각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

이 방법은 각막 상처 치유 중에 관여하는 세포 및 분자 메커니즘과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 각막 삽입, 즉 눈 표면의 찰과상이나 긁힘의 경우 응급실의 상황을 반영한다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 각막 상피 전구 세포와 각막의 항상성 유지에 도전하는 상황에서의 행동을 연구할 때 처음 떠올랐습니다.

각막 찰과상을 시술하는 것은 어렵고 연습이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저, 10mg의 플로레신 염을 미세한 눈금으로 측정하여 코발트 블루 라이트 아래에서 마모를 시각화하기 위한 0.1% 플로레신 용액을 준비합니다. 그런 다음 Fosfate 완충 식염수 10ml에 소금을 첨가합니다.

플로레신 용액을 빛으로부터 보호하고 5분 동안 흔듭니다. 멸균 필터를 통해 용액을 스포이드 병에 넣고 빛으로부터 보호하십시오. Florecine 용액은 섭씨 4도에서 2-3일 동안 보관할 수 있습니다.

사용 전후에 안구 버 팁을 청소하십시오. 먼저 PBS를 사용하고, 그 다음에는 70% 에탄올을 사용합니다. 먼저 마취된 마우스를 섭씨 37도로 가열된 보온 플레이트의 종이 타월 위에 올려 놓습니다.

꼬리 꼬집음과 발가락 꼬집음을 투여하여 마취 수준을 확인하십시오. 마취 수준은 꼬리 반사가 없지만 발가락 반사가 있는 경우 양호합니다. 버의 바닥을 회전하여 진동을 켭니다.

손가락으로 눈꺼풀을 벌리고 마모될 눈을 엽니다. 그런 다음 버를 각막에 단단히 대고 버를 들어 올리지 않고 안구 표면에서 기구를 앞뒤로 움직입니다. 버 진동은 스크래치를 수행합니다.

각막을 누르거나 흔들거나 찢지 마십시오. 중앙 각막에서는 각막 표면에서 20번의 마모 운동이 상처를 유발하기에 충분합니다. 각막 찰과상을 만드는 것은 어렵고 연습이 필요합니다.

올바른 압력에 주의를 기울이고 한 번의 시도로 마모를 시도하십시오. 스포이드 병에서 마모된 눈에 플루레신 용액 한 방울을 투여합니다. 그런 다음 Florecine의 배경을 줄이기 위해 0.9%% 식염수로 눈을 한 번 씻습니다.

부드러운 물티슈로 여분의 액체를 흡수하고 필요한 경우 속눈썹을 청소하십시오. 마모를 이미지화하려면 테이블 램프를 마우스 눈 바로 위에 코발트 블루 펜 라이트가 부착된 상태로 배치합니다. 펜 라이트의 버튼을 테이프로 눌러 혼자 작업할 때 조명을 켜진 상태로 유지할 수 있습니다.

실내 조명에서 SLR 카메라를 눈에 초점을 맞춘 다음 코발트 블루 펜 라이트를 제외한 다른 모든 라이트를 끕니다. 코발트 블루 펜 라이트로 조명을 비추면 마모된 영역은 고르지 않은 표면에 갇힌 플로레신 분자로 인해 녹색으로 형광을 발합니다. SLR 카메라를 사용하여 눈 사진을 촬영합니다.

눈을 이미징한 후 마우스를 예열된 플레이트에 다시 넣습니다. 항균 Fucidin 안연고 한 방울을 마모된 눈과 그렇지 않은 눈 모두에 바르면 수분을 공급하고 마취 후 박테리아로부터 안구 표면을 깨끗하게 유지할 수 있습니다. 5분에서 20분 동안 가열된 플레이트에서 마우스, 마취 후, 깨어나는 시간을 관찰합니다.

이동이 가능해지면 깨끗한 케이지에 마우스를 단독으로 보관합니다. 승인된 방법으로 동물을 안락사시킨 후 먼저 해부 가위로 눈 옆의 피부를 절개하여 안구를 채취합니다. 그런 다음 가위를 안구 아래에 놓고 안구를 안구 밖으로 펌핑하기 위해 안구 신경을 잘라냅니다.

PBS가 담긴 접시에 눈을 넣습니다. 26 게이지 바늘을 사용하여 눈 뒤쪽의 망막 쪽에 구멍을 뚫어 용액이 눈 안으로 자유롭게 침투할 수 있도록 합니다. PBS가 들어 있는 2밀리리터 튜브로 눈을 옮깁니다.

그런 다음 PBS를 제거하고 파라포름알데히드 4%를 첨가한 다음 4-5시간 동안 눈을 섭씨 4도에서 고정합니다. 이 이미지는 찰과상 직후의 마우스 눈을 보여줍니다. Florecine 신호는 마모된 영역을 밝은 녹색으로 표시하며, 상피의 다른 모든 영역은 어두운 상태로 유지됩니다.

점선은 상처의 경계를 표시합니다. 이미지는 대조군 역할을 하는 다치지 않은 양측 눈을 보여줍니다. 흰색 점은 카메라의 반사입니다.

찰과상 후 18시간이 지나면 각막 상피가 노출 부위 위로 대부분 닫혔고 약간의 찰과상만 남았습니다. 마모 후 72시간이 지나면 녹색 신호가 보이지 않습니다. 이는 찰과상 후 72시간까지 각막 상피가 완전히 재상피화되었음을 나타냅니다.

찰과상은 여기 온전한 눈에 보이는 각막 상피에 집중되어 있으므로 각막의 더 깊은 층은 손상되지 않았습니다. 마모 직후, H와 E 염색은 이 별꽃으로 표시된 찰과상의 가장자리를 드러내며, 이는 규칙적인 4-5개의 세포층 두께의 각막 상피에서 연속적인 좁은 a-세포 선반으로 표시됩니다. 부상 후 18시간이 지나면 치유 과정이 활발하게 진행되며 재상피화가 진행됩니다.

이것은 노출된 영역을 덮고 있는 1-2개의 상피 세포층의 선행 가장자리의 출현에 의해 제안됩니다. 표면은 72시간이 지나면 완전히 상피화된 것처럼 보이는데, 이는 이동하는 전선이 상처를 덮고 모든 상피층이 다시 존재하기 때문입니다. 이 기술은 일단 숙달되면 두 명의 연구원이 적절하게 수행한다면 2시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 계획하고 시도하는 동안 지역 동물 복지 지침을 따르고 양호하고 멸균된 실험실 관행을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라 linis 추적과 같은 다른 방법을 수행하여 각막 상처 치유, 재상피화 및 각막 조직 항상성 회복에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.