동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

이 방법은 동적 단백질 합성 및 공정에 관련된 단백질체에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 번역을 위해 선택되는 mRNA, 과정에 참여하여 번역을 방해할 수 있는 microRNA, 단백질 번역에 기여하거나 자체적으로 번역되는 단백질을 식별할 수 있습니다. 이 방법은 스트레스에 대한 심장 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 장기의 스트레스에 대한 급성 반응 연구에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Jennifer Van Eyk 실험실의 프로젝트 과학자인 Miroslava Stastna입니다. 실험 당일, 그래디언트 믹서의 왼쪽 구획에 5ml의 15% 자당 그래디언트 용액을 채우고 오른쪽 구획에 50%슈크로스 그래디언트 용액 5ml를 채웁니다. 탭을 열고 펌프를 켜서 자석 교반기로 두 개의 작은 구획을 저어주고 두 번째 탭에 연결된 튜브를 사용하여 혼합된 자당 용액이 얼음 위에 얇은 벽이 있는 단일 초원심분리기 튜브로 흐르도록 합니다.

다음으로, 얼음 위에서 15초 동안 여과된 용해 완충액의 POLYTRON으로 신선하거나 냉동된 심장 조직을 균질화합니다. 배양이 끝나면 용해물을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 수확합니다. 단백질 측정, RNA 분리 및 RNA 무결성 분석을 위해 50마이크로리터의 상층액을 따로 보관하고 그래디언트 용액 위에 100-500마이크로리터의 나머지 상등액을 층을 이룹니다.

새로운 용해 버퍼를 사용하여 두 gradient tube 사이의 부피 균형을 맞추고, 스윙 버킷 로터를 사용하여 초원심분리기에서 샘플을 초원심분리합니다. 원심분리 전이나 후에 자당 구배를 방해하지 않도록 매우 주의하십시오. 그래디언트를 수집하기 위해 분획 분취기가 처음 3분 동안의 분취를 버리고 254나노미터에서 흡광도를 지속적으로 모니터링하면서 4분에서 19분까지 17분획으로 분당 1밀리리터의 속도로 무겁고 가벼우며 변환되지 않는 분획을 수집하도록 프로그래밍합니다.

각 조각을 모으는 즉시 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 샘플을 즉시 처리하지 않는 경우 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 폴리솜 분획에서 단백질을 추출하려면 수집된 자당 분획을 3개의 최종 분획으로 결합하고 분획을 무겁고 가벼우며 비평행 분석으로 표시합니다.

각 시료 0.5ml를 100% 트리클로로아세트산 또는 TCA 60마이크로리터와 혼합합니다. 어둠 속에서 섭씨 영하 20도의 온도에서 밤새 분획을 배양합니다. 다음 날 아침, 원심분리로 단백질을 펠릿화하기 전에 얼음에서 샘플을 해동합니다.

상층액을 버리고 펠릿을 0.5 밀리리터의 섭씨 영하 20도의 냉각 아세톤으로 원심분리하여 두 번 세척합니다. TCA 침전 후 펠릿이 완전히 용해되었는지 확인하고 필요에 따라 완전한 용해를 보장하기 위해 펄스 초음파 처리를 사용합니다. 360마이크로리터의 Tris-HCl 버퍼에서 재현탁하기 전에 마지막 세척 후 펠릿을 자연 건조합니다.

그런 다음 40마이크로리터의 디티오트레이톨을 첨가하여 섭씨 55도에서 45분 동안 흔들면서 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플에 50마이크로리터의 요오드아세트아미드를 추가하여 빛으로부터 보호된 실온의 셰이커에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 진탕 배양을 위해 중량 대 중량 트립신 대 단백질 비율이 1:50인 샘플을 분해합니다. 다음날 아침, 냉각 후 샘플을 잠시 원심 분리하고 10% 포름산으로 pH를 2-3으로 조정하여 트립신 활성을 억제합니다.

샘플을 탈염하려면 먼저 96웰 플레이트의 웰에서 200마이크로리터의 메탄올로 흡착제를 컨디셔닝한 다음 웰당 200마이크로리터의 0.1% 포름산으로 3회 컨디셔닝합니다. 다음으로, 샘플을 각 웰에 로드하고 세척당 200마이크로리터의 0.1% 포름산으로 샘플을 세 번 세척합니다. 중력을 사용한 후 저진공을 사용하여 50% 아세토니트릴에 0.1%포름산 100마이크로리터를 넣은 샘플을 샘플당 하나의 낮은 단백질 머무름 0.5ml 튜브로 두 번 용리합니다.

그런 다음 농축기를 사용하여 샘플 용리액을 건조하게 증발시키고 질량 분석 분석을 위해 각 트립틱 펩타이드 펠렛을 50-100마이크로리터의 0.1% 포름산으로 재구성합니다.mRNA 분석을 수행하여 각 분획에서 관심 있는 특정 mRNA의 분포를 평가하거나 결합된 폴리리보솜 번역 분획을 각 분획의 mRNA 존재 비율로 비번역 분획과 정량화 및 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에서는 마우스 심장이 허혈 또는 허혈 재관류에 종속된 후 번역 및 비번역 분획에 걸친 mRNA 분포의 변화를 가짜 심장 치료와 비교하여 보여줍니다.

이 대표적인 실험에서, 풀링된 무거운 분획에서 microRNA의 하위 집합을 분석한 결과, 22개의 microRNA가 허혈 중에 폴리솜과 연관되어 있었고, 9개는 허혈 및 재관류 중에 연관되어 있었으며, 7개는 두 조건 모두에 공통적으로 연관되어 있음을 보여주었으며, 이는 microRNA의 연관성이 허혈 및 재관류의 스트레스에 반응하여 동적임을 보여주었습니다. 또한, 미토콘드리아 리보솜 단백질의 대다수는 가벼운 분획에서 확인되었고, 세포질 리보솜 단백질의 대다수는 무거운 분획과 가벼운 분획 모두에서 공통적으로 확인되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 자당 그래디언트에 매우 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

폴리솜 분획에서 단백질을 추출하기 위한 TCA 침전은 고농도의 자당으로 분획을 처리할 수 있는 능력과 질량 분석법으로 식별된 단백질의 수를 기반으로 워크플로우에서 선택되었습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 자당 구배의 재현성과 관련된 문제로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. TCA 침전은 단백질을 침전시키는 데 적은 부피만 필요하고, 펠릿이 튜브 바닥에서 눈에 띄며, 침전 중에 자당이 축적되지 않기 때문에 유리합니다.