Name: Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 배우세요 생쥐 골수 유래 수지상 세포와 대식세포에서 형광 융합 단백질을 발현하는 방법을. 레트로바이러스를 이용한 유전자 전달과 세포 분화 과정을 통해 단백질 역학을 연구할 수 있습니다.

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이 작품으로 체코 과학 재단 (GACR) (프로젝트 번호 16-07425S)에 의해 찰스 대학 부여 기관 (GAUK) (프로젝트 번호 923116) 및 기관 자금에서 연구소의 분자 유전학, 체코의 과학 아카데미에 의해 지원 되었다 공화국 (RVO 68378050)입니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 복지의 실험 동물에 분자 유전학 연구소의 전문가 위원회에 의해 및 체코 공화국의 과학 아카데미에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 시 약 준비
<ol><li>염화 염화 칼륨 (ACK) 버퍼를 준비 합니다. DdH2O의 500 mL를 NH4Cl의 4.145 g 및 0.5 g KHCO3 를 추가 다음 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 100 µ L을 추가 하 고 필터를 소독.</li>
	<li>Polyethylenimine (페이) 솔루션을 준비 합니다. DdH2오의 90 mL에 PEI의 0.1 g을 추가 교 반, 하는 동안 추가 1 M HCl dropwise pH 2.0 보다 낮은 될 때까지. 페이 해산 될 때까지 최대 3 h에 대 한 약동 하 고 1 M NaOH와 7.2에 pH를 조정 합니다. DdH2O 100 mL을 볼륨을 조정 하 고 필터를 소독. 1-2 mL aliquots를 확인 하 고-20 ° c.에 저장 참고: 녹고, 후 페이 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장 될 수 있지만 다시 동결 하지 해야 합니다.</li>
	<li>M-CSF 또는 GM-CSF를 포함 하는 셀 문화 supernatants 준비. 이러한 supernatants 사전 고-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. 이러한 supernatants 있도록 합류 cytokine 생산 세포 (GM-CSF 18 J558 세포) 또는 M-CSF 19CMG 14-12 셀 10 cm에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 페 트리 접시에 성장. 다음 모든 셀을 5% CO2에 추가 4 일 T150 조직 배양 플라스 크에 문화 미디어의 200 mL을 전송 37 ° c. 0.2 µ m 살 균 필터에 상쾌한 및 필터를 수집 합니다. Aliquots를 확인 하 고 이러한-80 ° c.에 저장</li>
	<li>세포 배양의 100 mL를 준비: 10% 보충 DMEM 사 FBS 위와 문화 supernatants GM-CSF (BMDC 차별화)에 대 한 또는 (BMDM 차별화)에 대 한 M-CSF를 분 비 하는 세포에서 세포. 참고: 이러한 supernatants에서 cytokines의 양이 다를 수 있습니다 고 작업 농도 경험적으로 확인할 수 있다. 일반적으로 2-3% 상쾌한 GM-CSF (권장된 시작 농도 2%) 또는 5-10% 상쾌한 CMG에서 M-CSF (권장된 시작 농도 10%)을 생산 하는 14-12 셀을 생산 하는 셀 라인에서 사용 됩니다. 또는, 상업적으로 정화 10 ng/mL에서 사용할 수 있는 M-CSF와 GM-CSF 20 ng/mL에서 사용할 수 있습니다 포함 하는 cytokine supernatants, 즉거의 동일한 결과 함께., 차별화, 감염 효율의 속도에 아무런 영향 없이 그리고 EGFP 태그 구문의 subcellular 지 방화입니다. 항생제, 페니실린을 포함 한 G (100 IU/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 gentamicin (40 µ g/mL), 사용할 수 있습니다 세포 배양 프로토콜의 어떤 단계에서 달리 명시 하지 않는 한.</li>
</ol>2입니다. 레트로 바이러스의 생산
주의: retroviral 벡터는 바이러스 성 벡터의 다른 유형에 비교 될 때 상대적으로 안전 하 게, 하지만 그들은 여전히 포즈 잠재적인 안전 위험. 따라서, 그것은 최상의 진료와 적절 한 보호 장비, 작동 하 고 모든 안전 규정 및 바이러스 성 입자와 작업에 대 한 법적 요구 사항을 준수 하기 위해 중요 합니다.
<ol><li>플레이트 10 cm 배양 접시에에서 백 금-에코 (같은-E) 포장 셀의 단일 세포 현 탁 액 및 10% 포함 된 DMEM의 15 mL에 육성 FBS 합칠 50-60% (24 시간)까지. 세포는 단층에서 성장 해야 하 고 문화에서 덩어리를 형성 한다.</li>
	<li>Retroviral 구문의 피펫은 20 µ g (예., 붙일 태그가 단백질 pMSCV 벡터에 대 한 관심의 표현 구문)과20 (혈 청 없이 항생제) DMEM의 1 mL에 벡터와 부드럽게 믹스는 pCL 에코 포장의 10 µ g.</li>
	<li>두 번째 튜브, PEI의 75 µ L (혈 청 없이 항생제) DMEM 1 mL에 추가 합니다. 실 온 (RT)에서 5 분을 품 어 하 고 믹스 두 튜브의 내용을 함께 실시간에 추가 10 분 동안 품 어 참고: pCL 에코의 추가 선택 사항입니다. 그것은 ecotropic 바이러스 성 수용 체에 대 한 코딩 하 고 바이러스 titer를 증가 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>신중 하 게 2% 신선한 DMEMsupplemented 8 mL 같은 E 셀에 매체를 바꿉니다 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체. 항생제 transfection 효율을 줄일 수 있기 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>신중 하 게 단계 2.3 같은 E 셀에 준비 하는 혼합물 (정)에 추가 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어</li>
	<li>부 화 후 10%를 포함 하는 미리 데워 DMEM의 10 ml 같은 E 셀에 매체 교환 FBS, 37 ° c.에 24 h에 대 한 셀을 육성 이 부 화 하는 동안 같은 E 셀 미디어에 바이러스를 생산할 예정 이다.</li>
	<li>24 시간 후 5 mL 피 펫을 사용 하 여 백 금 에코 셀에서 retroviral 입자를 포함 하는 매체를 수집 하 고 전송 (ecotropic retroviral 입자를 포함 하는 "표면에 뜨는 1" =) 15ml 원심 관 하.</li>
	<li>같은 E 셀 바이러스 supernatants에 의해 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 5 분 1250 × g에서 수집 된 바이러스 최상의 결과 얻으려면, 바이러스 감염에 대 한 즉시 사용 되어야 한다. 참고: 바이러스의 Aliquots 또한 나중에 사용에 대 한-80 ℃에 저장할 수 있습니다. 그러나, 그것은 변환 효율 특정 감소에 발생 합니다. 반복적인 동결/녹고는 바이러스의 때문에 그것은 바이러스 저하로 연결 하지 마십시오.</li>
	<li>10 %FBS 같은 e 세포 고 37 ° c.에 다른 24 h에 대 한 육성으로 미리 데워 DMEM의 10 mL을 추가</li>
	<li>2.7 단계를 반복 합니다. 그리고 2.8입니다. "표면에 뜨는 2" 취득을</li>
</ol>3. murine 골 수 세포 격리
<ol><li>자 궁 경부 전위 또는 다른 승인 된 메서드를 사용 하 여 마우스를 희생. 70% 에탄올과 마우스 스프레이입니다.</li>
	<li>핀셋과가 위를 사용 하면, 피부 뿐만 아니라 근육의 부분 뒷 다리에서 제거할. 신중 하 게 대 퇴 골을 깨지 않고는 고관절에서 있습니다를 분리 하십시오. 발목 관절에서 발을 잘라. 70% 에탄올과 뼈 (대 퇴 골 경골에 연결)를 스프레이 종이 타월을 사용 하 여 근육의 나머지 부분을 제거.</li>
	<li>버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) 2%를 포함 하는 5 cm 페 트리 접시에는 뼈를 배치 FBS (PBS-FBS).  더 많은 뼈를 준비 하는 경우 처리 될 때까지 얼음에 페 트리 접시를 유지.</li>
	<li>무 균 재배 확보를 위한 조직 문화 후드에 모든 다음 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>뼈 끝 (공동과 위로 조심 스럽게 잘라 무릎에 벤드)을 깨지 않고 경골에서 대 퇴 골을 구분 합니다.</li>
	<li>뼈 하나 하나를 처리 합니다. 가 위 핀셋에 뼈를 잡고 epiphyses (약 1-2 m m)의 매우 작은 부분을 잘라.</li>
	<li>30g 바늘을 사용 하 여 2 또는 5 mL 주사기 15ml 원심 관으로 뼈의 양쪽 끝에서 골 수 세포를 PBS FBS 가득. 모든 셀을 제거 하기 위하여 홍 조 동안 뼈 안에 바늘을 이동 합니다. 바늘 막힌 되 면, 그것은 변경 합니다. 참고: 뼈 해야 차례 빨강에서 백색 내리는 동안. 이 대부분의 세포는 뼈에서 제거 되었습니다 나타냅니다. 약 2-3 mL PBS FBS의 뼈 당을 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 실 온에서 2-3 분에 대 한 ACK 버퍼의 2.5 mL에 펠 릿을 resuspending 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse. 세포, 동안 신선한 15 mL centrifug 튜브로 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 골 수 세포를 필터링. 12 mL PBS FBS의 추가 샘을 복원 합니다. 참고: 침투성 세포 세포 죽음을 피하기 위해 ACK 버퍼의 5 분을 초과 하지 마십시오.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 즉시 원심</li>
</ol>4. 골 수 세포 분화 골으로 파생 된 대 식 세포
<ol><li>DMEM 10 %FBS 항생제 보충에 골 수 세포의 펠 릿 resuspend (1.4 단계 후 메모를 참조 하십시오. 항생제 농도) 셀을 카운트. BM으로 분화 세포 파생, 대 접시 5-10 x 106 골 셀에 10 cm 비-조직 문화 단계 1.4에서의 혈 청 및 M-CSF 미리 준비 된 DMEM 미디어 10 mL와 함께 (세균성) 페 트리 접시를 취급. 참고: 골 수 세포의 수율은 약 4 x 107 / 6-8 주-오래 된 C57BL/6J 마우스.</li>
	<li>셀 셀 문화 인큐베이터에 5% CO2, 37 ° c.에 3 일 동안 품 어 참고: 처음 2 일 동안 셀 매우 중요 한, 보이지 않는 apoptotic 세포의 많은 수는 현재 (세포 골수성 세포와 말기 차별화 된 세포로 분화 수 없습니다).</li>
	<li>3 일 후, 골 수 세포 배양 중요 한 보고를 시작 하 고 셀 분할의 클러스터 형성 된다. 최초의 부착 세포 이미 관찰할 수 있습니다. 이 시점에서, 신선한 cytokine 미디어 셀 보충.</li>
	<li>각 10 cm 배양 접시에 혈 청 및 M-CSF (단계 1.4)에서 미리 데워 DMEM 미디어의 10 mL를 추가 하 고 셀 문화 인큐베이터에 반환. 이 단계 동안 오래 된 미디어를 제거할 필요가 있다. 참고: 골 수 세포는 문화에서 5-7 일 후 완전히 분화 된다. 하루 6-8, 점착 및 페 트리 접시에 있는 세포의 대부분은 완전히 덮여 수확에 대 한 가장 좋은 시기가입니다.</li>
	<li>5 일에 셀 문화 후드로 페 트리 접시를가지고 고 미디어는 거의 접시의 가장자리에 도달 될 때까지 접시를 경사. 신중 하 게, 가장자리 근처 표면에서 미디어의 15 mL를 꺼내와 셀 접시의 한가운데에 체류 하는 경향이. 미리 데워 진된 미디어 M-CSF의 동일한 볼륨을 추가 하 고 다시 인큐베이터에 접시를 놓고. 참고: 미디어는 천천히, 그리고 신중 하 게 발음 하 고, 거의 셀 손실 됩니다. 그러나, 그것은 또한 aspirated 미디어 원심 하 여 다시 없는 비 부착 되도록 문화에 셀을 추가 (즉., 불완전 하 게 분화) 셀 손실 됩니다.</li>
	<li>실험, 부착 셀 (세포)만 사용 된다. 하루 6 또는 7에 셀, 수확, 모든 미디어와 부동 셀을 제거 합니다. 한번 혈 청 하지 않고 미리 데워 공영으로 접시를 씻어.</li>
	<li>PBS에 0.02 %EDTA 5 mL을 추가 하 고 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 3-5 분 동안 품 어.</li>
	<li>5 mL 피 펫을 사용 하 여 요리 하 여 한 스트림을의 PBS-EDTA에서에서 셀을 제거 하 고 PBS의 25 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 넣어. 필요한 경우 더 많은 요리를 함께 풀.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 즉시 원심</li>
	<li>DMEM 미디어에서 대 식 세포 pellet을 resuspend 및 셀. Cytometry 여 대 식 세포 표면 차별화 마커 (CD11b 및 f 4/80)의 식을 확인 합니다.</li>
	<li>세포에, 예수 필요로 하는 실험에 대 한., cytometry 실험, 정량 또는 서쪽 오 점 분석 흐름, 대 식 세포를 사용 하 여 직접. 부착 세포와 실험, 실험 설정에 따라 조직 문화 접시에 셀 접시.</li>
	<li>세포는 이미 완전히 분화 된다. 원하는 실험에 적합 한 미디어 또는 M-CSF와 원래 성장과 분화 미디어에서 그들을 유지. 참고: 부착 세포, 작업에 새 전송에 대 한 새로운 표면에 완전 접착 수 있도록 (이상적으로 하룻밤) 사용 하기 전에 적어도 6 h 플레이트. 세포의 작은 분수 실험 하기 전에 제거할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 골 수 세포 분화 골에 유래 수지상 세포
<ol><li>조정 단계 5.2-5.4에에서 아래 설명 된 BMDCs에 대 한 특정 BMDMs에 대 한 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>10 %FBS 항생제 DMEMsupplemented에서 골 수 세포의 획득된 펠 릿 resuspend 및 세포 (대 식 세포 프로토콜의 다음 단계 4.1)에 의해. 수지상 세포로 분화, 플레이트 1-1.5 x 107 골 수 세포에 있는 10 cm 비-조직 문화 (단계 1.4.)에서 혈 청 및 GM-CSF 미리 준비 된 DMEM 미디어 10 ml에서 (세균성) 페 트리 접시 처리.</li>
	<li>BMDM 프로토콜에서 동일한 재배 단계 (4.3-4.5 단계. 대 식 세포 프로토콜의). DMEM 미디어를 사용 하 여 혈 청 및 M-CSF 대신 GM-CSF. 때문에 BMDCs에 대 한 재배 시간이 깁니다 (일반적으로 10-12 일), 추가 1-2 추가 수 유 3 일 간격으로 (제거는 상쾌한 고 4.5 단계에에서 설명 된 대로 새로운 재배 미디어 추가.).</li>
	<li>이 프로토콜의 부분은 거의 같은 대 식 세포 프로토콜의 해당 부분 (4.6-4.12 단계. 대 식 세포 프로토콜의). 실험에 대 한 부착 셀만 사용 합니다. 하루 10-12, 수집, EDTA를 사용 하 여 셀에 계산 하 고 새로운 표면에 접시. 수지상 세포의 표면 차별화 마커의 식 확인 (CD11c +, CD11b + F4/80-) cytometry에 의해.</li>
</ol>6. BMDMs와 관심의 EGFP 태그 단백질을 표현 하는 BMDCs의 생산
<ol><li>3.10 단계에서에서 얻은 골 수 세포의 펠 릿 resuspend DMEM에서 10 %FBS 항생제 보충과 셀. 감염에 대 한 사용 2-5 x 106 6 잘 조직 배양의 당 BM 셀의 플레이트 취급.</li>
	<li>1 ml 당 준비 된 DMEM 미디어의 셀 음, M-CSF BMDMs에 차별화 또는 GM-CSF BMDCs. 차별화에 대 한 보충 판 37 ° c.에 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 4-6 h에 대 한 셀을 유지</li>
	<li>Polybrene (12 µ g/mL, 셀에 추가 후 최종 농도 8 µ g/mL)와 보충 갓 수집 된 바이러스 ("표면에 뜨는 1")의 2 개 mL를 추가 합니다. 참고: 바이러스 포함 된 상쾌한의 얼어붙은 약 수 사용할 수 있습니다 또한, 하지만 효능은 낮은 것 이다.</li>
	<li>90 분 (느린 가속도와 감속) 30 ° C에서 1250 x g에서 격판덮개 원심 그런 다음, 5% CO2 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어</li>
	<li>옵션: 대체 문화 미디어의 2 mL 신선한 매체 포함 각각 cytokine (M-CSF 또는 GM-CSF)와 37 ° c.에 5% CO2 와 문화 두 번째 날, 문화 미디어의 2 개 mL를 제거 하 고 갓 수집 된 바이러스 ("표면에 뜨는 2")의 2 개 mL로 전체 감염 절차 (6.3-6.4 단계)를 반복 합니다. 참고:이 단계는 감염 효능을 증가할 수 있습니다. 개선 후 두 번째 감염 세포 유형 및 대상 단백질에 및 우리의 경험에 따라 변화할 수 있다 30% 증가에서 효율에서 개선 전혀.</li>
	<li>수집 비 부착 한 세포 15ml 원심 관에 전송 하 고 5 분 (4 ° C) 500 x g에서 회전. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>M-CSF 또는 GM-CSF 문화 미디어 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend, 셀 10cm 조직 문화 치료 페 트리 접시에 놓고 37 ℃, 5% CO2에서 문화. 10 cm의 요리에 대 한 셀의 최적 수는 5-10 x 106 BM 파생 된 세포 및 10-15 x 106 BM 파생 수지상 세포. 참고: 작은 접시 또는 접시 사용할 수 있습니다, 하지만 셀 번호를 적절 하 게 조정 해야 합니다.</li>
	<li>따라는 대 식 세포와 수지상 세포 및 분화 프로토콜 4 및 5 단계에서 설명한.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

대상 셀에 관심사의 단백질의 표정은 다양 한 생물 학적 연구에에서 중요 한 단계. 차별화 된 대 식 세포와 수지상 세포는 표준 transfection retroviral 변환 기법에 의해 transfect 어렵다. 이러한 소성 cDNAs의 식을 수 있도록 중요 한 단계는 골 수 창시자, 그들은 이미 원하는 구문을 수행할 때 차별화 뒤 retroviral 변환으로 이러한 차별화 된 세포의 transfection를 무시 셀 유형입니다. 이 방법의 성공적인 사용의 예는 우리의 최근 게시25에서 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 안정적인 표현의 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포는이 접근을 사용 하 여 선택의 구조를 달성 하기 위한 비용 효율적인 프로토콜을 제공 합니다. 우리가 제시 하는 절차는 상대적으로 저렴 하 고 간단 하 고, 아직 매우 좋은 결과 제공. 시 약이이 프로토콜에 사용 되는 상대적으로 제한적인 예산 에서도 일상적인 사용에 대 한 수 있습니다. 같은 E transfectio...

골수성 세포는 병원 체에 대 한 우리의 방어 메커니즘의 필수적인 부분을 나타냅니다. 그들은 죽어가는 세포 뿐 아니라 미생물, 빠르게 제거 수 있습니다. 또한, 그들은 또한 관련 규제 조직 개발 및 수리 및 항상성1,2,3를 유지. 모든 골수성 세포는 골 수에서 일반적인 골수성 창시자에서 차별화. 많은 기능 및 형태학 상으로 가지 하위 집합으로 그들의 차별화는 cytokines와 그들의 다양 한 조합4제어 대부분입니다. 가장 집중적으로 공부 골수성 세포 하위 집합 neutrophilic granulocytes, 대 식 세포와 수지상 세포를 포함합니다. 이러한 인구 중 결함 잠재적으로 생명을 위협 문제 원인의 인간과 쥐,12,3,5, 의 면역 체계의 심각한 장애를 일으킬 6.
Neutrophilic granulocytes, 달리 수지상 세포와 대 식 세포는 조직 거주 세포 그리고 면역 기관에 그들의 풍부는 상대적으로 낮은. 그 결과, 분리와 기본 수지상 세포와이 세포의 많은 수를 요구 하는 실험에 대 한 세포의 정화 이며 비싼 종종 불가능. 이 문제를 해결 하려면 프로토콜 동종 대 식 세포 나 수지상 세포 생체 외의 다량을 얻기 위해 개발 되었습니다. Cytokines의 존재 murine 골 수 세포의 분화를 기반으로하는 이러한 접근: 대 식 세포 그리고 granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 또는 Flt3 리간드에 대 한 대 식 세포 콜로 니 자극 요소 (M-CSF) 수지상 세포7,8,9,10,,1112. 이 메서드에 의해 생성 된 셀 일반적으로 문학에서 골 수 유래 세포 (BMDMs) 및 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs)으로 설명 합니다. 그들은 주 대 식 세포 또는 해당 셀 라인 보다 수지상 세포와 더 많은 생리 적 속성을 있다. 또 다른 주요 장점은 유전자 이러한 세포 형태를 얻기의 가능성 수정 마우스13입니다. 야생-타입 셀 간의 비교 연구 하 고 유전자 변형된 생쥐에서 파생 된 세포는 유전자의 잠복 소설 기능 또는 관심사의 단백질에 대 한 중요 한.
살아있는 세포에 있는 단백질의 subcellular 지 방화의 분석 vivo에서관심사의 단백질에 형광 라벨의 결합을 필요합니다. 이것은 가장 일반적으로 유전자 인코딩된 퓨전 구문 형광 단백질을 (종종 짧은 링커)을 통해 결합 하는 분석 된 단백질의 구성으로 표현 하 여 달성 (예., 녹색 형광 단백질 (GFP))14,15 , 16. 수지상 세포 나 대 식 세포에 붙일 태그가 단백질의 식을 도전 이다. 이 세포는 일반적으로 표준 transfection 절차에 의해 transfect 어렵다 고 효율성 매우 낮은 경향이. 또한,는 transfection는 일시적, 그것은 세포 스트레스를 생성 하 고 달성된 강도의 형광 현미경 검사 법17에 대 한 충분 한 되지 않을 수도 있습니다. Transgene 식 retroviral 골 조상 세포의 감염의 충분 한 수준으로 이러한 셀의 합리적인 부분을 얻기 위해 벡터와 BMDMs 또는 BMDCs에 그들의 후속 차별화 되고있다 매우 효율적 접근입니다. 그것은 그들의 원래 세포 환경 안정 된 상태에서 또는 먹어서, 면역학 시 냅 스 형성 또는 마이그레이션 같은 면역 반응에 대 한 중요 한 프로세스 동안 골수성 근원의 단백질의 분석에 대 한 허용 했다. 여기, 우리 파생 murine 골 수 세포와 수지상 세포에 붙일 태그가 단백질의 안정적인 식 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,</td><td>USA 10270</td><td>미디어 확산용</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Lachema, Brno, Czech Republic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>BB Pharma AS, 프라하, 체코 공화국</td><td>N/A</td><td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&Aacute; SOL' BIOTIKA</td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치 (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S9137</td><td>스트렙토마이신 설페이트 염 분말</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&aacute; lov&eacute;, Czech Republic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td><td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>IMG ASCR, Prague, Czech</td> <td>Republic의 미디어 시설에서 자체 준비N/A</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse/human CD11b 항체, clone M1/70</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101212</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>PE anti-mouse F4/80 항체, clone BM8</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>123110</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD11c 항체, 클론 N418</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>117310</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>H1398</td><td>유세포 분석 사용 1-2 &micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

수지상 세포와 대 식 세포는 병원 체에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 형성 하는 중요 한 세포 이다. 그들은 또한 적합 한 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생합니다. 이러한 세포와 실험 작업은 오히려 도전적 이다. 그들의 풍부한 장기와 조직에 상대적으로 낮습니다. 결과적으로, 그들은 큰 숫자에서 고립 될 수 없습니다. 그들은 또한 transfect cDNA 구문으로 어렵다입니다. Murine 모델에서 이러한 문제는 골 수 세포에 대 한 M-CSF 또는 수지상 세포에 대 한 GM-CSF의 창시자에서 생체 외에서 분화에 의해 부분적으로 극복할 수 있습니다. 이 방법에서는, 아주 몇몇 동물에서 이러한 셀의 대용량을 얻을 수입니다. 또한, 골 창시자 retroviral 벡터 들고 이전에 파생 하는 골 수 수지상 세포와 대 식 세포로의 분화 재배의 초기 단계 동안에 cDNA 구문으로 불리고 있습니다. 따라서, 이러한 셀에 다양 한 cDNA 구문 표현 하 retroviral 변환 뒤에 체 외에서 분화를 사용할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 형광 단백질, 탠덤 담긴 위하여 분석, 구조-기능 분석, 대 한의 포함 하 여 이러한 셀에 수행할 수 있는 실험의 범위를 확장 하는 실질적으로 소성 단백질을 표현 하는 능력 모니터링 바이오 센서와 다른 많은 세포질 기능. 이 문서에서는, 우리 붙일 태그가 단백질 코딩 벡터와 retroviral 변환 파생 murine 골 수 수지상 세포와 대 식 세포에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 두 어댑터 단백질, OPAL1 및 PSTPIP2, 예를에 우리 cytometry에 현미경의 실용적인 응용 프로그램을 보여 줍니다. 우리는 또한 장점 및이 방법의 한계를 설명.

신호 어댑터 단백질은 어떤 효소 활동 없이 일반적으로 작은 단백질. 그들은 다양 한 상호 도메인을 소유 또는21tyrosine kinases, 가수분해, 유비퀴틴 ligases 등 신호 변환에 관련 된 주제, 다른 단백질 바인딩 중재. 이 프로토콜의 기능의 데모에 대 한 PSTPIP2 및 OPAL1 골수성 세포 어댑터 선정 됐다. PSTPIP2 잘 특징이 단백질 염증 반응을22의 규칙에 관련 된 이다. 그것은 또한 F 바 도메인을 통해 세포 막 채용 될 수 있는 세포질 단백질입니다. 두 번째 단백질은 막 횡단 어댑터 OPAL1, 세포 멤브레인과 연결 될 것으로 예상 된다. 그것의 생리 기능은 아직 알려져 있지 않습니다. 그러나, 급성 림프 구성 백혈병에서 OPAL1 표현의 더 나은 예 지23와 연결 됩니다.
<p class="jove_c...

이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

이 방법은 이러한 세포 유형에 있는 각종 단백질의 세포 소소화 및 역학에 관하여 대식세포 및 수지상 세포 생물학의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 저렴하며 사용 가능한 대부분의 다른 방법보다 표현의 효율성과 안정성을 입증한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생 인 Jarmila Kralova가 될 것입니다.레트로바이러스를 생산하기 위해, 10센티미터 페트리 접시에 플래티넘 에코 패키징 세포의 단일 세포 현탁액을 플레이트와 DMEM의 15 밀리리터에서 세포를 육성하고, 배양이 50 내지 60%의 컨실루물이 될 때까지 10%의 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충한다. 다음 날, 관심의 레트로 바이러스 구조의 20 마이크로 그램과 부드러운 혼합과 함께 세럼없이 DMEM의 1 밀리리터에 PCL 에코 패키징 벡터의 10 마이크로 그램을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 두 번째 튜브에 세럼과 항생제없이 DMEM의 1 밀리리터에 75 마이크로리터의 PEI를 추가하고 실온에서 추가로 10 분 배양을 위해 두 튜브의 내용을 혼합합니다.다음으로, 플래티넘 에코 셀의 배지를 2%의 FBS로 보충한 신선한 섭씨 37도의 8밀리리터로 조심스럽게 교체하고, 플레이트에 낙하하여 경질 혼합물을 조심스럽게 첨가한다. 섭씨 37도에서 4시간 배양 후, 수퍼네티드를 섭씨 37도의 10밀리리터로 대체하고, 섭씨 37도에서 24시간 배양시 10%의 FBS를 보충합니다. 다음 날, 5 밀리리터 파이펫을 사용하여 에코트로픽 레트로바이러스 입자 함유 슈퍼나텐트를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의한 이물질을 제거하고 세포를 포함한다.한편, 섭씨 37도의 밀리리터 10밀리리터와 10%의 FBS를 문화 요리에 추가하여 섭씨 37도에서 24시간 배양을 더하고, 방금 입증된 바와 같이 두 번째 바이러스 성 입자를 수집합니다. 골수를 수확하려면 조직 배양 후드에서 핀셋과 가위를 사용하여 뒷다리에서 근육의 피부와 부분을 제거하고 대퇴골을 깨지 않고 엉덩이 관절에서 아세타부를 조심스럽게 제거하십시오. 발목 관절에서 발을 자르고 뼈를 70 %에탄올로 스프레이하십시오.그런 다음 종이 타월로 근육의 나머지 부분을 제거하고 2 % FBS로 보충 된 PBS의 5 센티미터 페트리 접시에 뼈를 놓습니다. 다음으로 각 뼈 세트의 무릎 관절을 구부리고 뼈를 가위로 조심스럽게 분

expression-fluorescent-fusion-proteins-murine-bone-marrow-derived

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

돌기 세포의 이해의 항원과 T 세포 항원 처리를 제시 면역 기관으로 마이 그 레이션. Qdot nanocrystal 라벨은 오랫동안 안정 형광 신호를 제공합니다. 이것은 형광 현미경에 의해 다른 기관에 돌기 세포 추적하실 수 있습니다.

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)로 배양된 골수 세포는 대식세포와 수지상 세포(DC)를 포함하는 이종 배양을 생성합니다. 이 방법은 MHCII 및 히알루로난(HA) 결합을 사용하여 GM-CSF 배양의 DC와 대식세포를 구별하는 방법을 강조합니다. 이 문화권의 대식세포는 폐포 대식세포와 많은 유사점을 가지고 있습니다.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

이 연구는 cytometry 반응성 산소 종 (선생님) 생산은 FcγR의 활성화에서 결과 검색의 사용을 보여줍니다. 항균 및 산화 환 원 신호 면역성이 있는 복합물, opsonized 미생물, 또는 직접 FcγR cross-linking에 식 세포의 기능을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

배우세요 생쥐 골수 유래 수지상 세포와 대식세포에서 형광 융합 단백질을 발현하는 방법을. 레트로바이러스를 이용한 유전자 전달과 세포 분화 과정을 통해 단백질 역학을 연구할 수 있습니다.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

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