Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

이 프로토콜의 전반적인 목표는 분광광도법(spectrophotometric method)을 사용하여 cyanobacterium Synechocystis 모델의 phycobiliprotein 함량을 정량적으로 결정하는 것입니다. phycobiliproteins는 수용성 색소-단백질 복합체로, 원핵 생물 시아노박테리아(prokaryotic cyanobacteria)와 여러 그룹의 진핵 조류(eukaryotic algae)에서 광 수확 더듬이의 주요 구성 요소를 나타냅니다. 이들은 주요 광 수확 복합체이기 때문에 phycobiliprotein은 조류와 시아노박테리아의 생산성을 결정하는 중요한 요인 중 하나입니다.

Synechocystis는 전 세계 수백 개의 실험실에서 사용되는 모델 시아노박테리아입니다. Synechocystis는 phycocyanin과 allophycocyanin의 두 가지 phycobiliprotein을 포함합니다. 이 프로토콜은 이 곰팡이 균주에서 두 phycobiliprotein의 정량적 측정을 위한 간단하고 효율적이며 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

우리는 여러 가지 방법, phycobiliprotein 추출 및 분광 광도계 정량화를 비교했습니다. 정량화 방법은 phycobiliproteins 흡수 스펙트럼이 다른 균주마다 다를 수 있으므로 모든 단일 균주에 대해 테스트해야 합니다. phycobiliprotein 추출이 시작될 때 1ml의 시아노박테리아 배양액을 safe-lock 튜브로 옮깁니다.

샘플의 건조 중량을 측정하기로 결정한 경우, 배양 샘플링 전에 빈 튜브의 무게를 측정하십시오. 배양이 침전되지 않았는지 확인하십시오. 15, 실험실 온도에서 000G에서 5분 동안 세포를 원심분리하십시오.

상층액을 조심스럽게 버리십시오. 펠릿을 방해하지 마십시오. 샘플을 냉동실에 넣으십시오.

장기 보관을 위해 샘플을 섭씨 80도로 유지하십시오. 이것은 phycobiliprotein의 분해를 방지하는 데 필요합니다. 샘플이 얼면 동결 건조기에 넣습니다.

동결 건조가 시작되면 동결 건조기의 온도와 압력을 확인하십시오. 온도는 섭씨 60도 미만이어야 하고 압력은 약 1헥타르 파스칼이어야 합니다. 샘플을 밤새 동결 건조합니다.

동결 건조 과정을 마친 후에는 공기에서 물이 재흡수되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 튜브를 닫으십시오. 각 샘플 튜브에 2밀리리터 유리 구슬 PC 4개를 추가합니다. 유리 구슬로 샘플을 15초 동안 균질화합니다.

적절하게 균질화된 샘플이 안전 잠금 튜브의 전체 내부 표면에 퍼집니다. 세포 균질화 후, phycobiliprotein을 추출하기 위해 샘플에 1ml의 인산염 완충 식염수를 추가합니다. PBS의 최적 pH는 약 7.4입니다.

균질화기에서 5초 동안 세포를 PBS와 혼합합니다. 이를 통해 효율적인 phycobiliprotein 추출을 위한 최적의 시료 혼합을 확보할 수 있습니다. 혼합 후 샘플은 녹색을 띱니다.

가장 효율적인 phycobiliprotein 추출을 위해 샘플을 얼음 위에 60분 동안 보관하십시오. 적출 후에, 5 분 동안 15의, 000 G 및 4 섭씨 온도에 표본을 분리기. 원심분리 후 상등액은 청록색을 띱니다.

분광광도계를 측정하기 전에 PBS를 블랭크로 사용하여 분광광도계를 보정합니다. 분광 광도계가 보정되면 하나의 분광 광도계에서 PBS를 버리고 버려진 완충액 대신 추출된 phycobiliprotein으로 상등액을 피펫팅합니다. 피코시아닌(phycocyanin) 및 알로피코시아닌(allophycocyanin) 정량화를 위해 추출된 피코빌리단백질(phycobiliproteins)이 있는 상등액은 615, 652 및 720 나노미터에서 측정됩니다.

텍스트에 설명된 바와 같이, 문헌에 알려진 phycobilisomes 정량화를 위한 몇 가지 방정식이 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 방정식은 피코시아닌과 알로피코시아닌 농도가 안료와 점과 가장 상관관계가 높은 것으로 밝혀졌습니다. 프로토콜의 중요한 단계는 세포 균질화 및 추출이며, 이는 높은 수율과 높은 특이성을 모두 제공해야 합니다.

우리는 초음파 처리에 의한 세포 파괴, 지르코니아 비드를 사용한 균질화 또는 세포 연결 동결과 같은 여러 추출 절차를 테스트했습니다. 이 프로토콜의 방법은 가장 높은 phycobilisome 수율을 제공했습니다. 엽록소에 의한 단백질 추출물의 작은 오염조차도 phycobiliproteins 함량 과대 평가로 이어질 수 있기 때문에 세포에서 엽록소 추출을 피할 필요가 있습니다.

우리는 미처리 추출물에서 엽록소를 검출 한 다음 세포 파괴를 위해 초음파 처리를 사용했습니다. 반복되는 초음파 처리 주기로 엽록소 농도가 증가했습니다. 균질화 시간은 15초로 최적화되었습니다.

5초와 20초 모두에 대한 균질화는 약간 더 낮은 수율을 제공했습니다. PBS 완충액 또는 물에 염화나트륨 또는 염화칼륨을 첨가해도 아세트산나트륨 완충액에서의 추출과 동일하게 phycobiliprotein 추출 효율이 증가하지 않았습니다. phycobiliprotein 추출 시간은 120분, 심지어 240분 후에도 phycobiliprotein 농도가 크게 변하지 않았기 때문에 60분 동안 최적화되었습니다.

615, 652 및 720 나노미터의 흡광도가 분광 광도계의 근흡광 범위에 맞는지 확인하십시오. 이 프로토콜에 사용된 분광 광도계는 0.1에서 3 사이의 근흡광 범위를 보여줍니다. 우리는 문헌에서 알려진 분광광도계 phycobiliproteins 정량화의 여러 방정식을 비교했습니다.

Bennett과 Bogorad의 방정식은 알려진 단백질 농도로 안료 표준물질에서 피코시아닌과 알로피코시아닌 함량을 모두 가장 잘 재구성했습니다. 개별 방정식 간의 차이는 특정 유기체의 phycobiliproteins 소멸 계수의 변화와 관련이 있습니다. 스트렙토 마이신 설페이트의 사용은 초음파 처리가 적용되거나 회피 된 샘플에서 엽록소 A의 감소로 이어지지 않았습니다.

대표적인 데이터로서, Synechocystis 세포의 phycobiliproteins의 함량을 측정하였다. phycobiliproteins 함량은 증가하는 빛에서 감소했습니다. 이 프로토콜은 모든 표준 생과학 실험실에서 수행할 수 있는 서면 안료 분석에 대한 시간 및 장비 요구 사항을 최소화하기 위해 수립되었습니다.

또한 프로토콜에는 세포 펠릿의 동결 건조 및 단백질 추출과 같은 두 가지 다른 단계가 포함되어 있습니다. phycobilisomes 정량화를 위한 총 노동 시간은 2시간을 넘지 않습니다.