Name: 각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 학습하세요 쥐 각막 상피 마모 기법을 통해 상처 치유의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 응급실 상황을 모사하여 각막 상피 전구세포 행동을 분석하는 데 활용됩니다.

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우리는 Kaisa Ikkala 나중에 우리의 중앙 연구 질문에 구현 하는 동안 뿐만 아니라 그녀의 귀중 한 기술 지원 및 통찰력이 도움이 때이 방법을 현실화에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 실험실 동물 센터와 안 나 Meller 수의학 작업의 지침을 계획 그녀의 도움에 감사 하 고 싶습니다.

모든 실험 국가 동물 실험 보드에 의해 승인 됩니다.
1입니다. 준비
<ol><li>모든 솔루션을 준비 하 고 실내 온도에서 달리 명시 하지 않는 한 계속. Dispose 사용 재료 및 솔루션 폐기물 처리 규정을 따릅니다.</li>
	<li>사용 NMRI와 ICR outbred 주식, 4-12 주 세 중 성별 사이의. C57BL/6 긴장을 사용 하 여 단계 1.3.2에서에서 케 타 민-medetomidine 준비 방법을 따르십시오. 다른 단계에 대 한 1.3.3.-1.3.5에 설명 된 지침을 따릅니다.</li>
	<li>신선 하 고 작업을 시작 하기 전에 시간에 수의학을 준비 합니다. Carprofen 나중에 사용 될 것입니다, 그리고 따라서 그것은 시점에서 그것을 준비 하는 데 필요한.<ol>
<li>혼합 0.375 mL 마 취에 대 한 마 취 제-medetomidine의 솔루션을 준비, (재고 농도 50 mg/mL) 0.25 mL와 케 타 민 (Ketaminol 수 의사)의 (농도 재고 1 mg/mL) medetomidine (Cepetor 수 의사)의 살 균 0.9%의 1.25 mL을 추가 하 고 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (7.5 mg/kg, 케 타 민 1 mg/kg, medetomidine)의 관리.</li>
		<li>0.375 mL를 혼합 C57BL/6 마우스에 마 취에 대 한 마 취 제-medetomidine의 더 묽 게 한 해결책을 준비, (농도 재고 50 mg/mL)의 0.25 mL와 케 타 민 (농도 재고 1 mg/mL) medetomidine의 살 균 0.9%의 2.5 mL을 추가 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (3.75 mg/kg, 마 취 제 및 0.5 mg/kg, medetomidine)의 관리. 참고: 이것은 성인 C57BL/6 쥐에 대해서만 대체 단계입니다.</li>
		<li>진통에 대 한 buprenorfin을 준비 하려면 추가 0.1 mL (재고 농도 0.3 mg/mL) 살 균 0.9%의 1.9 ml buprenorfin의 NaCl. 0.2 mL/20 g 마우스 무게 (0.15 mg/kg)를 관리 합니다.</li>
		<li>마 취를 중단에 대 한 atipamezole를 준비 하려면 0.1 mL을 추가 (농도 재고 5 mg/mL) atipamezole 4.9 ml의 0.9%의 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (0.75 mg/kg)를 관리 합니다.</li>
		<li>후 마 취 동안 진통 carprofen을 사용 합니다. 0.1 mL를 추가 (재고 농도 50 mg/mL) carprofen 4.9 ml의 0.9%의 NaCl. 0.15 mL/20 g 마우스 무게 (7.5 mg/kg)의 관리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 성 얼룩 솔루션 준비<ol>
<li>코발트 블루 빛 (그림 1) 아래 마모를 시각화에 대 한 형광 솔루션을 사용 합니다. 벌금 규모와 fluorescein 소금의 첫 번째 측정 10 밀리 그램으로 0.1 %fluorescein 솔루션을 준비 하 고 인산 염 버퍼 염 (PBS) 10 mL를 추가.</li>
		<li>빛에서 fluorescein 솔루션을 보호 하 고 통에 5 분 동안 흔들어. 참고: fluorescein 솔루션은 빛에 민감한; 빛에서 포함 하는 솔루션을 유지. 이 솔루션은 2-3 일 동안 + 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 사용을 위해 안 약에 사용 되는 스 포 이트 병 fluorescein 솔루션 에서도 도움이 됩니다. 살 균 필터를 사용 하 여 솔루션 스포이드 병에 이동할 때.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사용; 전후 눈 버 팁 청소 먼저 PBS 그리고 70 %EtOH. 동일한 작업 중 여러 마우스 한 마모를 만드는 경우 각 마우스 사이 청소 단계를 수행.</li>
	<li>(+37 ° C)에 온수 접시를 놓고 그것에 종이 타월 장소.</li>
</ol>2. 각 막 마포
주의: 사용 보호 의류 (장갑, 랩 코트) 때 쥐를 처리. 체중 관리 하는 약물의 양을 견적 하는 마우스.
<ol><li>한 손으로 scruffing 메서드를 사용 하 여 마우스23처리 하. 케 타 민-medetomidine 혼합물을 intraperitoneally 관리 (i.p.) 왼쪽 낮은 복 부. 마우스를 개별 케이지를 놓고 잠들 때까지 기다립니다. 이 일반적으로 5 분 미만 걸립니다. 그런 다음, 첫 번째 buprenorfin 그리고 atipamezole i.p. 주사를 통해 관리 합니다. 동일한 처리 기술을 사용 합니다. 참고: 일단 마 취를 부여 프로토콜 해야 하지 일시 정지 됩니다 언제 든 지.</li>
	<li>계속 하기 전에 온수 접시 따뜻한 인지 확인 합니다. 온수에 마 취 마우스를 놓습니다. 마 취의 레벨은 꼬리 반사 이다 결 석, 하지만 발가락 반사는 존재 하는 경우에 좋다. 꼬리와 손가락 또는 집게와 모든 발가락을 곤란 하 게 하 여 이러한 반사를 확인 합니다. 과도 한 무력을 사용 하지 마십시오. 마 취는 지난 20-25 분을 것입니다.</li>
	<li>한 마모 청소 눈 버를 사용 합니다. 회전 하는 마모를 확인 하는 것이 필수적입니다 진동 설정에 버의 베이스. 버 제대로 작동 하는 때, 손에 진동 느낌.<ol>
<li>별도로 손가락으로 눈 꺼 풀을 눌러 한 번에 한쪽 눈을 엽니다. 단단히 각 막에 버 터치 그리고 눈 표면에 악기 뿐만 아니라 뒤로 및 앞으로 옆으로 이동 합니다. 버 진동 수행 처음; 누르면, 동요 하거나 마십시오 눈물 각 막. 중앙 각 막에서 표면에 움직임 abrading 20는 상처를 유발 하기에 충분. 에 버를 들어올린 침식 될 각 막의 영역에 체류 하려고 하지 마십시오. 표준 크기의 마모를 취득 실천의 여러 라운드를 요구할 것 이다.</li>
	</ol>
 참고: 각 막 무 균 상태 얻을 수 있습니다 전에 마모 betadine 안과 솔루션을 사용 하 여.</li>
</ol>3. 이미지는 마모
<ol><li>코발트 블루 펜 빛 (그림 1)과 fluorescein 솔루션을 사용 하 여 침식된 영역을 밝게. 안구 표면 주변광에 무색 나타납니다. Fluorescein 신청 후 침식된 지역 fluoresces 녹색에서 빛 펜으로 눈을 조명 하는 때.<ol>
<li>필요한 경우, 2.3에서 마찬가지로 침식된 눈 열고 fluorescein 솔루션의 한 방울 스포이드 병에서 관리 합니다. PBS와 0.9%에 한 번 눈을 씻고 NaCl을 줄이기 위해는 fluorescein의 배경. 점 적기 병 또는 한 피 펫을 사용 하 여 세탁. 소프트 삭제 기능으로 멀리 액체를 발음 하 고 필요한 경우는 속눈썹을 청소. 과잉 액체는 일반적으로 눈물 운하의 개통에 가까운 눈, 비 강 국경에 수집합니다. 주의: 약간의 찰과상이 유도 될 수 있습니다으로 cleaining 동안 각 막을 만지지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 막 찰과상의 사진을 찍을.<ol>
<li>각 이미지 세션 동안 비슷한 이미지를 얻으려면 코발트 블루 펜 빛과 SLR 카메라 (그림 2)에 대 한 꾸준한 첨부 파일 도구를 사용 합니다. 이 프로토콜은 (그림 2)를 반복 하기 쉬운 설치를 제공 합니다.<ol>
<li>펜 라이트와 카메라 연결할 테이블 램프 유연한 팔과 클램프 및 조정 가능한 카메라 팔은 클램프와 함께 각각 사용 합니다. 케이블 넥타이 펜 마우스 눈 바로 위에 위치 하 고 테이블 램프에 빛. 빛을 다르게 위치는 마포의 시각화를 변경 될 수 있습니다. 이러한 도구를 위치에 대 한 제안 그림 2에 설명 되어 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SLR 카메라를 사용 하 여 눈의 사진을 찍을. 방 조명에 원하는 거리와 위치와 초점 카메라 (1:12)에 동물을 놓습니다. 그 후, 코발트 블루 펜 라이트를 제외 하 고 다른 모든 빛을 닫습니다. 참고: 아래 펜 라이트 핸들을 테이프 또는 이미징 동안 모든 시간에 빛을 유지 하는 고무 밴드를 사용. 이 이미지가 흐릿한 경우 도움이 될. 동료와 함께 이미징 단계를 수행 하는 것이 쉽습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 각 막 마포 후 깨어난
<ol><li>첫 번째 buprenorfin 그리고 atipamezole i.p. 주사를 통해 관리 합니다. 2.1에서 동일한 처리 기술을 사용 합니다.</li>
	<li>항균, fucidin 산 눈 연 고 (Isathal) 수 분 마 취 후 눈 표면 박테리아에서 청결 한 유지 하 침식 및 침식 비 눈 방울을 놓습니다.</li>
	<li>마우스는 온수에 5 ~ 20 분에 일어나 것 이다, 마 취 후 웨이크 업 기간 동안 마우스를 관찰 합니다. 때 모바일, 개별 감 금 소에. 참고: 깨어 오래 걸리면, 온수 패드 장에 마우스를 배치 또는 전체 케이지 온수 접시에 놓고 마우스를 정기적으로 모니터링 합니다. 마 취 기운이 떨어지기, 마우스 일반적으로 착취 하 고 앞쪽 시체와 함께 위쪽으로 도달. 이 문제는 3-4 시간에 정상으로 반환 해야 하 고 공유 감 금 소에 다시 마우스를 배치할 수 있습니다.</li>
	<li>2.2 단계에서 마찬가지로 마모 후 이틀 연속에 carprofen i.p. 진통와 눈 연 고에 대 한 관리. 그리고 4.2입니다.</li>
</ol>5. 상처 치유 하는 동안 이미징
<ol><li>이 프로토콜에서 사용 시간 상처 폐쇄를 관찰 하는 마모 후 18 h 및 72 h 포인트.<ol>
<li>연속 영상에 대 한 2.2에 설명 된 대로 쥐를 anesthetize.</li>
		<li>3에 설명 된 대로 사진을 찍을.</li>
		<li>Atipamezole i.p.와 동물 그리고 4.3에 설명 된 대로 시동 기간을 모니터링. 참고: 그렇지 않으면 계속 속 행, 5.1.2 후 바로 마우스를 안락사. 안락사는 6.1에 설명 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 각 막 컬렉션 및 파라핀 포함
<ol><li>마지막 시간 이후에, 동물을 희생. CO2로 채울 수 있는 챔버에 마우스를 놓습니다. CO 챔버 공기를 채워2. 동물 모바일 이면 꼬리의 기지에서 단단히 당기 및 동시에 누르고 목 지역 경관 척추를 탈 구. 주의: 항상 로컬 동물 복지 본문의 지침을 따르십시오.</li>
	<li>눈의 해 부가 위 피부에 개방을 절단 하 여 안구 전체를 수집 합니다. 안구에서가 위를 배치 하 고 궤도에서 안구 팝업 눈 신경 절단. 집게를 사용 하 여 눈 오지 않는 경우 밖으로 쉽게.<ol>
<li>눈 안에 솔루션의 무료 침투 수 있도록 26 G 바늘, 망막에 눈의 뒷면에 구멍을 확인 합니다. 참고: 눈 건조, 대신, PBS에 장소는 프로토콜 계속까지 못하게 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS 2 mL 튜브에 눈알을 수집 합니다. 실험을 일시이 시점에서 하지 않습니다.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 4-5 시간 + 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 눈알을 수정.</li>
	<li>고정된 안구 조직 카세트 조직 처리에 대 한 이동 합니다. 조직 처리 기계 및 다음 프로그램을 사용:<ol>
<li>PBS와 린스.</li>
		<li>실 온에서 70% 에탄올에 2 x 45 분을 품 어.</li>
		<li>실 온에서 94% 에탄올에 2 x 1 h를 품 어.</li>
		<li>실 온에서 절대 에타 놀에서 3 x 45 분을 품 어.</li>
		<li>크 실 렌, 실내 온도 37 ° c.에 마지막 자일 렌에서 3 x 1 h을 품 어</li>
		<li>파라핀 왁 스 60 ° c.에 있는 3 x 1 h을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 처리, 후 박을 안구 조직 포함 블록을 사용 하 여 액체 파라핀 (+ 60 ° C). 그것은 옆으로 보고와 주변 테두리를 위쪽으로 향하게 되도록 블록 내 눈을 놓습니다. 5-10 분 동안 차가운 접시에 응고 블록을 보자.</li>
</ol>7. 각 막의 파라핀 섹션
<ol><li>기관의 또는 제조업체의 지침에 따라 단면에 대 한 톰을 준비 합니다. 주의: 날카로운 톰 블레이드를 처리할 때는 주의 해야 합니다.</li>
	<li>실내 온도 톰 옆에 초순 장소 한 물 탕 다른 초순 + 50 ° c 온수</li>
	<li>안구의 5 µ m 두꺼운 섹션을 확인 합니다. 참고: 렌즈 쉽게 구분 하는 동안 휴식. 이 방지 하려면 절단 표면을 각 시간 섹션의 새로운 행이 시작 촉촉한 티슈로 닦아냅니다. 수돗물을 사용 하 여 조직 축.</li>
	<li>실내 온도 물 목욕에 서로 옆에 섹션을 놓고 뜨거운 물 목욕 유리 슬라이드의 도움으로 이동 합니다. 모든 주름이 이완 될 때까지 뜨거운 물 목욕 및 섹션 될 매트에 섹션을 스트레칭.</li>
	<li>+37 ° C에 하룻밤 단면도 유리 슬라이드를 건조</li>
	<li>슬라이드 + 60 ° C에 온수 접시에 1 분간 유지 하 여 슬라이드에 연결할 섹션 이 후, 섹션 수 수 직접 얼룩, immunohistological 방법에 대 한 처리 또는 + 4 ° C에 저장</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

부상 메서드는 각 막 항상성 및 병 리의 다양 한 측면을 공부 인기 있는 도구입니다. 마모 모델 안과에 관련 문제를 해결 하기 위해 잘 제어 방법을 제공 합니다. 그러나, 특정 중요 한 포인트는 프로토콜에서 강조 가치가 있다. 특히, 수의학, 상처 치유 타임 라인, 그리고 결과 관한 설명 내용을 outbred NMRI와 ICR 주식와 함께 사용 하기 위해 최적화 된 하지만 쥐26의 변종 마다 다를 수 있습니다. 이 프로토콜, 실험 동물 약 20 분 동안 마 취 유지 됩니다. 이 마모를 수행 하는 시간이 짧지만 충분 한 창을 제공 합니다. 그러나 때 눈 버를 사용 하 여 작업은 매우 빠르게 마모 자체를 만드는 고이 시간 프레임에 수행 가능 해야 한다.
간단 하 고 접근 가능한 시각화 마모 모델의 주요 장점 중 하나입니다. 분자 생물학 방법을 결합 하 여,이 훌륭한 세부 사항에서 상피 세포를 연구 하는 가능성을 엽니다. 침식된 각 조직학 또...

수많은 기관의 상피 층 부상에 노출 됩니다. 그러나, 그들은 또한 상처 치유를 통해 조직의 손실을 보상 하는 기능을 포함. 각 막 상처 치유를 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 그것은 눈의 외부 표면에 형성 하 고 민감한 눈 기계에 대 한 보호 계층을 제공 합니다. 따라서, 각 막 병원 균과 감수를 물리적 장벽 역할을 합니다. 그것은 3 개의 층;으로 구성 상피, 기질 및 피입니다. 각 막의 상피 각 막의 가장 바깥쪽 레이어 최대 수 있습니다. 상피 세포는 단단한 접속점1,2,3통해 서로 엄격 하 게 준수 하 여 각 막의 장벽 기능을 유지 합니다. acellular 막 지하실 막, 보 먼의 막 내 화 keratocytes를 포함 하는 광범위 한 기질에서 상피를 분리 합니다. 기질에서 내 피 세포 영양분, 물, 그리고 산소는 상위 레이어를 채널.
각 막 찰과상은 병원4에서 아주 일반적 이다. 각 막에 상해 다양 하지만 크게 다른 이물질, 스크래치, 또는 모래, 먼지와 같은 작은 입자에 의해 발생. 프로토콜 설명 여기 임상 관련 유형의 각 막 상피 마모를 재현 하는 겨냥 했다. 이렇게,이 프로토콜에는 임상 및 각 막 과학자 들은 자신의 연구에서 구현 하는 제어 및 정액 방법을 제공 한다. 우리 murine 각 막에 무디게 눈 버, Algerbrush II와 조직 abrading 하 여 비보에 부상 수리 분석을 수행 했습니다. 여기, 우리가 대상 중앙 각 막 상피에만 마모 손상 없이 장기의 다른 부분을 떠나. 따라서, 마이그레이션, 확산 및 감 별 법 vivo에서5세포 프로토콜은 다시 epithelialization 동안 연구 각 막 상피 세포 역학 또는 지하실 멤브레인에 이상적 이다. 최근,이 모델 murine 각 막에도 다시 부상6,7후 각 막 줄기 세포 틈새에서 차별화 된 각 막 상피 세포의 용량을 공개로 조상 세포 역학 분석에 사용 되었다. 마모, 다음 각 막의 정상적인 투명성과 인장 강도를 반환합니다. 흥미롭게도, 생체 외에서 연구 표시는 다시 epithelialization 증가 세포 확산8없이 발생 합니다. 이 프로토콜 murine 각 막에 치료 중단의 타임 라인을 설명 합니다. 방법은 따라서 치료 패턴 및 속도에 약물의 효과 테스트에 적용 됩니다.
각 막 상처 치유 연구에 대 한 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 많은 연구는 상해의 다른 모델에 의존 했습니다. 9각 막 표면 필터 종이 없이 각 막 상해의 잘 설립 모델 수산화 나트륨 (NaOH)을 적용 하 여 수행 되는 알칼리 화상 이다. 알칼리 성 노출 영향을 각 막 상피, 뿐만 아니라 뿐만 아니라 결 막 및 기질9,10크고 확산 부상에서 결과입니다. 강한 알칼리 솔루션 각 막 궤 양, opacification, 및9neovascularization 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 염증 세포 6 h 이내 일반적으로 기질을 침략 하 고 24 h11까지 거기 남아 있다. 따라서, 알칼리 성 부상 stromal 활성화에 관련 된 연구에서 권장 방법입니다. 또 다른 유형의 화학 상해 각 막9,10에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 적용 하 여 쏜 수 있습니다. 다른 일반적으로 사용 되 부상 모델 기질14,15의 상단 부분에 제한 되는 기질 및 keratectomy 상처를 통해 침투 incisional 상처 포함 됩니다. 이 메서드는 또한 stromal 상처 치유에 관한 질문에 대답 하는 데 유용. 다른 부상 모형에는 그들의 자신의 장점과 단점 있다. 마모, 또는 각 막 상피의 debridement는 비보 전 각16에 무디게 scalpels 또는 블레이드를 사용 하 여 처음 개발 되었다. 이 방법은 사용 vivo에서 마우스, 쥐, 토끼17,18,19,20,,2122에 나중에 되었습니다. 우리는 상피의 나머지 영향을 받지 떠나는, 상피의 선택된 된 영역만 제거 눈 버 (그림 1)를 사용 하 여. 이러한 방법으로, 그것이 정확 하 게 각 막의 다른 부분에 상피 제거 대상으로 가능 합니다. 또한, 마모 크기 fluorescein 얼룩과 평가 될 수 있다. 또한, 여기에 우리가 치료 기간 동안 마모 폐쇄를 따르십시오.
이 메서드는 몇 가지 장점이 포즈, i)를 포함 하 여 화학 부상으로 불가능 하다, 마모 사이트의 정확한 위치 ii) 마모 수행, 빠른 이며 iii) 그것은 비 침략 적. 그러나 여기, 우리는이 마우스 유전자 모델의 광대 한 배열 뿐만 아니라 쥐와 토끼, 인간의 각 막 장애를 연구 하는 데 사용 하는 일반적인 모델에 적용 될 수 있었다 모델로, outbred NMRI 마우스를 사용 하 여 메서드를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>NMRI 마우스</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>사용 멸균</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>시장명: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>시장명: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>시장명: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>시장 이름 : Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>시장 명 : Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1 % fucidin acid eye ointment</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>시장 명 : Isathal</td></tr><tr><td>Fluorescein salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii 안구 버 ( 0.5mm 팁)</td> <td>Algerbrush</td><td>6.39768E + 11</td><td></td></tr><tr><td>코발트 블루 펜 라이트</td><td>SP 서비스</td><td>DE / 003</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>디지털 SLR 카메라</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>조정 가능한 카메라 암 및 클램프</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>높이 28cm</td></tr><tr><td>유연한 암과 클램프가있는 테이블 램프</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소프트 와이프</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 도구 세트</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G 바늘</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf tube</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>티슈 케이스</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>티슈 가공기 ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>티슈 임베딩 몰드 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td> <td>절</td></tr>편용 <tr><td>수조</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Th.Geyer GmbH & Co.</td><td>7,695,019</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Murine 각 막 상처 치유를 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 각 막, 눈의 가장 바깥쪽 레이어 이며 따라서 부상으로 첫 번째 방어 이다. 사실, 눈 부상 클리닉에서 발견의 가장 일반적인 유형은 각 막 마포 이다. 여기, 우리는 인 제거는 각 막 상피에 vivo에서 쥐를 마 취에 한 마모를 유발 하는 눈 버를 활용 합니다. 이 메서드는 타겟과 재현 상피 중단, 그대로 다른 지역에 대 한 수 있습니다. 또한, 우리 fluorescein 얼룩과 침식된 상피의 시각화를 설명 하 고 각 막이 침식된을 시각화 하는 방법에 구체적인 조언을 제공. 다음, 우리는 상처는 상처는 다시 epithelialized 때까지 0, 18, 및 72 h 마모, 후 치유의 타임 라인을 따른다. 상해 각 막의 상피 마모 모델 상피 세포 증식, 마이그레이션 및 각 막 층의 재 epithelialization에 대 한 연구에 이상적입니다. 그러나,이 방법은 아니다 상처 치유, 동안 stromal 활성화 연구 최적의 눈 버 stromal 세포 층에 침투 하지 않습니다 때문에. 이 메서드는 또한 임상 응용, 약물 효과의 예, 전 임상 시험에 적합.

이 프로토콜 마우스 각 막에 마포 상해를 입힐 수 있는 모델을 설명 하 고 따라 하 고 마모 후 치유 과정을 시각화 방법을 제시. 최근에, 우리는 상처 치유6동안 각 막 상피 조상 세포의 역할을 연구 하기 위해이 메서드를 고용. 설정된 도구를 사용 하 여 성공적인 마모 실험에 열쇠 이다. 우리는, 그리고 다른 찰과상6,,724수행 하 Algerbrush II 눈 버 (그림 1)을 사용 했습니다. 이 도구는 보다 훈련 또는 각 막 상피가 떨어져 브러쉬 크기에 0.5 m m의 무디게 버 팁이 있다. 따라서,이 도구는 각 막에 마포 상해에 대 한 권장된 선택 이다.
<p class="jove_content" ...

이 프로토콜, 마우스의 눈 표면에 마모를 및 상처 치유 과정 그 후에 따라 메서드를 설명 합니다. 프로토콜은 부분적으로 anaesthetized 쥐에서 눈의 표면 상피를 제거 하는 눈 버 합니다.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

이 방법은 각막 상처 치유 중에 관여하는 세포 및 분자 메커니즘과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 각막 삽입, 즉 눈 표면의 찰과상이나 긁힘의 경우 응급실의 상황을 반영한다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 각막 상피 전구 세포와 각막의 항상성 유지에 도전하는 상황에서의 행동을 연구할 때 처음 떠올랐습니다.각막 찰과상을 시술하는 것은 어렵고 연습이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저, 10mg의 플로레신 염을 미세한 눈금으로 측정하여 코발트 블루 라이트 아래에서 마모를 시각화하기 위한 0.1% 플로레신 용액을 준비합니다. 그런 다음 Fosfate 완충 식염수 10ml에 소금을 첨가합니다.플로레신 용액을 빛으로부터 보호하고 5분 동안 흔듭니다. 멸균 필터를 통해 용액을 스포이드 병에 넣고 빛으로부터 보호하십시오. Florecine 용액은 섭씨 4도에서 2-3일 동안 보관할 수 있습니다.사용 전후에 안구 버 팁을 청소하십시오. 먼저 PBS를 사용하고, 그 다음에는 70% 에탄올을 사용합니다. 먼저 마취된 마우스를 섭씨 37도로 가열된 보온 플레이트의 종이 타월 위에 올려 놓습니다.꼬리 꼬집음과 발가락 꼬집음을 투여하여 마취 수준을 확인하십시오. 마취 수준은 꼬리 반사가 없지만 발가락 반사가 있는 경우 양호합니다. 버의 바닥을 회전하여 진동을 켭니다.손가락으로 눈꺼풀을 벌리고 마모될 눈을 엽니다. 그런 다음 버를 각막에 단단히 대고 버를 들어 올리지 않고 안구 표면에서 기구를 앞뒤로 움직입니다. 버 진동은 스크래치를 수행합니다.각막을 누르거나 흔들거나 찢지 마십시오. 중앙 각막에서는 각막 표면에서 20번의 마모 운동이 상처를 유발하기에 충분합니다. 각막 찰과상을 만드는 것은 어렵고 연습이 필요합니다.올바른 압력에 주의를 기울이고 한 번의 시도로 마모를 시도하십시오. 스포이드 병에서 마모된 눈에 플루레신 용액 한 방울을 투여합니다. 그런 다음 Florecine의 배경을 줄이기 위해 0.9%% 식염수로 눈을 한 번 씻습니다.부드러운 물티슈로 여분의 액체를 흡수하고 필요한 경우 속눈썹을 청소하십시오. 마모를 이미지화하려면 테이블 램프를 마우스 눈 바로 위에 코발트 블루 펜 라이트가 부착된 상태로 배치합니다. 펜 라이트의 버튼을 테이프로 눌러 혼자 작업할 때 조명을 켜진 상태로 유지할 수 있습니다.실내 조명에서 SLR 카메라를 눈에 초점을 맞춘

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기에 설명된 것은 본래의 미세환경 내에서 상피 조직의 손상 반응 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 임상적으로 관련된 생체 외 모의 백내장 수술 모델의 확립입니다.

임상 적으로 구축<em&gt; 전의 VIVO</em기본 미세 환경에서 상피 상처 복구 조사를위한&gt; 모의 백내장 수술 모델

전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

여기에서, 트레핀 및 무딘 골프 클럽 스푸드를 사용하여 마우스에 중앙 각막 상피 마모 상처를 만들기 위한 프로토콜이 설명된다. 이 각막 상처 치유 모델은 재현성이 높으며 현재 질병의 맥락에서 손상된 각막 상처 치유를 평가하는 데 사용되고 있습니다.

각막 상처 치유를 연구하기위한 상피 마모 모델

여기서는 각막 상피의 기계적 및 화학적 손상을 위해 마우스와 토끼를 기반으로 한 동물 모델을 개발하여 새로운 치료법과 기본 메커니즘을 스크리닝합니다.

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

이 기사는 각막의 해부학 및 조직학과 치유 과정을 연구하기 위해 개발 된 새로운 동물 모델을 설명합니다. 이 새로운 동물 모델은 인간의 각막과 많은 유사성을 가진 각막을 가진 몽골 저빌을 사용합니다.

상처 치유의 동물 모델로서의 몽골 저빌

본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 다른 단계를 보여줍니다. 재생 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있습니다.

배아 상처 병아리 각막의 흉터없는 조직 재생 조사

이 프로토콜은 세포 수준에서 후속 상처 폐쇄를 평가하기 위해 마모를 통해 제브라 피쉬의 안구 표면을 손상시키는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 안구 버를 이용하여 각막 상피를 부분적으로 제거하고 주사 전자 현미경을 사용하여 상처 폐쇄 중 세포 형태의 변화를 추적합니다.

제브라피쉬 각막 상처 치유: 마모에서 상처 폐쇄 영상 분석까지

여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.

쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략

우리는 각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 통해 심각한 각막 염증을 일으키는 쥐 모델을 개발했습니다. 이 연구는 염증 상태에서 각막 염증 패턴, 상피 증식 및 윤부 줄기 세포의 변화를 평가했습니다.

각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 기반으로 한 쥐에서 중증 각막 염증 모델 확립

돼지 각막 체외 장기 배양 및 상피 상처 치유는 화학 물질의 안구 독성을 테스트하기 위한 경제적이고 윤리적이며 재현 가능하고 정량적인 수단을 제공합니다. 또한 상피화 및 조직 복구의 조절의 기전을 규명하고 당뇨병성 각막병증 및 상처 치유 지연을 치료하기 위한 치료법을 평가하는 데 도움이 됩니다.

장기 배양 돼지 각막 및 상피 상처 치유를 사용한 치료 및 화학적 독성 평가

학습하세요 쥐 각막 상피 마모 기법을 통해 상처 치유의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 응급실 상황을 모사하여 각막 상피 전구세포 행동을 분석하는 데 활용됩니다.

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

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