Name: 동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 배우세요 절연된 마우스 심장에서 폴리솜 프로파일링을 통한 동적 단백질 합성 분석 방법입니다. 이 기술은 심장 스트레스 반응에서 번역되는 mRNA와 miRNA를 식별하여 심장 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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NIH P01 HL112730 (걸 레, JVE), NIH R01 HL132075 (걸 레, JVE), 바브라 스 트라이 샌드 여자의 심장 센터 (걸 레, JVE), 도로시와 E. 필립 리옹 분자 심장 (걸 레)에서 자, 에리카 글 레이저 부여 여성의 심장 건강 (JVE)에 체코 과학 아카데미의의 자 제도적 지원 RVO: 68081715 (MS)

모든 동물 연구 기관 지침에 따라 수행 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 삼목 시 나이 의료 센터에 의해 승인 했다.
1. Langendorff 마우스 심장의 관류
<ol><li>
국 소 빈 혈과 reperfusion 마우스 마음의 Langendorff 관류
	<ol>
<li>관리 복 pentobarbital 나트륨 70 mg/kg 성인 마우스 (8 주 오래 된, 남성, C57BL6/j). 핀치를 발 끝에 철수의 부족에 의해 깊은 마 취를 확인 합니다.</li>
		<li>복 덤플링 500와 Anticoagulate U/kg.</li>
		<li>Sternal 절 개를 통해 가슴을 엽니다. 횡 경 막 열고 앞쪽 액 축에 늑 골 경계를 따라 잘라. 그런 다음 완전히 흉부 새 여 forelimb까지 앞쪽 액 축 잘라. 후, 마음을 시각화, 집게와 오름차순 대동맥을 클램프 하 고 마음을 빠르게 삭제할. 죽음은 exsanguination 때문 이다. 차가운 Krebs에서 마음을 배치 (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/L, KH2포4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, 포도 당 2 g/L와 CaCl2 0.373 g/L).</li>
		<li>블런트 팁 바늘으로 대동맥을 cannulate 하 고 perfuse retrogradely 일정 한 압력 모드로 Krebs 솔루션으로 마음.</li>
		<li>안정화 기간 후 15 분, 30 분 뒤에 30 분 동안 reperfusion 글로벌 아니 흐름 허 혈을 심장 주제.</li>
		<li>초기 관류 15 분, 30 분 허 혈, 또는 30 분 reperfusion 마음을 수확. 심 방에서 트리밍합니다 그리고 스냅-동결 조직 액체 질소.</li>
		<li>사용까지-80 ° C에서 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 조직 균질, 가용 화, 그리고 자당 밀도 그라데이션 침전
<ol><li>
그라데이션 준비
	<ol>
<li>100ml 자당, NaCl 2.5 M; 4 mL를 혼합의 2 솔루션 (15%, 50%)를 준비 0.8 mL MgCl2 1.25 M; 1 mL Tris HCl 1 M, pH 7.5; 15 g 또는 자당의 50 g (15%와 50%, 각각); 100 mL; 도달 초순 그리고 15% 솔루션을 자일 렌 cyanol (0.02 mg/mL)</li>
		<li>각 솔루션 (0.22 μ m 필터) 필터</li>
		<li>그라디언트 사용 될 것 이다 날 각 자당 솔루션의 40 mL를 준비 하 고 cycloheximide 100 µ g/mL의 최종 농도 달성 하기 위해 각 솔루션에 추가<ol>
<li>그라데이션 메이커를 사용 하 여 15%와 50% 자당 해결책 사이 혼합을 준비</li>
			<li>15% 자당 기온 변화도의 5 mL와 함께 왼쪽된 칸 채우기</li>
			<li>오른쪽 구획 50% 자당 그라데이션으로 채우기</li>
			<li>수도 꼭지를 열고 자력으로 두 개의 작은 구획을 저 어을 펌프에 전환</li>
			<li>튜브를 사용 하 여 혼합된 자당 솔루션 얇은 벽 울트라 원심 분리 관에 흐름을 허용 하도록 두 번째 탭에 연결. 마지막 볼륨 약 10 mL를 있을 것입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4 ° C에서 그래디언트를 유지 (필요한 경우, 하룻밤 하지만 되지 더 이상)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
심 혼 직물의 균질 화
	<ol>
<li>균질 (자당 그라데이션 분별에 대 한 수정)는 필터링 된 세포의 용 해 버퍼에서 polytron와 신선 또는 냉동 하트 100 m m KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.4% 포함 된 NP-40. Cycloheximide 100 µ g/mL polysome 구조, 0.1 U RNase 제와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (1 태블릿 50 ml)을 유지 하기 위해 포함 됩니다.</li>
		<li>품 어는 lysate에 15 분을 얼음.</li>
		<li>불용 성 물질을 제거 하는 상쾌한 수집 4 ° C에서 15 분 18000 x g 에서 원심.</li>
		<li>단백질 결정, RNA 격리 및 RNA 무결성 분석 ( 그림 2참조)에 대 한 50 µ L를 보유 합니다.</li>
		<li>그래디언트 위에 상쾌한 (500-100 µ L) 레이어를 세포의 용 해 버퍼 튜브를 균형.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
침전 및 분수의 컬렉션
	<ol>
<li>37000 rpm 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 120 분 ultracentrifugation를 수행 합니다. 제조 업체에 따라이 최대 반경에서 228000 x g 에 해당합니다.</li>
		<li>254에서 흡 광도의 지속적인 감시와 함께 microcentrifuge 튜브에서 17 분수 (분수 약 600 µ L)으로 각 그라디언트를 수집 nm (OD254).</li>
		<li>다음과 같이 분수 수집기 프로그램:<ol>
<li>(그라데이션 하기 전에 튜브에 포함 된 액체에 해당) 하는 컬렉션의 첫 번째 3 분 삭제</li>
			<li>19 분 4, 17 분수에 1 mL/min의 속도로 분수를 수집 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 수집 되 자 마자 얼음에는 분수를 놓습니다. 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우-80 ° C에서 샘플을 동결. 그라데이션의 전형적인 UV densitometric 추적 수집은 그림 1에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 절연 및 Polysome Nontranslating 분수에서 mRNAs의 분석
<ol><li>
MRNA의 추출
	<ol>
<li>만약 그들이 플래시-냉동 컬렉션 후 얼음에 분수를 녹여</li>
		<li>신선한 튜브 각 분수의 200 µ L 전송 참고:이 단계에서 두 개 이상의 연속 분수 수 수 풀링된 함께. 그것은 행해져야 한다 신중 하 게 polysome 및 비 polysome 분수 혼합 하지 않습니다 있도록 OD254 그래프를 분석 후.</li>
		<li>10 추가 luciferase 정규화 목적을 위해 각 샘플에 내부 제어로 RNA의 ng. 참고: Luciferase 뇌관 해야 사용 내부 통제로 결과 정상화.</li>
		<li>각 튜브를 RNA 추출 시 약 (페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션; 참조 테이블의 재료)의 700 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 RT (실내 온도)에서 5 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>실시간에 2-3 분 15 미 품에 대 한 140 µ L 클로 프롬 및 소용돌이 추가</li>
		<li>4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분에 대 한 샘플을 원심</li>
		<li>신중 하 게 새로운 튜브 위 수성 단계 전송.</li>
		<li>분수의 RNA 콘텐츠 높은 이므로, 각 튜브를 캐리어로 glycogen의 10 µ g을 추가 합니다.</li>
		<li>각 튜브를 350 µ L 소 프로 파 놀을 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 수익률을 높이기 위해 1 시간-20 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분 동안 원심 분리기</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 추가 700 µ L 에탄올 75 %RNA 펠 릿을 세척 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 7500 x g 에 5 분 동안 원심 분리기</li>
		<li>에탄올을 제거 하 고 펠 릿 어 10-15 분 동안 건조 하자. 참고:-RNA 펠 릿 건조 물에 그것의 완전 한 가용 화가 되지 것입니다.</li>
		<li>RNase 무료 초순 H2o.의 50 μ에 RNA 펠 릿 resuspend</li>
		<li>55 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어</li>
		<li>각 샘플의 2 μ를 사용 하 여 추출 된 RNA의 양과 품질을 측정 하 여-80 ° c.에 나머지를 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반전 녹음 방송 및 정량
	<ol>
<li>반전 녹음 방송 cDNA 합성의 4 μ를 사용 하 여 20 μ 반응 ( 재료의 표참조)을 키트. 샘플의 수에 따라 supermix을 준비 합니다. 각 관에 필요한 볼륨을 전송 하 고 각 관에 입력 RNA의 5 μ를 추가 합니다. 이 볼륨은 Taq 중 합 효소 근무 조건 범위에 대 한 관련성이 수정 될 수 있습니다.</li>
		<li>제조업체에서 권장 하는 다음 프로그램으로 열 cycler에 튜브를 품 어: 25 ° C에서 5 분, 20 분 반전 녹음 방송에서 46 ° C, 20 분 동안 95 ° c.에 1 분 동안 역전사 비활성화</li>
		<li>정량 Pcr 뇌관의 각 쌍에 대 한 최적화 된 프로그램으로 실행 합니다. 참고: 분수에 특정 mRNAs의 존재를 감지, (격리 된 RNA)의 각 부분에서 동일 볼륨 반전 녹음 방송에 대 한 사용할 수 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
결과의 분석
	<ol>
<li>관심 있는 유전자와는 luciferase Ct 값을 사용 하 여 델타 Ct 값 계산</li>
		<li>다른 분수 (표 1)에 걸쳐 있는 mRNA의 분포를 시각화 하는 모든 분수에 포함 된 총 mRNA 값의 백분율로 각 분수 델타 Ct 값을 표현</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 절연 및 Polysome 분수와 Nontranslating 분수에서 miRNAs의 분석
<ol><li>
MRNA와 미르 추출 참고:이 프로토콜 몇 가지 변화 제조업체의 지침을 따릅니다.<ol>
<li>글 리 코겐 및 스파이크 컨트롤 해 동. 얼음에 계속.</li>
		<li>풀링된 샘플의 200 µ L를 미르 추출 시 약의 700 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>Glycogen의 µ 1 µ g/L을 추가 하 고는 피 펫을 사용 하 여 균질. 실 온에서 5 분 동안 그것을 품 어.</li>
		<li>1.6 제어 스파이크에서 108 x의 3.5 µ L을 추가 하 고 그것을 혼합.</li>
		<li>클로 프롬 및 소용돌이의 200 µ L 추가 적어도 15 초 동안 그것.</li>
		<li>실내 온도에 3 분 동안 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여, 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송. 중간 및 아래 단계를 삭제 합니다.</li>
		<li>100% 에탄올 1.5 x 볼륨은 상쾌한을 추가 섞는다.</li>
		<li>미르 추출 열에이 혼합물의 700 µ L를 전송 및 15에 대 한 최고 속도로 원심 RT와 흐름; 통해 삭제 s 나머지 모든 예제와 함께이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>열에 버퍼 1의 700 µ L을 추가 하 고 15 최고 속도로 원심 RT; s 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>열에 버퍼 2의 500 µ L을 추가 하 고 15 최고 속도로 원심 RT; s 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>열에 80% 에탄올 500 µ L을 추가 하 고 RT;에서 2 분에 대 한 최고 속도로 원심 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>세척제 새로운 2 mL 튜브, 뚜껑을 열고 5 분 최고 속도로 실시간에 원심을 열을 전송 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>열 및 원심 분리기 전체에 얼음에는 eluate 실시간 유지에 1 분 동안 속도 또는 미래의 분석-80 ° C에서 저장 RNAse 무료 물 16 µ L를 추가 합니다. 참고: 각 샘플의 두 microliters OD 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반전 녹음 방송
	<ol>
<li>얼음에 준비 합니다. 각 20 µ L RT-PCR 반응에 대 한 추가 미르 RT 버퍼의 4 µ L, 핵 산의 2 µ L, 총 RNA 2 µ L의 효소, RNAse 무료 물; 3 µ L의 9 µ L 그것을 혼합 하 고 짧게 스핀 다운.</li>
		<li>다음과 같이 열 Cycler 설정. 60 분;에 대 한 37 ° C 95 ° C 5 분; 4 ° C를 개최.</li>
		<li>열 cycler에서 튜브를 제거 하 고 물 RNAse 무료 200 µ L를 추가 합니다. -20 ° C에서 저장 또는 실시간 PCR로 진행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실시간 PCR 참고:이 프로토콜은 96 잘 접시 형식을 따릅니다. 얼음에 반응 혼합을 준비 합니다.<ol>
<li>PCR 반응 혼합을 준비 하 고는 프로토콜에 의해 허용 하는 범위에 따라 (위의 miRNAs) 로부터 cDNA를 추가. 여러 반응 일괄 처리에서 준비 될 수 있습니다.</li>
		<li>각 잘에서 PCR 믹스 + cDNA의 25 µ L의 합계를 추가 합니다.</li>
		<li>광 판 인감을 사용 하 여 접시를 봉인.</li>
		<li>실 온에서 1000 x g 에서 1 분 동안 접시 원심</li>
		<li>프로그램 실시간 cycler 다음과 같습니다. 15 분 동안 95 ° C에서 초기 활성화 단계 3 단계 자전거: 15 94 ° C에서 변성 s; 30 55 ° C에 어 닐 링 s; 30 70 ° C에서 확장 s (형광 데이터 수집을 수행); 추가 40 주기; 녹는-cycler 기본에 따라 곡선입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
비교 분석
	<ol>
<li>정규화의 예 ( 표 2참조):<ol>
<li>SCM의 최소 값을 찾을.</li>
			<li>모든 SCM 값이이 최소한을 정상화.</li>
			<li>(나) 관심과 참조 유전자 (REF)의 miRNAs의 Ct 값에서이 값을 뺍니다.</li>
			<li>2-ΔCt 수식을 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Proteomic 분석
<ol><li>
Polysome 분수에서 단백질의 추출
	<ol>
<li>수집 된 자당 분수를 결합 하 여 3 개의 마지막 조각으로. 무거운 (4, 5, 6 및 7 자당의 높은 농도 함께 풀링된 분수에 고효율 polysomes; 그라데이션 튜브의 아래쪽), 분수 표시 빛 (낮은 효율 polysomes 풀링된 분수 8, 9, 10, 11;의 중간에 그라데이션 튜브) 번역 비 (자당의 풀링된 분수 12, 13, 14 및 15 낮은 농도로, 그라데이션 튜브의 상단). 풀링된 분수에 단백질 분석을 수행 합니다.</li>
		<li>100% 재고 trichloroacetic 산 (TCA)를 준비 하 고 어둠 속에서 4 ° C에서 그것을 저장. 100%의 60 µ L 샘플의 0.5 mL 혼합 TCA와 어둠 속에서 하룻밤-20 ° C에서 품 어. 참고: 1.5 mL 낮은 단백질 보존 튜브 ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.</li>
		<li>밤새 부 화 후 얼음에 15000 x g30 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 원심 분리기 샘플을 녹여. 참고: 샘플에서 총 단백질의 100 µ g 튜브 하단에 보이는 단백질 펠 릿을 제공합니다.</li>
		<li>사전-20 ° C 냉장고에 아세톤을 진정. 단백질 펠 릿 및 15000 x g15 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 원심 분리기에 찬 아세톤의 0.5 mL를 추가 합니다. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>공기 건조는 펠 릿. 50 mM Tris HCl 버퍼 (pH 8)의 360 µ L에 펠 릿을 resuspend. 참고: 필요한 경우 사용 하 여 펄스 sonicator resuspend 펠 릿을.</li>
		<li>0.1 m M dithiothreitol의 40 µ L을 추가 (최종 농도 10 m m)와 0.15 M iodoacetamide의 45 분 추가 50 µ L에 대 한 셰이 커에 55 ° C에서 품 어 (최종 농도 17 m m)와 어둠 속에서 30 분 통에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>트립 신 솔루션 준비: trypsin의 20 µ g 50 m m 염화 중 탄산염의 100 µ L에서 resuspend. 1:50 (w/w) trypsin 솔루션의 해당 볼륨 샘플을 추가 트립 신: 단백질 비율을 pH 8을 확인 하 고 37 ° C에서 셰이 커에 하룻밤 사이 품 어. 참고: 추가 1 M 염화 중 탄산염 pH 8 하 려 합니다.</li>
		<li>트립 신 소화 후 멋진 벤치 원심 분리기에서 짧게 원심 분리기 샘플 추가 10% 개미 산 트립 신 활동을 끄다 샘플 담 진행을 pH 2-3에. 참고: 샘플 담 대 한 µ 차입 플레이트를 사용 합니다.</li>
		<li>상태는 매 우물에 세 번 뒤 컨디셔닝 0.1% 개미 산의 200 µ L에 의해 세 번 진공을 사용 하 여 메탄올의 200 µ L 96 잘 접시의. 샘플을 로드 하 고 세 번 0.1% 개미 산의 200 µ L를 사용 하 여 샘플 세척을 수행 합니다. 낮은 단백질 보존 0.5 mL 튜브에 두 번 50 %acetonitrile/0.1% 포 름 산의 100 µ L로 샘플을 elute. 참고: 샘플 Elute 천천히 처음에 인력을 사용 하 여 다음 낮은 진공.</li>
		<li>집중 장치를 사용 하 여 건조를 샘플 eluate 증발 하 고 하거나 직접 수행 질량 분석 분석 또는 저장소 사용까지-80 ° C에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
질량 분석 분석
	<ol>
<li>50-100 µ L에서 각 펠 릿 (tryptic 펩 티 드로 구성 된)를 다시 구성 하 고 1 µ L을 질량 분석기에 주입. 참고: 최대 강도 LC/MS/MS 신호를 재구성 및 사출 볼륨을 최적화 합니다. 우리의 경우, 최대 신호 (총 이온 전류; TIC)에 스캔의 2E9에 1E8의 범위에서 했다.</li>
		<li>트랩 열 C18 (300 µ m 아이디 x 5 m m, 5 µ m, 100Å) 다음 펩타이드 분리 C18 열 (250 m m, 2 µ m, 100Å x 75 µ m 아이디)를 사용 하 여 흐름 속도 설정은 300 nL/분 세트 나노 소스 모 세관 온도에서 275 ° C와 2 스프레이 전압 kV.</li>
		<li>5-35% B 90 분, 7 분 및 25 분 (a: 0.1% 포 름 산/물과 이기에 b: 0.1% 포 름 산) 5 %B 평형에 대 한 95 %B 3 분 35-95 %B 선형 그라데이션이 적용 됩니다. CID 모드를 사용 하 여 각 MS1 스캔에서 15 높은 강도 이온에 대 한 MS2 스펙트럼을 취득. 3 질량 분석 복제를 사용 하 여 분석 하는 각 샘플에 대 한. 참고: 최적화 하 고 실험 조건 및 특정 질량 분석 악기에 샘플에 대 한 적합 한 매개 변수를 사용 하 여. 조건/매개 변수 섹션 5.2에서에서 언급입니다. 사용 하 고 우리의 실험실에 최적화 되었다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단백질 식별/정량
	<ol>
<li>질량 분석 분석 후 원시 스펙트럼 파일 MSConvert 소프트웨어 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html)를 사용 하 여 호환 mzXML 파일으로 변환.</li>
		<li>SEQUEST 검색 엔진 검색 기준으로 예를 들어, UniProtKB/스위스-보호 마우스 데이터베이스 (가장 최신 정식 검토);로 변환 된 파일을 제출 트립 신을 사용 하 여 세미 효소 다이제스트 (KR 후 /-); 최대 2 놓친 분열; 선구자 질량 범위: 400 4500 amu; 정적 수정: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; 펩 티 드 대량 허용 오차: 50 ppm; 조각 대량 유형: monoisotopic. 참고: 다른 단백질 데이터베이스 검색 엔진 및 데이터 파이프라인 사용할 수 있습니다. 예: 쥐, 마우스 및 인간의 데이터베이스 보다 덜 완전 한 인에 대 한 데이터베이스를 사용 하 여 마우스 (또는 인간)에 대 한 검색을 할 수 있습니다 프로테옴 범위 증가 데이터베이스. 이 경우에, 단백질 이름 중복 제거 해야 합니다.</li>
		<li>포스트 검색 분석을 수행 합니다. 데이터를 보기 위한 필터를 설정 합니다. 예를 들어 95% 또는 99%, 즉, 통계 분석 의미 95% 또는 99% 확률의 샘플에 존재 하는 단백질만이 표시 됩니다 확률을 최소 단백질 (단백질 임계값)를 설정 합니다. 펩 티 드 임계값 (예: 95%)에 대 한 필터 설정 즉, 스펙트럼은 펩 티 드를 식별 하는 여부 결정에 사용 될 최소 확률. 펩 티 드 단백질 존재 인지를 결정 하는 최소 수 선택 (2 펩 티 드 단백질 식별을 위한 최소 권장).</li>
		<li>품질/수량에 대 한 확인 된 단백질을 평가 합니다. Proteotypic 펩 티 드 정량화에 사용 되는 확인 하십시오. Isoform 식별 확인 그것 특정 isoform에 고유한 아미노산 시퀀스의 구성 tryptic 펩 티 드의 관찰에 기초 합니다. 어떤 "비슷한" 또는 가상 단백질 있는지 비교 받아야 한다 관찰 알려진된 단백질에 해당 하는 펩 티 드.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
<li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Polysome 프로필 분석 특정 mRNA 또는 전체 transcriptome6,7의 변환 상태를 분석 하 여 단백질 번역의 연구에 대 한 수 있습니다. 그것은 또한 큰 도움이 현지 번역 synaptosomes8같은 공부 될 필요가 있을 때입니다. 전통적으로,이 방법은 모노-및 polyribosomes 및 자당 그라디언트는 수와 결합 게놈 또는 의도 된 결과6,9를 proteomic 기술을에 관련 된 mRNAs의 분리를 포함 한다. 예를 들어, 우리의 그룹에 의해 수행의 최근 연구는 환자 CPB, 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해 모방의 마음에서 실행 post-transcriptional 규제 메커니즘을 밝혔다. Polysome 프로 파일 분석을 이용해 우리 CPB ...

마음은 (I) 허 혈과 reperfusion 동적 방식에서 (R)의 부상에 응답합니다. 그러나, 응답 하는 동안 단백질 합성의 급성 변화에 약간의 통찰력이 있다. 이 해결 하기 위해 우리가 했다 polysome1 단백질 풍부 리보솜 및 polysomes, cytosol에서 변환 규제 요인의 재분배를 반영 하는 변화를 식별 하기 위해 프로 파일링의 기초가 튼튼한 방법의 장점 및 새로 합성된 단백질 (NSPs)에 증가. 나의 설정에서 / R, 새로운 mRNAs2;의 전사와 일치 하지 않는 시간에 발생 하는 새로운 단백질 합성의 증가 또한, mRNA 식 수준 및 단백질 풍부 사이 부조화 보고3되었습니다. 이러한 이유로, 우리는 동적 프로테옴에서 변경 내용을 분석 하는 단백질 번역에 의해 반영 하기로 결정 했다. 이렇게 하려면, 우리는 polysome 분수에서 mRNA를 계량 하 고 polysome 분수의 단백질 구성을 분석. 마지막으로, microRNAs (미르) 번역에 대 한 mRNAs의 조절 및 단백질 번역4,5의 효율을 방해할 수 있습니다, 때문에 우리 검사 polysome 분수에 미르의 배포에 초점을 맞추고는 내가 응답 / R.
우리는 지속적인 관류, 그리고 국 소 빈 혈 reperfusion의 30 분 뒤의 30 분 30 분 글로벌 아니 흐름 허 혈 후의 기저 상태에서 수확 조직과 격리 마우스 Langendorff 관류 모델을 사용 하기로 결정 했습니다. 우리 심장 조직의 solubilized 그리고 자당 기온 변화도 통해 polysomes를 분리 proteomic 분석 및 선택적 검출 mRNAs와 PCR 및 microarray, miRNAs의 각각 다음. 방법의이 조합은 mRNA, 미르, NSPs의 동시 검출 뿐만 아니라 nontranslating 분수 사이 규제 단백질, 미르, 그리고 mRNA의 재배포 가능 동적 프로테옴을 이해 하는 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 낮은 효율 polysomes, 그리고 높은 효율 polysomes ( 그림 1참조). 이 프로세스의 동적 규칙에 eIF2α 또는 mTOR 등 규제 요인의 인 산화의 더 분석 하 여 연장 됩니다. 이러한 개별 단계 이제 자세히 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>안락사에 대한</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>langendorff 준비</td></tr><tr><td>겸자에</td> 사용 <td>파인 사이언스 도구</td><td>91110-10</td><td>심장을 걸기 위해 사용</td></tr><tr><td>Langendorff 시스템</td><td>Radnoti + 집에서 만든</td><td>n / a</td><td>사용자 정의 불어 유리, 튜브 및 수조로 구성된 '4 개의 심장'시스템</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S7653-5KG</td><td>크렙스 완충액 및 자당 구배</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P5405</td><td>크렙스 완충액 및 용해 완충액</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>크렙스 완충액</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>크렙스 완충액</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G5767</td><td>크렙스 버퍼</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>크렙스 완충액</td></tr><tr><td>자당 분말</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>자당 구배</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>자당 구배 및 용해 완충액</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>자당 구배 및 용해 완충액</td></tr><tr><td>Xylene Cyanole</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>자당 구배</td></tr>, <tr><td>Cycloheximide</td><td>시그마-알드리치</td><td>, 239763</td><td>자당 구배 및 용해 완충액</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>용해 완충액용 RNAse 억제제</td></tr>, <tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>용해 완충액</td></tr>, <tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제, EDTA 무료</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>튜브, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>그래디언트 초원심분리</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>그래디언트 초원심분리</td></tr><tr><td>Biologic LP (pump)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>그래디언트 분획</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>그래디언</td></tr>트 <tr><td>Eppendorf RNA/DNA LoBind 마이크로 원심분리 튜브, 2 mL 튜브</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>그래디언트 분획 및 RNA 추출</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>Luciferase Control RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>글리코겐, RNA 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마</td><td>I9516</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마</td><td>E7023-1L</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>역전사</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>Quantative PCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>총 RNA 분리를 위한</td> <td>Qiagen</td><td>217084</td> Kit</tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>miRNA 역전사를 위한</td> <td>Qiagen</td><td>218161</td> Kit</tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>miRNA의 real-time PCR 발현 분석을 위한</td> <td>Qiagen</td><td>218073</td> Kit</tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>다양한 온도에서 1.5 mL 또는 2.0 mL 튜브의 원심분리용. 최대 속도 - 21130 x g</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>다양한 온도에서 Real-Time PCR 플레이트 원심분리용. 최대 속도 - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>역전사용</td></tr><tr><td>CFX96 실시간 시스템/C1000 터치 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>실시간 PCR 분석용</td></tr><tr><td>miRNeasy 혈청/혈장 스파이크 인 제어</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>RNA 분리의 품질 관리용</td></tr><tr><td>하드-쉘 96-Well PCR 플레이트, 로우 프로파일, 얇은 벽, 스커트, 녹색/투명</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>실시간 PCR 분석용</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR 플레이트 밀봉 필름, 접착제, 광학</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>실시간 PCR 플레이트 밀봉</td></tr><tr><td>연구용 및 단일 채널 피펫, 회색;0.5-10 &마이크로; L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic 피</td>펫 피펫, P20 <td>Gilson</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic 피펫 피펫, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS 피펫 100-1000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td> 글리코겐 <td>피펫팅용</td></tr><tr><td>, RNA 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>총 RNA 분리 효율 향상</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL 튜브, 자연색</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>RNA 분리 및 보관; 시약 혼합</td></tr><tr><td>Thermal Cycling Tubes -0.2 mL 개별 캡, 광학</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>가 있는 표준 0.2 mL 튜브역전사 반응</td></tr><tr><td>Sharp 10 정밀 배리어 팁</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>피펫팅용</td></tr><tr><td>Sharp 20 정밀 배리어 팁</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>피펫용</td></tr><tr><td>Sharp 200 정밀 배리어 팁</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>피펫팅</td></tr><tr><td>팁 LTS 1 mL 필터</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>피펫팅용</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay ( 200)</td><td>Qiagen</td><td>(miRNA에 따라 변화)</td><td>실시간 PCR 분석용</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Model 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td> 자<td>당 구배</td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>제조용 Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td>, <td>피셔 사이언티픽</td>, <td>BP172</td><td></td></tr>, <tr><td>요오드아세트아미드</td>, <td>Gbiosciences,</td><td>RC-150</td><td></td></tr>, <tr><td>염기서열분석 등급, 변형 트립신, 돼지</td><td>프로메가</td><td>V5111,</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트, <td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>포름산, 옵티마 LC/MS</td><td>, 피셔 케미컬</td><td>A117</td><td></td></tr>, <tr><td>메탄올, 옵티마 LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 튜브 0.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB &micro; 용출판 30&마이크로; m</td><td>Oasis</td>, <td>186001828BA</td><td></td></tr>, <tr><td>SpeedVac 집중 장치</td><td>, Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td>, <td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr>, <tr><td>원심분리기</td><td>, Thermo Scientific</td><td>Sorvall, Legend micro, 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC, 트랩 컬럼, PepMap 100 C18</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC 분리 컬럼, PepMap, RSLC C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td>질량분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite 이온 트랩 질량분석기</td><td></td></tr><tr><td>MSConvert 소프트웨어</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST 소프트웨어</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

동적 proteomic 그리고 미르 langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 polysomes의 분석

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

단백질 번역에 동적 변화에 연구 전문된 방법 필요합니다. 여기 우리는 국 소 빈 혈과 reperfusion polysome 프로 파일링과 함께 끼얹는다 절연된 마우스 마음을 사용 하 여 응답에서 새로 합성 된 단백질에 변화를 검사 합니다. 단백질 번역의 동적 변화를 더 이해 하기 우리 mRNAs cytosolic 리보솜 (polyribosomes 또는 polysomes)와 함께 로드 된 또한 미토 콘 드리 아 polysomes 복구 하 고 비교에서 mRNA와 단백질 분포 특징에 높은-효율성 분수 (수많은 리보솜 mRNA에 부착), 낮은-효율성 (적은 리보솜 부착) 또한 미토 콘 드리 아 polysomes, 그리고 번역 비 분수를 포함 하는. miRNAs는 번역 되 고, 번역의 효율성을 줄일 mRNAs와 연결할 수도, 우리는 분수에 걸쳐 miRNAs의 분포를 조사. MRNAs, miRNAs, 및 단백질의 분포는 글로벌 아니 흐름 허 혈과 reperfusion의 30 분 후 30 분 후에 기저 끼얹는다 조건 하에서 시험 되었다. 여기에 우리가이 분석을 수행 하는 데 사용 하는 방법을 제시-특히,이 자당 기온 변화도에서 단백질 추출의 최적화에 대 한 접근은 하지 설명 하기 전에-몇 가지 대표적인 결과 제공.

mRNA 분석 mRNA 결과 각 분수 (그림 3A); 특정 mRNA의 배포로 표현 될 수 있습니다. 정량화, polyribosomal 번역 분수를 결합 하 고 nontranslating 분수 번역 mRNA 풍부의 비율을 제시 번역 비 분수 (그림 3B), 비교. 추가 정보는 별도로에서 낮은 효율 polysome 분수 (그리고 nontranslating 분수에서 별도) 고효율 polysome 분수를 검사 하 여 얻었다. (그들은 그들의 표적 mRNAs의 단백질 번역 방해 어디에) 낮은 효율 분수에 농축 miRNAs를 분석할 때 특히 중요 하다.
담당자 변경 마우스 마음 허 혈 및 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 대상이 됐다 후 번...

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

이 방법은 동적 단백질 합성 및 공정에 관련된 단백질체에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 번역을 위해 선택되는 mRNA, 과정에 참여하여 번역을 방해할 수 있는 microRNA, 단백질 번역에 기여하거나 자체적으로 번역되는 단백질을 식별할 수 있습니다. 이 방법은 스트레스에 대한 심장 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 장기의 스트레스에 대한 급성 반응 연구에도 적용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 Jennifer Van Eyk 실험실의 프로젝트 과학자인 Miroslava Stastna입니다. 실험 당일, 그래디언트 믹서의 왼쪽 구획에 5ml의 15% 자당 그래디언트 용액을 채우고 오른쪽 구획에 50%슈크로스 그래디언트 용액 5ml를 채웁니다. 탭을 열고 펌프를 켜서 자석 교반기로 두 개의 작은 구획을 저어주고 두 번째 탭에 연결된 튜브를 사용하여 혼합된 자당 용액이 얼음 위에 얇은 벽이 있는 단일 초원심분리기 튜브로 흐르도록 합니다.다음으로, 얼음 위에서 15초 동안 여과된 용해 완충액의 POLYTRON으로 신선하거나 냉동된 심장 조직을 균질화합니다. 배양이 끝나면 용해물을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 수확합니다. 단백질 측정, RNA 분리 및 RNA 무결성 분석을 위해 50마이크로리터의 상층액을 따로 보관하고 그래디언트 용액 위에 100-500마이크로리터의 나머지 상등액을 층을 이룹니다.새로운 용해 버퍼를 사용하여 두 gradient tube 사이의 부피 균형을 맞추고, 스윙 버킷 로터를 사용하여 초원심분리기에서 샘플을 초원심분리합니다. 원심분리 전이나 후에 자당 구배를 방해하지 않도록 매우 주의하십시오. 그래디언트를 수집하기 위해 분획 분취기가 처음 3분 동안의 분취를 버리고 254나노미터에서 흡광도를 지속적으로 모니터링하면서 4분에서 19분까지 17분획으로 분당 1밀리리터의 속도로 무겁고 가벼우며 변환되지 않는 분획을 수집하도록 프로그래밍합니다.각 조각을 모으는 즉시 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 샘플을 즉시 처리하지 않는 경우 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 폴리솜 분획에서 단백질을 추출하려면 수집된 자당 분획을 3개의 최종 분획으로 결합하고 분획을 무겁고 가벼우며 비평행 분석으로 표시합니다.각 시료 0.5ml를 100% 트리클로로아세트산 또는 TCA 60마이크로리터와 혼합합니다. 어둠 속에서 섭씨 영하 20도의 온도에서 밤새 분획을 배양합니다. 다음 날 아침, 원심분리로 단백질을 펠릿화하기 전에 얼음에서 샘플을 해동합니다.상층액을 버리고 펠릿을 0.5 밀리리터의 섭씨 영하 20도의 냉각 아세톤으로 원심분리하여 두 번 세척합니다. TCA 침전 후 펠릿이 완전히 용해되었는지 확인하고 필요에 따라 완전한 용해를 보장하기 위해 펄스 초음파 처리를 사용합니다. 360마이크로리터의 Tris-HCl 버퍼에서 재현탁하기 전에 마지막 세척 후 펠릿을 자연 건조합니다.그런 다음 40마이크로리터의 디티오트레이톨을 첨가하여 섭씨 55도에서 45분 동안 흔들면서 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플에 50마이크로리터의 요오드아세트아미드를 추가하여 빛으로부터 보호된 실온의 셰이커에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 진탕 배양을 위해 중량 대 중량 트립신 대 단백질 비율이 1:50인 샘플을 분해합니다. 다음날 아침, 냉각 후 샘플을 잠시 원심 분리하고 10% 포름산으로 pH를 2-3으로 조정하여 트립신 활성을 억제합니다.샘플을 탈염하려면 먼저 96웰 플레이트의 웰에서 200마이크로리터의 메탄올로 흡착제를 컨디셔닝한 다음 웰당 200마이크로리터의 0.1% 포름산으로 3회 컨디셔닝합니다. 다음으로, 샘플을 각 웰에 로드하고 세척당 200마이크로리터의 0.1% 포름산으로 샘플을 세 번 세척합니다. 중력을 사용한 후 저진공을 사용하여 50% 아세토니트릴에 0.1%포름산 100마이크로리터를 넣은 샘플을 샘플당 하나의 낮은 단백질 머무름 0.5ml 튜브로 두 번 용리합니다.그런 다음 농축기를 사용하여 샘플 용리액을 건조하게 증발시키고 질량 분석 분석을 위해 각 트립틱 펩타이드 펠렛을 50-100마이크로리터의 0.1% 포름산으로 재구성합니다.mRNA 분석을 수행하여 각 분획에서 관심 있는 특정 mRNA의 분포를 평가하거나 결합된 폴리리보솜 번역 분획을 각 분획의 mRNA 존재 비율로 비번역 분획과 정량화 및 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에서는 마우스 심장이 허혈 또는 허혈 재관류에 종속된 후 번역 및 비번역 분획에 걸친 mRNA 분포의 변화를 가짜 심장 치료와 비교하여 보여줍니다.이 대표적인 실험에서, 풀링된 무거운 분획에서 microRNA의 하위 집합을 분석한 결과, 22개의 microRNA가 허혈 중에 폴리솜과 연관되어 있었고, 9개는 허혈 및 재관류 중에 연관되어 있었으며, 7개는 두 조건 모두에 공통적으로 연관되어 있음을 보여주었으며, 이는 microRNA의 연관성이 허혈 및 재관류의 스트레스에 반응하여 동적임을 보여주었습니다. 또한, 미토콘드리아 리보솜 단백질의 대다수는 가벼운 분획에서 확인되었고, 세포질 리보솜 단백질의 대다수는 무거운 분획과 가벼운 분획 모두에서 공통적으로 확인되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 자당 그래디언트에 매우 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.폴리솜 분획에서 단백질을 추출하기 위한 TCA 침전은 고농도의 자당으로 분획을 처리할 수 있는 능력과 질량 분석법으로 식별된 단백질의 수를 기반으로 워크플로우에서 선택되었습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 자당 구배의 재현성과 관련된 문제로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. TCA 침전은 단백질을 침전시키는 데 적은 부피만 필요하고, 펠릿이 튜브 바닥에서 눈에 띄며, 침전 중에 자당이 축적되지 않기 때문에 유리합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

함께 Langendorff 모드 절연 심장...

를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 31 P NMR 분광학

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

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질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.

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어린 배아 마우스 판막의 단백질 발현 분석은 이용 가능한 조직의 한계로 인해 방해를 받았습니다. 이 원고는 웨스턴 블롯 분석을 위해 발달 중인 배아 마우스 판막 영역에서 단백질을 준비하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

여기에서 우리는 심근 경색 후(MI) 마우스 심장에서 높은 생존력을 가진 충분한 양의 단일 비심근 세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이는 후속 단일 세포 시퀀싱, 유세포 분석 및 일차 세포 배양에 사용할 수 있습니다.

심근경색 후 성인 마우스 심장에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 비심근세포 세포 현탁액의 제조

배우세요 절연된 마우스 심장에서 폴리솜 프로파일링을 통한 동적 단백질 합성 분석 방법입니다. 이 기술은 심장 스트레스 반응에서 번역되는 mRNA와 miRNA를 식별하여 심장 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

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