Name: Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 학습하세요 Synechocystis에서 분광광도법을 이용한 파코빌리단백질 정량 분석 방법을. 이 프로토콜은 시아노박테리아와 조류의 광수확 효율 및 생산성 연구에 필수적인 기술을 제공합니다.

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프로토콜은 이전 게시11에서 채택 되었다. T. Z., D. ch.와 J. Č. 의해 지원 되었다 교육, 젊음 및 스포츠 국가 지속 가능성 프로그램 내에서 체코의 난 (NPU 나), 번호 LO1415를 부여. J. Č. 또한 지원 했다가 CR, 부여 번호 18-24397S. 악기 및 기타 시설에 대 한 액세스는 시스템 생물학 C4SYS (아무 LM2015055 프로젝트)에 대 한 체코 연구 인프라에 의해 지원 되었다. M. A. S. [no. 14-14-00904] 러시아 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 남조류 재배

<ol><li>Synechocystis 셀 삼각 플라스 크 또는 photobioreactors10,19 (예를 들어, 17 mM HEPES10를 사용 하 여) &lt; 10의 pH를 유지 하기 위해 버퍼 BG11 중간20 에서 육성. 참고: 표준 재배 조건 필요 제어 온도 (일반적으로 30 ℃, 최적 온도 35 ° C)21, 조명 (800 µmol [광양] 최대 강도의 일반적으로, 하얀 빛 / [m2·s])21, 그리고 CO 2 공급 (400 mL 평면 패널 photobioreactor CO2 농도 포화 성장 1700 ppm 이다)21.</li>
	<li>문화의 밀도 확인 하려면 spectrophotometrically 730에서 문화 광 밀도 측정 nm (OD730) 또는 빛 경로 1 cm.의 베트를 사용 하 여 현미경으로 hemocytometer 또는 자동화 된 셀을 사용 하 여 셀의 개수 카운터입니다.</li>
</ol>2. 샘플 준비
<ol><li>Phycobiliprotein 저하를 방지 하기 위해 낮은 irradiance에서 동작.</li>
	<li>안전 잠금 관에 문화 현 탁 액의 3 x 1 mL를 수확. Triplicates를 사용 하 여 측정에서 기술적 오류 추정에 대 한. 무 균 조건 하에서 문화 샘플링을 수행 하려면 층 류 후드에 세포를 수확 하 고 적절 한 작업 및 안전 관행에 따라.</li>
	<li>15000 x g 에 5 분 제대로 균형된 원심 분리기로 터에 관심을 지불에 대 한 실험실 온도에서 세포 원심 원심, 후는 supernatants 삭제 합니다. 수는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>냉동 실에 샘플을 넣어. 장기 저장을 위한-80 ° c.에 샘플을 계속 이것은 phycobiliprotein 저하를 방지 해야 합니다. 단기 저장을 위해,-20 ° C 충분 하다.</li>
	<li>Freeze-dry 샘플 하룻밤. 적절 한 동결 과정에 대 한 동결 건조 기 콘덴서-60 ° c의 온도 유지 하 고 동결 건조 기에서 압력 챔버 1 hPa.</li>
	<li>마친 후 동결 주기, 튜브 공기에서 물의 재흡수를 방지 하기 위해 가능한 한 빨리 닫습니다.</li>
</ol>3. 세포 균질 및 추출 색소
<ol><li>각 샘플 튜브 (직경 2 mm)와 유리 구슬의 4 조각을 추가 하 고 튜브를 닫습니다. 참고: 때 균질 사용 안전 잠금 튜브의 뚜껑은 너무 얇은, 그것은 깨뜨릴 수 있는 동안 균질; 따라서, 강한 뚜껑만 안전 잠금 튜브는이 프로토콜에 대 한 것이 좋습니다.</li>
	<li>15 유리 구슬과 샘플 균질 실험실 온도에서 균질 화기에 s. 참고: 제대로 무 균된 샘플 안전 잠금 튜브의 전체 내부 표면에 전염 됩니다.</li>
	<li>1 mL PBS 버퍼 (pH 7.4)의 phycobiliproteins을 추출 하기 위해 샘플을 4 ° C에 precooled를 추가 합니다. 참고:이 단계에서 추출 된 단백질의 저하를 방지 하기 위해 얼음에 샘플 계속. 이것은 중요 한입니다.</li>
	<li>5 샘플 PBS 믹스 실험실 온도에서 균질 화기에 s. 참고: 혼합 후, 샘플은 녹색.</li>
	<li>혼합 후, 샘플 60 분 커버에 대 한 얼음에 색소 저하를 방지 하기 위해 뚜껑 얼음 목욕 유지.</li>
	<li>Phycobiliprotein 추출의 60 분, 후 5 분 원심 분리기 회전자를 제대로 균형에 관심을 지불에 대 한 4 ° C에서 15000 x g 에서 샘플 원심. 참고: 원심, 후에 상쾌한 시안색 파란색이 있다.</li>
</ol>4. Phycobiliprotein 정량화
<ol><li>Spectrophotometric 측정 하기 전에 빈으로 PBS 버퍼를 사용 하 여 기준선을 분 광 광도 계를 보정.</li>
	<li>분 광 광도 계 보정은 일단 무시 한 분 광 광도 계 베트에서 PBS 고 폐기 버퍼 대신 추출된 phycobiliproteins와 상쾌한 플라스틱.</li>
	<li>Phycobiliprotein 농도 spectrophotometrically, 0.5의 슬릿 폭을 사용 하 여 계량 nm.<ol>
<li>Phycocyanin와 615에서 빈 PBS 버퍼에 대 한 allophycocyanin phycocyanobilins의 흡 광도 측정 (615) 및 652 nm (652), 각각, 720에 세포질 파편의 흡 광도 측정 하 고 nm (720).</li>
		<li>Phycocyanin와 방정식에 따르면 allophycocyanin의 (1) 및 (2) 베넷과 Bogorad12의 농도 계산. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq2.jpg"> 참고:615,652및720 는 분 광 광도 계의 선형 흡 광도 범위에 적합 해야 한다. 필요한 경우, PBS 버퍼와 샘플을 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원래 샘플에 안료 농도 다시 계산. 샘플에서 안료 농도 방정식 (1) 및 (2) 사용 될 때 1 mL의 문화 및 추출 버퍼의 1 mL는 분석의 결과와 직접 해당 합니다. 박테리아 샘플 PBS 버퍼의 다른 볼륨을 사용 하는 경우 최종 안료 농도 식 (3)에 따라 계산 해야: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq3.jpg">(3) 참고: 셀 건조 중량 당 정규화 phycobiliprotein 콘텐츠, 경우 최종 안료 농도 계산 해야 방정식 (4)에 따라<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq4.jpg"> (4)</li>
</ol>5. (선택 사항) 셀 건조 중량의 결정
<ol><li>3 빈 안전 잠금 튜브 분석 균형에 무게. 주의: 그것은 중요 안전 잠금 튜브는 건조입니다. 젖은 환경에 튜브를 저장 하는 경우 동결 건조 하기 전에 그들을 무게에 몇 시간 동안 튜브를 건조. 부드럽게 튜브를 조작 및만 손으로 파우더 무료 장갑 낀 자료와 연구자의 손가락 사이 어떤 접촉을 피하기 위해. 모든 소유자를 유지 하 고 깨끗 한 관에 자료의 전송을 방지 하기 원심.</li>
	<li>1 x 15 mL 15 mL 원뿔 튜브에 문화 현 탁 액의 샘플.</li>
	<li>각 포함 15 mL의 물에 15 mL 원뿔 튜브 4000 x g 에서 10 분 원심 분리기로 터의 균형에 대 한 실험실 온도에서 세 개의 추가 15 mL 원뿔 튜브에에서 문화의 정지 원심 원심, 후는 상쾌한의 12 mL를 삭제 합니다.</li>
	<li>나머지 상쾌한에 펠 릿을 resuspend 하 고 혼합물의 3 x 1 mL를 피펫으로 3 1.5 mL 안전 잠금 튜브 전송. 펠 릿의 일부 남은 15 mL 원뿔 튜브에 남아, 경우에 이온된 수의 1.5 mL 원뿔 튜브, 소용돌이 또는 악수 튜브 나머지 resuspend를 작은, 및 혼합물의 3 x 0.5 mL 3 1.5 mL 안전 잠금 튜브 (이미 containi 전송에 추가 ng는 펠 릿의 3 x 1 mL)는 피 펫으로. 참고: 세 개의 1.5 mL 안전 잠금 튜브에 펠 릿을 나누어 건조 중량 측정의 기술적 오류 추정 수 있게 됩니다.</li>
	<li>원심 셀 5 분 균형에 대 한 실험실 온도에서 15000 x g 에서 1.5 mL 안전 잠금 튜브에 물 1 mL를 포함 하는 추가 1.5 mL 안전 잠금 튜브 원심 분리기 회전자. 원심, 후는 supernatants 삭제 합니다.</li>
	<li>냉동 실에 샘플을 넣어. 장기 저장을 위한-80 ° C에서 샘플을 계속 단기 저장용-20 ° C 충분 하다.</li>
	<li>Freeze-dry 샘플 하룻밤. 적절 한 동결 과정에 대 한 동결 건조 기 콘덴서-90 ° c의 온도 유지 하 고 동결 건조 기에서 압력 챔버 1 hPa.</li>
	<li>동결, 후 튜브를 닫고 샘플 분석 균형에 무게. 참고: 건조 중량 값 셀 건조 중량 당 phycobiliprotein 콘텐츠 정상화에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 모델 cyanobacterium Synechocystis에서 phycobiliprotein 콘텐츠의 정량화에 대 한 간단한 빠르고 재현할 수 방법을 설명합니다. 셀 균질, 단백질 추출과 phycocyanin와 allophycocyanin 정량화의 몇 가지 메서드를 비교 하 고 마지막 프로토콜의 모든 단일 절차의 최적의 단계 조합을 나타냅니다. 대표적인 데이터, phycobiliproteins의 콘텐츠는 빛의 강도 증가에서 Synechocystis 셀에 정량 했다. 비록 분석이 비슷한 시간 및 실험실 장비 이전 게시 방법12,13,14,,1516의 일부로,이 프로토콜의 장점은 아무 엽록소는 ...

fPhycobiliproteins는 간결한 박테리아 (Cyanophyta)에서 광 수확 안테나와 여러 진 핵 taxa (Glaucophyta, Rhodophyta의 주요 구성 요소를 나타내는 수용 성 색소 단백질 복합물 , 및 Cryptophyta)1. 그들은 phycobilisomes 라는 supramolecular 단지도 주로 발생 하 고 Cryptophyta, 어디는 phycobiliproteins 지역화는 제외한 stromal 측에 광합성 세포 막의 표면에 일반적으로 연결 되는 thylakoid 루멘2. 네 가지 유형의 phycobiliproteins 날짜까지 확인 되었습니다: 코어 allophycocyanin 및 주변 phycocyanin, phycoerythrin, 및 phycoerythrocyanin1. 주요 빛 수확 단지로 phycobilisomes 조류와 남조류의 대량 문화 생산성의 중요 한 요소 중 하나를 나타냅니다. 그것은 그 phycobilisomes 잘림 강한 빛3바이오 매스 축적을 향상 시킬 수 입증 되었습니다. 다른 한편으로, 겸손 또는 낮은 irradiance에서 안테나 잘림 결과 성장 속도 바이오 매스 축적 감소3,4. Phycobiliproteins는 상업적으로 사용 식용 염료, 의약품, 그리고 화장품 산업, 식품 첨가물, 형광 프로브 cytometry, 형광 immunoassays 및 형광 현미경 검사 법5에서 응용 프로그램과 함께.
이 프로토콜 phycobiliproteins 모델 cyanobacterium Synechocystis에서 양적 결정에 초점을 맞추고. 남조류는는 초기 oxygenic 광합성 슬에; 그들은 2.4 십억 년6이상에 대 한 지구의 생물권을 형성 되었습니다. 그들은 질소, 탄소, 산소, 및 기타 요소의 세계 생물 지구 화학적 순환에 중요 한 역할을 한다. 박테리아, 중 단 세포 변형 Synechocystis 이후 전체 게놈으로 첫 번째 cyanobacterium 독특한 위치를 얻은 시퀀싱7,8, 그것은 자연스럽 게 외 인 DNA9, 변환 및 그것은 안정적이 고 비교적 빠른 성장10,11을 수행합니다. Synechocystis, 핵심 안테나 구성에서에서 allophycocyanin, 완전 한 막 단백질 연관 이며 연결 된 phycocyanin thylakoid 막 주변에 위치 하 고 있습니다.
이 프로토콜 내에서 phycobiliprotein 추출 및 정량화에 대 한 여러 가지 방법은 비교 합니다. Synechocystis, 뿐만 아니라 다른 박테리아 변종, Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira 를 포함 하 여 최종 추출 절차 성공적으로 적용 했다 빨강 조류 Porphyridium cruentumsp., 그리고 Nostoc sp., 그것은 또한 성공적으로 적용 했다. 따라서,이 프로토콜에 개발 하는 방법 phycobiliprotein 추출에 대 한 보편적인 방법으로 여겨질 수 있다. 높은 phycobiliprotein 엽록소에 잔류물의 낮은 콘텐츠 함께 수익률 제공 여기 추출 절차를 설명 된 테스트 추출 방법의 일부 높은 총 단백질 수율 결과, 비록는 phycobiliprotein 압축을 풉니다. 엽록소의 한 콘텐츠를 줄이는 올바른 phycocyanin와 allophycocyanin spectrophotometric 정량화에 대 한 필수적 이었다.
Phycobiliprotein 흡수 스펙트럼 다양 한 조류와 박테리아 종12,13,14,15,,1617 크게 다를 수 있으며 심지어 중 단일 박테리아 속18의 여러 변종. 따라서, 특정 파장 및 흡수 계수 phycocyanin 및 Synechocystis 에 allophycocyanin에 사용 된 다른 계통에 일반적으로 적용 되지 않습니다. 또한, Synechocystis 는 phycoerythrin와 일부 다른 조류와 박테리아에서 찾을 수 있는 phycoerythrocyanin를 포함 하지 않습니다. Phycobiliproteins 긴장 Synechocystis이외에 결정을 위해 각 변형에 대 한 spectrophotometric 방정식을 개별적으로 평가 하는 것이 좋습니다.
프로토콜 포함 2 개의 더 단계 (하룻밤 셀룰러 펠 릿 및 1 시간 단백질 추출의 동결), 비록 phycobiliproteins 정량화에 대 한 총 노동 시간 보다 2 시간 이상 이다.

<table><tbody><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>Institut Pasteur, Paris, France</td><td>6803</td><td>시아노박테리움 균주</td></tr><tr><td>Roti-CELL PBS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>9143.1</td><td>인산염 완충 식염수(PBS) 용액, pH 7.4</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock tubes&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburk, Germany</td><td>30120086</td><td>Safe-lock tubes 1.5 ml</td></tr><tr><td>VWR 80-Place Storage System</td><td>VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA</td><td>30128-282</td><td>Safe-lock 튜브 홀더&nbsp;</td></tr><tr><td>RAININ 100 &마이크로; L -1000 &마이크로; 엘&nbsp;</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA</td><td>17014382</td><td>피펫</td></tr><tr><td>GP-LTS-A-1000&micro; L-/F-768/8</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA</td><td>30389272</td><td>피펫 팁</td></tr><tr><td>Rotina 420R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Germany</td><td>4701</td><td>1.5 ml 안전 잠금 튜브 및 15 ml 원추형 원심분리기 튜브용 냉장 원심분리기</td></tr><tr><td>LCexv 4010</td><td>Liebherr, Bulle, Switzerland</td><td>9005382197172</td><td>냉장고 및 냉동고 -20&nbsp; &데그; C</td></tr><tr><td>Revco ExF -86&deg; C 직립형 초저온 냉동고</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>EXF24086V&nbsp;</td><td>냉동고 -80&nbsp; &데그; C</td></tr><tr><td>CoolSafe</td><td>LaboGene, Liller&oslash; d, 덴마크</td><td>7.001.000.615</td><td>동결 건조기&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-2600</td><td>Shimadzu, 교토, 일본</td><td>UV-2600</td><td>분광 광도계&nbsp;</td></tr><tr><td>Hellma 흡수 큐벳, 세미 마이크로</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국</td><td>Z600288&nbsp;</td><td>VIS/UV-VIS 반마이크로 큐벳 0.75-1.5 ml, 스펙트럼 범위 200-2500 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Silamat S6</td><td>Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein</td><td>602286WU</td><td>균질화기&nbsp;</td></tr><tr><td>고체 유리 구슬</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>Z273627</td><td>지름의 유리 구슬 2&nbsp; mm</td></tr><tr><td>CPA225D-0CE</td><td>Sartorius AG, G&ouml; ttingen, 독일</td><td>SECURA225D-1OBR</td><td>분석 저울</td></tr><tr><td>C-Phycocyanin from Spirulina sp.&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국</td><td>P2172</td><td>Phycocyanin 표준</td></tr><tr><td>Allophycocyanin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>A7472</td><td>Allophycocyanin 표준</td></tr><tr><td>Bicinchoninic Acid Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>BCA1, B9643</td><td>총 단백질 결정을 위한 완전한 키트</td></tr><tr><td>AlgaeTron&nbsp;</td><td>Photon System Instruments Ltd., Dr&aacute; sov, 체코 AG</td><td>130-ECO&nbsp;</td><td>E. 플라스크용 배양실, 제어 가능한 빛과 분위기</td></tr><tr><td>광생물반응</td>기 <td>Photon System Instruments Ltd., Dr&aacute; sov, 체코 공화국</td><td>FMT-150</td><td>완전히 제어 가능한 환경을 가진 시아노박테리아 및 조류를 위한 재배 장비</td></tr><tr><td>셀로미터&nbsp;</td><td>Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA</td><td>Auto M10</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>Corning 15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>CLS430791&nbsp;</td><td>건식 웨이그 샘플링을 위한 15ml 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>Herasafe KS</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬</td><td>51024579</td><td>층류 후드</td></tr></tbody></table>

spectrophotometric cyanobacterium synechocystis 에서 phycobiliprotein 콘텐츠 결정

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

이것은 모델 cyanobacterium Synechocystisphycobiliprotein 콘텐츠의 양적 결정에 대 한 간단한 프로토콜 이다. Phycobiliproteins 있습니다 phycobilisomes, 박테리아에서 주요 광 수확 안테나의 가장 중요 한 구성 요소와 여러 조류 taxa. Synechocystis 의 phycobilisomes 포함 두 phycobiliproteins: phycocyanin와 allophycocyanin. 이 프로토콜은 간단 하 고, 효율적인, phycocyanin와이 모델 cyanobacterium에서 allophycocyanin의 양적 결정에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 우리는 phycobiliprotein 추출 및 spectrophotometric 정량화의 몇 가지 메서드를 비교. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 추출 절차는 Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., 같은 다른 박테리아 변종에도 성공적으로 적용 했다 그리고 Nostoc sp., 또한 레드 조류 Porphyridium cruentum로. 그러나, 다양 한 taxa에서 특정 phycobiliproteins의 소멸 계수 다를 수 있습니다 그리고 그것은, 따라서, 개별적으로 모든 단일 스트레인에 대 한 spectrophotometric 정량화 방법의 유효성을 검사 권장. 프로토콜은 시간이 좀 필요 하 고 그것만 표준 장비를 필요로 하기 때문에 모든 표준 생명 과학 실험실에서 수행할 수 있습니다.

초기 메서드 테스트에 대 한 Synechocystis BG11 재배 매체20 (17 mM HEPES 보충) 25 ° C, 50 µmol (광자)의 농도의 따뜻한 하얀 빛 아래에서 재배 통에 삼각 플라스 크에 배치 문화로는 / (m 2·s)와 1% CO2 자란 분위기에. 재배 기간 동안 문화 안전 잠금 튜브로 샘플링 된 centrifuged (15000 x g 5 분 동안 실험실 온도에서)는 상쾌한, 폐기 및 샘플 중-80 ° C에 저장 되었고 동결에 대 한 준비로는 이 프로토콜의 각 단계 또는-20 ° C 또는 추출 및 quantifications 비교 분석-80 ° C에 저장.
테스트 추출 절차 쥡니다, PBS 버퍼 및 동결 해빙 내 지 르 코니 아...

여기, 선물이 양적 phycobiliprotein cyanobacterium Synechocystis spectrophotometric 메서드를 사용 하 여에서 콘텐츠를 결정 하는 프로토콜. 추출 프로시저 또한 성공적으로 다른 박테리아 및 조류 긴장;에 적용 했다 그러나, 안료 흡수 스펙트럼에 있는 변이 때문 그것은 각 스트레인에 대 한 spectrophotometric 방정식을 개별적으로 테스트 하는 데 필요한입니다.

Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 분광광도법(spectrophotometric method)을 사용하여 cyanobacterium Synechocystis 모델의 phycobiliprotein 함량을 정량적으로 결정하는 것입니다. phycobiliproteins는 수용성 색소-단백질 복합체로, 원핵 생물 시아노박테리아(prokaryotic cyanobacteria)와 여러 그룹의 진핵 조류(eukaryotic algae)에서 광 수확 더듬이의 주요 구성 요소를 나타냅니다. 이들은 주요 광 수확 복합체이기 때문에 phycobiliprotein은 조류와 시아노박테리아의 생산성을 결정하는 중요한 요인 중 하나입니다.Synechocystis는 전 세계 수백 개의 실험실에서 사용되는 모델 시아노박테리아입니다. Synechocystis는 phycocyanin과 allophycocyanin의 두 가지 phycobiliprotein을 포함합니다. 이 프로토콜은 이 곰팡이 균주에서 두 phycobiliprotein의 정량적 측정을 위한 간단하고 효율적이며 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.우리는 여러 가지 방법, phycobiliprotein 추출 및 분광 광도계 정량화를 비교했습니다. 정량화 방법은 phycobiliproteins 흡수 스펙트럼이 다른 균주마다 다를 수 있으므로 모든 단일 균주에 대해 테스트해야 합니다. phycobiliprotein 추출이 시작될 때 1ml의 시아노박테리아 배양액을 safe-lock 튜브로 옮깁니다.샘플의 건조 중량을 측정하기로 결정한 경우, 배양 샘플링 전에 빈 튜브의 무게를 측정하십시오. 배양이 침전되지 않았는지 확인하십시오. 15, 실험실 온도에서 000G에서 5분 동안 세포를 원심분리하십시오.상층액을 조심스럽게 버리십시오. 펠릿을 방해하지 마십시오. 샘플을 냉동실에 넣으십시오.장기 보관을 위해 샘플을 섭씨 80도로 유지하십시오. 이것은 phycobiliprotein의 분해를 방지하는 데 필요합니다. 샘플이 얼면 동결 건조기에 넣습니다.동결 건조가 시작되면 동결 건조기의 온도와 압력을 확인하십시오. 온도는 섭씨 60도 미만이어야 하고 압력은 약 1헥타르 파스칼이어야 합니다. 샘플을 밤새 동결 건조합니다.동결 건조 과정을 마친 후에는 공기에서 물이 재흡수되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 튜브를 닫으십시오. 각 샘플 튜브에 2밀리리터 유리 구슬 PC 4개를 추가합니다. 유리 구슬로 샘플

spectrophotometric-determination-phycobiliprotein-content

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

출처: Weber, N. et. al., 필라멘트 시아노박테리움 포르미디움 라쿠나의 자연 변형, 단백질 발현 및 냉동 보존. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 사상체 시아노박테리아의 광주성을 연구하기 위한 집중된 LED 기반 분석을 보여줍니다. 박테리아는 광원을 향해 이동하여 조명 중심에 조밀한 축적물을 형성하며, 이는 캡처된 이미지의 픽셀 강도 분석을 통해 시각화되고 정량화됩니다.

집중광 조명을 이용한 사상체 시아노박테리아의 광주성 분석

출처: Jiang, H., Ho, M. 시아노박테리아에서 온전한 피코빌리좀의 분리 및 특성화. J. Vis. Exp.(2021).이 비디오는 이산화탄소 공급과 영양이 풍부한 조건으로 지속적인 조명 하에서 세포를 성장시킨 다음 원심분리를 통해 수확하여 바이오매스를 얻기 위해 시아노박테리아를 배양하는 절차를 보여줍니다.

바이오매스 생산을 위한 시아노박테리아 배양 준비

출처: 잔, Y. 외 광표백은 시 아노박테리아 프로클로로코커스의 FtsZ 고리의 초해상도 이미징을 가능하게 합니다. J . Vis. Exp. (2018).이 영상은 저온 환경에서 제논 빛을 이용해 남세균 세포에서 광표백하는 과정을 시연하여 성장 조절 단백질의 형광 이미징을 개선합니다.

성장 조절 단백질 영상을 위한 시아노박테리아 색소 광표백

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

여기 우리는 박테리아의 autofluorescence를 줄이기 위해 photobleaching 메서드를 설명 합니다. Photobleaching, 후 확률적 광학 재건 현미경 cyanobacterial FtsZ 반지의 3 차원 슈퍼 해상도 이미지를 얻을 하는 데 사용 됩니다.

Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능

여기서, 시안박테리아 방출 된 탄수화물 중합체의 분리 및 그들의 엑소프로테옴의 격리에 대한 프로토콜이 설명된다. 두 절차 모두 추가 분석 또는 응용 분야에 사용할 수 있는 고순도의 중합체 또는 단백질을 얻기 위한 주요 단계를 구현합니다. 또한 특정 사용자 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

본 프로토콜은 스펙트럼 분석을 기반으로 홍조류의 phycobiliprotein 변화의 단계별 자가형광 이미징 및 평가를 설명합니다. 이것은 실험실 조건에서 희소한 물질만 사용할 수 있고 세포가 천천히 성장하거나 전혀 성장하지 않는 극한 서식지에 대한 세포 적응을 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴 방법입니다.

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Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

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