 하고자 합니다. 식품의 약 청 (FDA)에 의해 승인 세대 Adc 감소 pharmacokinetic 속성2다른 위치에 분자의 혼합물을 생성 하는 lysines 및 시스테인, 수정에 의존 합니다. 대조적으로, 항 체 약품의 사이트 활용 향상 된 치료 indeces3,4화합물을 생성할 수 있습니다. 균질 Adc를 생산의 문제 해결을 추구, 몇 가지 선택적 화학과 효소 수정을 보고1,5되었습니다. 그러나, 현재 방법 수 대상 항 체에만 특정 위치, 낮은 단백질 표정에서 고통을, 낮은 안정성, 링커 제공 또는 느리고 낮은 저조한 반응에 의존.
유전자 코드 확장을 통해 비정규 아미노산 (ncAA)의 수 있습니다 잠재적으로 생성 하는 데 사용 하는 다른 방법의 한계를 극복 하는 단백질으로 bioorthogonal 반응 그룹의 과다의 사이트별 설치를 Adc입니다. 인코딩 대상 (중지) 코 돈에 대응에서 ncAAs 정식 아미노산6통합 생 쌍을 직교 하는 aminoacyl-tRNA 합성/tRNA 쌍에 의존 합니다. 여러 ncAAs Adc 생성 항 체에 통합 되었습니다. 그러나, 가장 치료 약물 활용에 응용 프로그램에 대 한 다양 한 부채에서 고통. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 아니다 완전히 bioorthogonal, 낮은 pH (4.5)와 긴 반응 시간 (> 60 h), p-azidophenylalanine (pAzF)7,,910, 등 azides 동시에 요구 p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11및 lysine (AzK)12,13 의 아 지 드 파생 셀14에서 감소 될 수 있습니다 및 Huisgen cycloadditions를 촉매 하는 데 사용 하는 구리 산화 손상을 일으킬 수 있다 15.
대체 ncAAs 트랜스-cyclooctene (TCO)에 따라, cyclooctyne (SCO)와 bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) 최근 인코딩되어 항 체에 바이오 이미징 목적, 표현 시스템 매우 낮은 수율 (0.5 mg/L)16에서 겪고 있다. 또한, cyclooctenes와 cyclooctynes는 큰 및 집계-ADC 페이로드에 대 한 ADC의 민감성을 증가 시킬 수 있습니다 소수 성 처리는 전통적으로 소수 링커의 물리 화학적 특성을 크게 표시 되었습니다. 약 동학 및 치료 인덱스17영향. 대조적으로, 1, 3-disubstitued cyclopropenes은 작은 반응 그룹 단백질 구조와 physichochemical 속성18에 최소한의 변경 발생입니다. Cyclopropenes 역 전자-수요 Diels 오리 나무 cycloaddition19통해 tetrazines와 선택적으로 그리고 급속 하 게 반작용 한다. 이 프로토콜에서 우리가 만드는 작은 메 틸 cyclopropene 더 큰 긴장된 불포화 주기 보다 입체 방해에 의해 영향을 하 고 1-30 M-1의 순서 반응 속도 상수 lysine (CypK, 그림 1b) 베어링의 파생의 사용 -1 수성 미디어18,20에서.
우리는 최근 CypK tetrazine 베어링 분자21이 최소 bioorthogonal 핸들 반응 하 여 Adc를 생성 하는 항 체로 통합 하는 방법을 했다. 여기는 가장 어려운 단계에 중점을 두고 좀 더 자세하게 ADC 준비 절차에 설명합니다. CypK의 pyrrolysyl-tRNA 합성 (PylRS)를 사용 하 여 이동은 / tRNACUA(PylT) 쌍 항 체 무거운 사슬에 도입 하는 호박 codon에 대 한 응답에서 (HC)22. 여기 두 개의 플라스 미드 사용 하 여 (그림 1a) 과도 transfection, 하나는 항 체의 무거운 체인 인코딩 인코딩 모두 포함 된 PylRS/PylT 카세트 빛 체인 (LC), 다른 하나에 대 한. 또는, 더 높은 항 체 수익률을 가능 하 게 안정적인 셀 라인21더 힘 드는 절차 통해 생성할 수 있습니다.
상기 식 시스템 1 (IgG1) 치료 안티 HER2 면역 글로불린을 생산할 수 있는 trastuzumab 야생 유형 항 체를 비슷한 수준에서 CypK와 함께. 우리는 ncAA (HC-118TAG)를 인코딩하는 데 무거운 체인 CH1 도메인의 첫 번째 위치를 선택. 하지만 이것은 Adc23 에 가장 일반적으로 수정 된 사이트와 HC-118 (EU 번호)로 알려져 있다 되었습니다 라고도 HC-121 (시퀀스 위치)와 HC-114 (Kabat 번호)24. 이 위치는 모든 IgG1s에 걸쳐 보존은, 이후 이러한 식 시스템 의무가 가장 치료 항 체 이어야 한다입니다.
우리는 trastuzumab(CypK)2 수 쉽게 순화 될 단백질에 의해 한 뒤 소수 성 상호 작용 열 (FPLC-HIC)와 고속 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 표시. 그 후 항 체 covalently microtubule 중 합 억제제 monomethyl auristatin E (MMAE), FDA 승인 ADC Adcetris에서 사용 되는에 3 h 이내 연결 된다. 여기 우리가 사용 MMAE (tetrazine-vcMMAE)의 벤 질 tetrazine 파생 링커 glutarate 스페이서 및 valine 시트 룰 린 효소 정한 구성 요소 뒤에 p-aminobenzylalcohol self-immolative 단위; 이 링커는 독 소25traceless 릴리스 결과 ADC의 국제화에 따라 리소좀에 Cathepsin b 죽 습. 반응의 광범위 한 범위를 보여, 항 체는 또한 fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA)에 연결 됩니다. 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC-MS)를 결합 하 여는 공액의 정체성을 확인 하 고 소수 성 상호 작용 열 (HPLC-HIC)와 고성능 액체 착 색 인쇄기를 사용 하 여 약물을 항 체 비율 (DAR)을 계산 하는 방법을 설명합니다 .
항 체 성능 특성화의 일환으로, 우리는 인간의 혈 청에 dihydropyridazine 연결의 안정성을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 간단한 ELISA에 의해 정해질 수 있습니다 및 결과의 해석 하지 trastuzumab(MMAE)2의 효소 정한 구성 요소에 의해 복잡 하 게 하기 때문에이 매개 변수는 더 쉽게 trastuzumab TAMRA에 평가 됩니다. 마지막으로, 선택도 및 trastuzumab(MMAE)2 의 힘 HER2의 다른 레벨을 표현 하는 셀 라인에 걸쳐 ADC의 cytoxicity를 비교 하 여 평가 됩니다. 이 분석 결과 인간의 혈 청에 immunoconjugate 잠복기 후 수행 하는 경우 ADC 안정성의 기능 증명을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Expi293F</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14527</td><td>HEK 현탁 세포</td></tr><tr><td>Expi293 발현 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1435101</td><td>발현 매체</td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B</td></tr><tr><td>125mL 폴리카보네이트 삼각 플라스크(벤트 캡 포함</td>) <td>Corning</td><td>431143</td><td>플라스크를 흔듭</td></tr>니다<tr><td>Brunswick S41i 인큐베이터</td><td>Eppendorf</td><td>S41I230011</td><td>CO2 인큐베이터 쉐이커가 있는</td></tr> 수산화<tr><td>나트륨 4 mol/l (4 N) in aqueous solution VWR</td><td></td><td>191373M</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopropene lysine</td><td>Sichem</td><td>SC-8017</td><td>이 연구에서는 Elliot et al. 2014</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0.22 &micro; m, 폴리에테르설폰, 감마선 조사</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, 저감 혈청 배지</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>환원 혈청 배지</td></tr><tr><td>ExpiFectamine 293 트랜스펙션 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14525</td><td>트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>5810 R 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5811000460</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 주사기 필터 장치, 0.22 &마이크로; m, 폴리에테르설폰, 33mm, 감마 멸균</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A 수지</td><td>Sino Biological</td><td>10600-P07E-RN-25</td><td></td></tr><tr><td>폴리프렙 크로마토그래피 컬럼, 50</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼</td></tr><tr><td>패키지 Econo-Column Funnel</td><td>Bio-Rad</td><td></td> 7310003 <td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Fluka</td><td>71635</td><td></td></tr><tr><td>&오믈; KTA 탐색기 FPLC</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiTrap HIC 선택 키트</td><td>GE 헬스케어</td><td>28-4110-07</td><td>HiTrap 포함 1 mL 부틸 HP</td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>VWR</td><td>2133.296</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Honywell</td><td>34863-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>테트라진-vcMMAE</td><td>ChemPartner</td><td>-</td><td>Costum synthesized</td></tr><tr><td>Tetrazine-5-TAMRA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-017-05</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 &마이크로; m</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>088553</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England BioLabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>NanoAcquity</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4 BEH 1-5 &마이크로; m 1.0 x 100mm UPLC 컬럼&nbsp;</td>세포 배양을 위한 <td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 마이크로플레이트</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>Human serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-20mL</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HER2</td><td>ECD Sino Biological</td><td>10004-HCCH</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TAMRA</td><td>Abcam</td><td>an171120</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse HRP</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>TMB</td><td>BioLengend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar FS</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>플레이트 리더</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>CellTiterGlo 2.0 Assay</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>세포 용해 후 방출된 ATP 측정을 기반으로 한 세포 생존율 분석. 출력 신호는 발광입니다.</td></tr><tr><td>Monomethyl Auristatin E</td><td>Cayman Chemical</td><td>16267</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>미량 분광 광도계</td></tr><tr><td>인간 IgG ELISA Quantificaiton 세트</td><td>Bethyl</td><td>E80-104</td><td></td></tr><tr><td>MaxEnt1 in MassLynx</td><td>Waters</td><td></td><td>소프트웨어 애플리케이션 질량 스펙트럼 디콘볼루션</td></tr><tr><td>IntantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Coomassie 기반 염색</td></tr><tr><td>온전한 MMAE-ADC ELISA 키트(샌드위치 분석)</td><td>Epitope Diagnostics, Inc.</td><td>KTR 782</td><td></td></tr><tr><td>튜브 50 mL, 114x28mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>원뿔형 튜브</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 장치 50,000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td>원심 여과 농축기(단백질 A 풀다운 후)</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 원심 필터 장치 50,000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC805024</td><td>원심 여과 농축기(FPLC 또는 HPLC 정제 후)</td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼, 7K MWCO, 0.5mL</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>89882</td><td>크기 제외 스핀 컬럼</td></tr><tr><td>튜브 PCR 0.2ml 플랫 캡</td><td>시슬 사이언티픽 주식회사</td><td>AX-PCR-02-C-CS</td><td>PCR 튜브</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp&ordf; 플랫 바텀</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>44-2404-21</td><td>ELISA용 플레이트</td></tr></tbody></table>

빠른 bioorthogonal 반응을 통해 변화 항 체 의약품의 세대에 대 한 정식이 아닌 아미노산의 유전자 인코딩

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

마약 항 체 어원이 같은 말 (Adc) 임상 연습에서 현재 사용 되는 여러 다른 위치에서 독에 연결 하는 항 체 분자의 혼합물. 전 임상 연구 치료 인덱스 이러한 전통적인 Adc의 독 소의 사이트 연결 향상 시킬 수 있습니다 나타났습니다. 그러나, 현재 접근 균질 Adc를 생산 하는 낮은 단백질 표정, 느린 반응 속도 론 등 여러 제한이 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 항 체 유전자 코드 확장을 사용 하 여에 리 (CypK)의 cyclopropene 파생을 통합 하는 식의 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다. 이 최소한의 bioorthogonal 핸들 역 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition 통해 tetrazine 파생 상품의 급속 한 활용 가능 여기 보고 식 시스템에 손쉬운 생산과 trastuzumab 무거운 체인의 각 CypK 베어링의 정화 수 있습니다. 우리는 독 소 monomethyl auristatin 전자에 항 체를 연결 하 고 소수 성 상호 작용 착 색 인쇄기 질량 분석에 의해 immunoconjugate를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 활용에서 발생 하는 dihydropyridazine 결합의 인간 혈 청에서 안정성을 평가 하 고 HER2 수용 체의 상부를 가진 유방암 세포에 대 한 ADC의 선택적 세포 독성 테스트 분석을 설명 합니다.

보고 된 과도 식 시스템 (그림 1a) 22 ± trastuzumab(CypK)2 (그림 1c) 동일한 조건 하에서 생산 하는 야생 타입 항 체의 2/3를 대표 하는 문화 매체의 리터 당 2 밀리 그램을 생성 합니다. 안정적인 셀 라인 31 ± 2mg/L21까지이 수익률을 높일 수 있습니다.
Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-vcMMAE, 이며 25 ° C (그림 2)에서 3 h 이내 즉 균질 trastuzumab(MMAE)2 와 함께 활용 될 수 있습니다. 이 cytotoxin의 높은 hydrophobicity 10% 이기 때 5의 추가 또는 CypK 당 독 소의 어 금 니 등가물을 더는 데 사용 됩니다. 또는, cycloaddition는 또한 20 h 2 등가물 tetrazine vcMMAE 이기 (그림 2c) 없이를 사용 하 여 내 완료 됩니다. Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-25 ° C에서 2 시간 이내 TAMRA 반응 하 고 온도 4 ° C (그림 3c)을 감소 하는 경우 3-6 h는 필요.
Trastuzumab(MMAE)2 HPLC hic 측정에 대 한 예상된 DAR은 1.9 (그림 2b). 8.0 분 크로마에서 처음 관찰 된 피크 결합형된 항 체 (DAR 0) 나타내고, 반응이 완료 되 면 완전히 사라진가지고 해야 합니다. 9.1-9.6 분 elutes 고 3 h; 후 지역 &lt; 10% 있어야 합니다 스 1 종 그리고 스 2 대상 제품은 10.5-11.0 예상된 지역 &gt; 90%의 보존 기간. 이동성 변화와 SDS 페이지 젤에 형광 TAMRA (그림 3b)의 설립은 immunoconjugates의 정체와 LC-MS (그림 2d-e 및 그림 3d)에 의해 확인 된다 확인 합니다.
인간의 혈 청 ELISA 후속 분석에서 5 일 동안 trastuzumab(TAMRA)2 의 부 화를 페이로드 (그림 4b) 항 체에 연결 된 남아 확인 합니다. Trastuzumab(MMAE)2 는 SK-BR-3 (높은 HER2) 가슴에 높은 힘 55 ±의 절반 최대한 효과적인 농도 (EC50)와 암 세포, 세포 독성 분석 결과에 대해서 오후 10 시 (그림 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 인간의 혈 청 (그림 4c)에서 보육의 5 일 후는 세포 독성을 유지합니다. 반대로, ADC MCF-7 (HER2 낮은) 분석은 EC50 은 200-fold (그림 4 d) 낮은. 야생 유형 항 체, trastuzumab(CypK)2 , tetrazine-vcMMAE MMAE 두 셀 라인 (그림 4e)에서 높은 비 선택적 세포 독성을 표시 하는 반면 (그림 4 d 및 4e), 매우 낮은 독성을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig1.jpg"> 그림 1: 과도 식 시스템. A. 과도 transfection HEK293 세포에서 사용 하는 플라스 미드의 관련 지역. CMV: 세포 발기인, WPRE: 마 간염 바이러스 Posttranscriptional 규제 요소, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: 특정 발기인, PylRS: pyrrolysil tRNA 합성, &gt;와 &lt;: 전사의 방향. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. 식 야생 타입 (WT) trastuzumab의 있고 trastuzumab(CypK)2 로 측정 된 서쪽 오 점 단백질 후는 정화 있습니다. 오차 막대는 생물 triplicates의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig2.jpg"> 그림 2: tetrazine-vcMMAE와 trastuzumab(CypK)2 의 활용. A. 항 체에서 CypK 잔류물 및 MMAE의 tetrazine 파생 사이 역 전자 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition. 반응 그룹은 빨간색으로 강조 표시, p-aminobenzylalcohol 녹색 파란색에서 valine 시트 룰 린 dipeptide 묘사 이다. B. HPLC HIC chromatograms 항 체의 활용의 진행률을 표시. 1.9 다른 시 약 농도 사용 하 여 최대 스 기준 변환의 C. 정도. D-e. 전후에 활용 전체 길이 항 체의 질량 스펙트럼을 deconvoluted. Trastuzumab(CypK)2 는 안정적인 셀 라인을 사용 하 여 얻은 했다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig3.jpg"> 그림 3: trastuzumab(CypK)2 tetrazine TAMRA의 활용. A. 항 체에서 CypK 잔류물 사이 TAMRA의 tetrazine 파생 역 전자 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition. B. SDS 페이지 젤 기동성 교대 TAMRA의 활용에 의해 발생 하는 젤에 형광을 보여주는. C. 활용 론 2 개의 다른 온도에. D. trastuzumab(TAMRA)의 질량 스펙트럼을 Deconvoluted2. Trastuzumab(CypK)2 는 안정적인 셀 라인을 사용 하 여 얻은 했다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig4.jpg"> 그림 4: 혈 청 및 세포 독성 trastuzumab 어원이 같은 말의 안정성. A. internalizing ADC에 원하는 기능을 강조 하는 만화. B. 인간의 혈 청 ELISA에 측정에서 trastuzumab(TAMRA)2 의 안정성. C. 인간의 혈 청 (+ 혈 청, 블랙) 5 일 후에 생존 능력 분석 결과 trastuzumab(MMAE)2 셀. 컨트롤 샘플 혈 청 대신 PBS에서 incubated (-혈 청, 적색) 동일한 분석 결과에 포함 됐다. D. 세포 생존 능력 분석 결과 갓 희석된 항 체 샘플. E. 세포 생존 능력 분석 결과 갓 희석된 MMAE 파생 상품. 오차 막대 3 독립적인 실험의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

항 체에 신의 cyclopropene 파생 통합 tetrazine 베어링 분자 생성 항 체 약물 어원이 같은 말의 사이트별, 신속 하 고 효율적인 결합 수 있습니다.

빠른 Bioorthogonal 반응을 통해 변화 항 체 의약품의 세대에 대 한 정식이 아닌 아미노산의 유전자 인코딩

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

이 방법은 단백질 변형 분야에서 중요한 도구를 제공하여 항체 약물 공물의 촉진적이고 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 취급의 용이성, 항체 생산의 높은 수율, 정신 작용 반응의 속도 및 형성된 연결의 안정성입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HEK 서스펜션 셀이 증가함에 따라 이 절차를 시작합니다.밀리리터당 250만 개의 세포밀도가 도달하면, 수산화나트륨 1개에서 리신 또는 CpK의 사이클로프로펜 유도체의 신선한 용액을 준비한다. 항생제로 보충된 발현 매체에 CpK의 2.5 밀리리터를 추가합니다. 용액을 잘 섞고 하나의 어금니 HCl250 마이크로리터를 추가한 다음 22 마이크론 필터를 사용하여 용액을 살균합니다.이제 원심 분리기 1억 2,500만 개의 세포가 500 x g에서 5분 동안 목표 밀도로 합니다. 원심분리에 따라, CPK를 함유하는 발현 배지에 DNA-트랜스퍼션 시약 혼합물을 추가하고 이 배지를 사용하여 세포를 재일시 중단한다. CpK를 첨가한 후 6~7일 후, 3, 000 x g에서 15분 동안 세포를 원심분리하여 상피품으로부터 CpK 항체를 베어링하는 트라스투주맙을 수확한다.그런 다음 상체를 필터링합니다. 이제 250 밀리리터 원모형 튜브에 5배 의 비드 워시 버퍼를 추가하고 상체와 혼합하고 미리 보정된 단백질 A 수지를 추가합니다. 원문 튜브를 실온에서 3시간 동안 롤러에 놓고 항체와 상체를 끌어당깁니다.인큐베이션에 이어, 단백질 을 트랜스넘비로 체상화된 수지컬을 컬럼으로 옮기고 액체가 흐르도록 한다. 그런 다음 25 밀리리터의 세척 버퍼를 추가하고 이를 통해 흐르도록 합니다. 1개의 어금니 인산염 완충제 1밀리리터, 150 밀리머 나트륨 염화나트륨을 수집 튜브에 넣고 1개의 굴어 나트륨 pH 3의 4밀리리터로 항체를 엘테.산성 용액은 수집 튜브에 이미 존재하는 기본 용액에 의해 컬럼에서 벗겨지면서 즉시 중화됩니다. 다음으로, PBS의 10 밀리리터로 항체를 희석시. 항체를 원심 여과에 의해 5~1밀리리터로 농축하고 PBS로 완충제를 세 번 교환한다.30분 이상 높은 염완충액에서 저염 버퍼의 0 내지 100% 그라데이션을 가진 부틸 소수성 상호작용 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 샘플을 정화합니다. 모든 분획을 수집하고 280 나노미터에서 용출을 모니터링합니다. 원심 여과에 의해 항체를 포함하는 분획을 농축하고 PBS로 완충제를 세 번 교환한다.항체는 섭씨 4도에서 저장될 수 있습니다. 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 MMAE는 매우 독성이 있습니다. 따라서 MMAE 유도체를 취급할 때 장갑과 고글을 사용하십시오.수정되지 않은 MMAE를 컨트롤로 사용하는 경우 MSO에서 스톡 솔루션을 준비할 때 연기 후드 내부의 고체 제품을 처리하십시오. 테트라진 베어링 분자로 항체를 결합하기 위해, 작은 원추형 튜브에 아세토닐릴20 마이크로리터와 PBS의 76 마이크로리터로 항체 당 테트라진 MMAE의 10개의 어금니를 희석시한다. CPK베어링 트라스투주맙과 동등한 1개의 어금니를 추가합니다.철저하게 혼합하고 MMAE에 연결된 trastuzumab을 형성하기 위해 실온에서 3 시간 동안 반응 할 수 있습니다. MMAE 이외의 분자는 잠재적으로 더 크고 더 sterically 방해가 이 프로토콜을 사용하여 항체에 연결될 수 있다. 1분 동안 1500 x g의 스핀 컬럼과 원심분리기에 반응의 전체 볼륨을 추가합니다.컨쥬게이트를 분석하려면 HPLC HIC 컬럼을 100% 높은 염전 버퍼로 5분간 상위화합니다. 그런 다음 MMAE에 연결된 trastuzumab의 밀리리터 용액 당 1밀리그램의 15 마이크로리터를 유리병에 2X 고염 완충제 15마이크로리터와 혼합합니다. 혼합물을 HPLC 컬럼에 삽입합니다.1분 동안 100% 높은 소금 버퍼를 가진 밀폐식 1밀리리터의 엘루테. 낮은 소금 버퍼에서 높은 염완충제의 100에서 0 %까지 15 분 그라데이션으로 이 것을 따르십시오. 280 나노미터에서 용출을 모니터링합니다.크로마토그램의 피크를 각각 0, 1, 2개의 접합독소로 trastuzumab에 해당하는 7.5, 9.2 및 11.5분의 고정 시간과 통합합니다. 이제 1의 무게를 가지고 9.2 분에 피크의 영역을 추가하고, 두 개의 무게를 가지고 10.5 분에 DAR를 계산하고, 세 봉우리의 총 영역으로 분할. LC-MS에 의해 컨쥬게이트를 분석하기 위해 먼저, 밀리리터 ADC당 1밀리그램의 30마이크로리터와 37°C에서 최소 6시간 동안 PNGase F 250단위를 사용하는 비환화 조건에서 수정되지 않은 항체를 탈수하게 한다.혈청을 해동하고 22 미크론 필터를 통해 필터링합니다. 그런 다음 96 웰 플레이트의 외부 우물을 물로 채웁니다. 중앙 우물에서, 트리플리케이트 90 혈청의 마이크로 리터와 10 밀리리터 당 1 밀리그램의 마이크로 리터 PBS에서 1 밀리 그램의 최종 농도에서 밀리리터 당 1 밀리그램.습도가 포화된 인큐베이터에 플레이트를 섭씨 37도, CO2 4%로 배치합니다. 5일 동안 24시간마다 파이펫을 잘 사용하여 5개의 마이크로리터 알리쿼시를 혼합하고 섭취합니다. 액체 질소로 알리쿼트를 얼리고 섭씨 80도에 보관하십시오.모든 샘플을 수집하면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 알리쿼트를 해동하고 간접 ELISA를 사용하여 분석합니다. 대안적으로, 상용 ELISA 키트는 ADC의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 분석 이틀 전에 96 웰 플레이트의 바깥 우물을 물로 채웁니다.그런 다음 5 밀리모어 EDTA에서 05 %의 트립신으로 세포를 들어 올립니다. 250 x g에서 3 분 동안 세포를 원심 분리하고 새로운 배지에서 다시 중단합니다. 그런 다음 96 개의 우물 판에서 잘 당 100 마이크로 리터에 3, 000 세포를 씨앗하고 인큐베이터에 다시 배치합니다.세포를 파종한 지 이틀 후, 전체 배지에서 1%DMSO로 트리플리케이트에 있는 모든 시료의 직렬 희석을 준비한다. 이제 각 샘플의 100 마이크로리터를 각 우물에 추가하고 섭씨 37도, CO2 4%로 5일간 배양합니다. 5일째에는 세포 생존가능성을 측정합니다.이를 위해 상용 키트를 사용하여 세포를 lyse하고 방출된 ATP를 측정합니다. 1%DMSO로 처리된 제어 셀에 대하여 신호의 백분율을 플롯합니다. ADC는 혈청에서 5일 동안 섭씨 37도에서 배양할 수 있으며 기능적 안정성을 증명하기 위해 세포 독성에 대해 분석할 수 있습니다.사이클로프로펜 손잡이를 가진 항체는 단백질 A 정화 후에 리터 당 20 밀리그램 이상의 수율을 가진 이 절차를 사용하여 얻을 수 있습니다. 생성된 항체는 테트라진을 베어링독소에 신속하고 구체적으로 공주할 수 있다. 독소와 항체의 결합시, 항체에 대한 평균 약물 비율은 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이 1.9보다 큽습니다.ADC의 ID는 질량 분석법에 의해 확인됩니다. 생성된 디하이드로피리디젠 결합은 37°C에서 5일 이상 인간 혈청에서 안정적입니다. 항체 약물 공주는 HER2의 낮은 수준을 가진 세포보다는 HER2의 상부를 가진 세포를 강력하고 선택적으로 죽입니다.더욱이, 테트라진 링커로 변형된 독소와 독소가 없는 항체는 독성이 매우 낮다. 독소만으로도 선택성을 달성하기 위해 타겟팅의 필요성을 강조하는 비HER2 의존독성을 나타낸다. 이 절차에 따라 종양 치료를 위해 항체 약물 컨쥬게이트를 신속하고 효율적으로 준비할 수 있습니다.잠재적으로, 테트라진으로 기능화된 모든 약물은 암 세포 바이오마커를 표적으로 하는 항체에 연결될 수 있다. 이 기술의 의미는 치료 또는 진단을 위한 어떤 단백질 컨쥬게이트든지까지 확장됩니다.

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연구

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