Name: Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 배우세요 생쥐 골수 유래 수지상 세포와 대식세포에서 형광 융합 단백질을 발현하는 방법을. 레트로바이러스를 이용한 유전자 전달과 세포 분화 과정을 통해 단백질 역학을 연구할 수 있습니다.

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이 작품으로 체코 과학 재단 (GACR) (프로젝트 번호 16-07425S)에 의해 찰스 대학 부여 기관 (GAUK) (프로젝트 번호 923116) 및 기관 자금에서 연구소의 분자 유전학, 체코의 과학 아카데미에 의해 지원 되었다 공화국 (RVO 68378050)입니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 복지의 실험 동물에 분자 유전학 연구소의 전문가 위원회에 의해 및 체코 공화국의 과학 아카데미에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 시 약 준비
<ol><li>염화 염화 칼륨 (ACK) 버퍼를 준비 합니다. DdH2O의 500 mL를 NH4Cl의 4.145 g 및 0.5 g KHCO3 를 추가 다음 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 100 µ L을 추가 하 고 필터를 소독.</li>
	<li>Polyethylenimine (페이) 솔루션을 준비 합니다. DdH2오의 90 mL에 PEI의 0.1 g을 추가 교 반, 하는 동안 추가 1 M HCl dropwise pH 2.0 보다 낮은 될 때까지. 페이 해산 될 때까지 최대 3 h에 대 한 약동 하 고 1 M NaOH와 7.2에 pH를 조정 합니다. DdH2O 100 mL을 볼륨을 조정 하 고 필터를 소독. 1-2 mL aliquots를 확인 하 고-20 ° c.에 저장 참고: 녹고, 후 페이 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장 될 수 있지만 다시 동결 하지 해야 합니다.</li>
	<li>M-CSF 또는 GM-CSF를 포함 하는 셀 문화 supernatants 준비. 이러한 supernatants 사전 고-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. 이러한 supernatants 있도록 합류 cytokine 생산 세포 (GM-CSF 18 J558 세포) 또는 M-CSF 19CMG 14-12 셀 10 cm에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 페 트리 접시에 성장. 다음 모든 셀을 5% CO2에 추가 4 일 T150 조직 배양 플라스 크에 문화 미디어의 200 mL을 전송 37 ° c. 0.2 µ m 살 균 필터에 상쾌한 및 필터를 수집 합니다. Aliquots를 확인 하 고 이러한-80 ° c.에 저장</li>
	<li>세포 배양의 100 mL를 준비: 10% 보충 DMEM 사 FBS 위와 문화 supernatants GM-CSF (BMDC 차별화)에 대 한 또는 (BMDM 차별화)에 대 한 M-CSF를 분 비 하는 세포에서 세포. 참고: 이러한 supernatants에서 cytokines의 양이 다를 수 있습니다 고 작업 농도 경험적으로 확인할 수 있다. 일반적으로 2-3% 상쾌한 GM-CSF (권장된 시작 농도 2%) 또는 5-10% 상쾌한 CMG에서 M-CSF (권장된 시작 농도 10%)을 생산 하는 14-12 셀을 생산 하는 셀 라인에서 사용 됩니다. 또는, 상업적으로 정화 10 ng/mL에서 사용할 수 있는 M-CSF와 GM-CSF 20 ng/mL에서 사용할 수 있습니다 포함 하는 cytokine supernatants, 즉거의 동일한 결과 함께., 차별화, 감염 효율의 속도에 아무런 영향 없이 그리고 EGFP 태그 구문의 subcellular 지 방화입니다. 항생제, 페니실린을 포함 한 G (100 IU/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 gentamicin (40 µ g/mL), 사용할 수 있습니다 세포 배양 프로토콜의 어떤 단계에서 달리 명시 하지 않는 한.</li>
</ol>2입니다. 레트로 바이러스의 생산
주의: retroviral 벡터는 바이러스 성 벡터의 다른 유형에 비교 될 때 상대적으로 안전 하 게, 하지만 그들은 여전히 포즈 잠재적인 안전 위험. 따라서, 그것은 최상의 진료와 적절 한 보호 장비, 작동 하 고 모든 안전 규정 및 바이러스 성 입자와 작업에 대 한 법적 요구 사항을 준수 하기 위해 중요 합니다.
<ol><li>플레이트 10 cm 배양 접시에에서 백 금-에코 (같은-E) 포장 셀의 단일 세포 현 탁 액 및 10% 포함 된 DMEM의 15 mL에 육성 FBS 합칠 50-60% (24 시간)까지. 세포는 단층에서 성장 해야 하 고 문화에서 덩어리를 형성 한다.</li>
	<li>Retroviral 구문의 피펫은 20 µ g (예., 붙일 태그가 단백질 pMSCV 벡터에 대 한 관심의 표현 구문)과20 (혈 청 없이 항생제) DMEM의 1 mL에 벡터와 부드럽게 믹스는 pCL 에코 포장의 10 µ g.</li>
	<li>두 번째 튜브, PEI의 75 µ L (혈 청 없이 항생제) DMEM 1 mL에 추가 합니다. 실 온 (RT)에서 5 분을 품 어 하 고 믹스 두 튜브의 내용을 함께 실시간에 추가 10 분 동안 품 어 참고: pCL 에코의 추가 선택 사항입니다. 그것은 ecotropic 바이러스 성 수용 체에 대 한 코딩 하 고 바이러스 titer를 증가 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>신중 하 게 2% 신선한 DMEMsupplemented 8 mL 같은 E 셀에 매체를 바꿉니다 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체. 항생제 transfection 효율을 줄일 수 있기 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>신중 하 게 단계 2.3 같은 E 셀에 준비 하는 혼합물 (정)에 추가 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어</li>
	<li>부 화 후 10%를 포함 하는 미리 데워 DMEM의 10 ml 같은 E 셀에 매체 교환 FBS, 37 ° c.에 24 h에 대 한 셀을 육성 이 부 화 하는 동안 같은 E 셀 미디어에 바이러스를 생산할 예정 이다.</li>
	<li>24 시간 후 5 mL 피 펫을 사용 하 여 백 금 에코 셀에서 retroviral 입자를 포함 하는 매체를 수집 하 고 전송 (ecotropic retroviral 입자를 포함 하는 "표면에 뜨는 1" =) 15ml 원심 관 하.</li>
	<li>같은 E 셀 바이러스 supernatants에 의해 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 5 분 1250 × g에서 수집 된 바이러스 최상의 결과 얻으려면, 바이러스 감염에 대 한 즉시 사용 되어야 한다. 참고: 바이러스의 Aliquots 또한 나중에 사용에 대 한-80 ℃에 저장할 수 있습니다. 그러나, 그것은 변환 효율 특정 감소에 발생 합니다. 반복적인 동결/녹고는 바이러스의 때문에 그것은 바이러스 저하로 연결 하지 마십시오.</li>
	<li>10 %FBS 같은 e 세포 고 37 ° c.에 다른 24 h에 대 한 육성으로 미리 데워 DMEM의 10 mL을 추가</li>
	<li>2.7 단계를 반복 합니다. 그리고 2.8입니다. "표면에 뜨는 2" 취득을</li>
</ol>3. murine 골 수 세포 격리
<ol><li>자 궁 경부 전위 또는 다른 승인 된 메서드를 사용 하 여 마우스를 희생. 70% 에탄올과 마우스 스프레이입니다.</li>
	<li>핀셋과가 위를 사용 하면, 피부 뿐만 아니라 근육의 부분 뒷 다리에서 제거할. 신중 하 게 대 퇴 골을 깨지 않고는 고관절에서 있습니다를 분리 하십시오. 발목 관절에서 발을 잘라. 70% 에탄올과 뼈 (대 퇴 골 경골에 연결)를 스프레이 종이 타월을 사용 하 여 근육의 나머지 부분을 제거.</li>
	<li>버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) 2%를 포함 하는 5 cm 페 트리 접시에는 뼈를 배치 FBS (PBS-FBS).  더 많은 뼈를 준비 하는 경우 처리 될 때까지 얼음에 페 트리 접시를 유지.</li>
	<li>무 균 재배 확보를 위한 조직 문화 후드에 모든 다음 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>뼈 끝 (공동과 위로 조심 스럽게 잘라 무릎에 벤드)을 깨지 않고 경골에서 대 퇴 골을 구분 합니다.</li>
	<li>뼈 하나 하나를 처리 합니다. 가 위 핀셋에 뼈를 잡고 epiphyses (약 1-2 m m)의 매우 작은 부분을 잘라.</li>
	<li>30g 바늘을 사용 하 여 2 또는 5 mL 주사기 15ml 원심 관으로 뼈의 양쪽 끝에서 골 수 세포를 PBS FBS 가득. 모든 셀을 제거 하기 위하여 홍 조 동안 뼈 안에 바늘을 이동 합니다. 바늘 막힌 되 면, 그것은 변경 합니다. 참고: 뼈 해야 차례 빨강에서 백색 내리는 동안. 이 대부분의 세포는 뼈에서 제거 되었습니다 나타냅니다. 약 2-3 mL PBS FBS의 뼈 당을 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 실 온에서 2-3 분에 대 한 ACK 버퍼의 2.5 mL에 펠 릿을 resuspending 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse. 세포, 동안 신선한 15 mL centrifug 튜브로 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 골 수 세포를 필터링. 12 mL PBS FBS의 추가 샘을 복원 합니다. 참고: 침투성 세포 세포 죽음을 피하기 위해 ACK 버퍼의 5 분을 초과 하지 마십시오.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 즉시 원심</li>
</ol>4. 골 수 세포 분화 골으로 파생 된 대 식 세포
<ol><li>DMEM 10 %FBS 항생제 보충에 골 수 세포의 펠 릿 resuspend (1.4 단계 후 메모를 참조 하십시오. 항생제 농도) 셀을 카운트. BM으로 분화 세포 파생, 대 접시 5-10 x 106 골 셀에 10 cm 비-조직 문화 단계 1.4에서의 혈 청 및 M-CSF 미리 준비 된 DMEM 미디어 10 mL와 함께 (세균성) 페 트리 접시를 취급. 참고: 골 수 세포의 수율은 약 4 x 107 / 6-8 주-오래 된 C57BL/6J 마우스.</li>
	<li>셀 셀 문화 인큐베이터에 5% CO2, 37 ° c.에 3 일 동안 품 어 참고: 처음 2 일 동안 셀 매우 중요 한, 보이지 않는 apoptotic 세포의 많은 수는 현재 (세포 골수성 세포와 말기 차별화 된 세포로 분화 수 없습니다).</li>
	<li>3 일 후, 골 수 세포 배양 중요 한 보고를 시작 하 고 셀 분할의 클러스터 형성 된다. 최초의 부착 세포 이미 관찰할 수 있습니다. 이 시점에서, 신선한 cytokine 미디어 셀 보충.</li>
	<li>각 10 cm 배양 접시에 혈 청 및 M-CSF (단계 1.4)에서 미리 데워 DMEM 미디어의 10 mL를 추가 하 고 셀 문화 인큐베이터에 반환. 이 단계 동안 오래 된 미디어를 제거할 필요가 있다. 참고: 골 수 세포는 문화에서 5-7 일 후 완전히 분화 된다. 하루 6-8, 점착 및 페 트리 접시에 있는 세포의 대부분은 완전히 덮여 수확에 대 한 가장 좋은 시기가입니다.</li>
	<li>5 일에 셀 문화 후드로 페 트리 접시를가지고 고 미디어는 거의 접시의 가장자리에 도달 될 때까지 접시를 경사. 신중 하 게, 가장자리 근처 표면에서 미디어의 15 mL를 꺼내와 셀 접시의 한가운데에 체류 하는 경향이. 미리 데워 진된 미디어 M-CSF의 동일한 볼륨을 추가 하 고 다시 인큐베이터에 접시를 놓고. 참고: 미디어는 천천히, 그리고 신중 하 게 발음 하 고, 거의 셀 손실 됩니다. 그러나, 그것은 또한 aspirated 미디어 원심 하 여 다시 없는 비 부착 되도록 문화에 셀을 추가 (즉., 불완전 하 게 분화) 셀 손실 됩니다.</li>
	<li>실험, 부착 셀 (세포)만 사용 된다. 하루 6 또는 7에 셀, 수확, 모든 미디어와 부동 셀을 제거 합니다. 한번 혈 청 하지 않고 미리 데워 공영으로 접시를 씻어.</li>
	<li>PBS에 0.02 %EDTA 5 mL을 추가 하 고 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 3-5 분 동안 품 어.</li>
	<li>5 mL 피 펫을 사용 하 여 요리 하 여 한 스트림을의 PBS-EDTA에서에서 셀을 제거 하 고 PBS의 25 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 넣어. 필요한 경우 더 많은 요리를 함께 풀.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 즉시 원심</li>
	<li>DMEM 미디어에서 대 식 세포 pellet을 resuspend 및 셀. Cytometry 여 대 식 세포 표면 차별화 마커 (CD11b 및 f 4/80)의 식을 확인 합니다.</li>
	<li>세포에, 예수 필요로 하는 실험에 대 한., cytometry 실험, 정량 또는 서쪽 오 점 분석 흐름, 대 식 세포를 사용 하 여 직접. 부착 세포와 실험, 실험 설정에 따라 조직 문화 접시에 셀 접시.</li>
	<li>세포는 이미 완전히 분화 된다. 원하는 실험에 적합 한 미디어 또는 M-CSF와 원래 성장과 분화 미디어에서 그들을 유지. 참고: 부착 세포, 작업에 새 전송에 대 한 새로운 표면에 완전 접착 수 있도록 (이상적으로 하룻밤) 사용 하기 전에 적어도 6 h 플레이트. 세포의 작은 분수 실험 하기 전에 제거할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 골 수 세포 분화 골에 유래 수지상 세포
<ol><li>조정 단계 5.2-5.4에에서 아래 설명 된 BMDCs에 대 한 특정 BMDMs에 대 한 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>10 %FBS 항생제 DMEMsupplemented에서 골 수 세포의 획득된 펠 릿 resuspend 및 세포 (대 식 세포 프로토콜의 다음 단계 4.1)에 의해. 수지상 세포로 분화, 플레이트 1-1.5 x 107 골 수 세포에 있는 10 cm 비-조직 문화 (단계 1.4.)에서 혈 청 및 GM-CSF 미리 준비 된 DMEM 미디어 10 ml에서 (세균성) 페 트리 접시 처리.</li>
	<li>BMDM 프로토콜에서 동일한 재배 단계 (4.3-4.5 단계. 대 식 세포 프로토콜의). DMEM 미디어를 사용 하 여 혈 청 및 M-CSF 대신 GM-CSF. 때문에 BMDCs에 대 한 재배 시간이 깁니다 (일반적으로 10-12 일), 추가 1-2 추가 수 유 3 일 간격으로 (제거는 상쾌한 고 4.5 단계에에서 설명 된 대로 새로운 재배 미디어 추가.).</li>
	<li>이 프로토콜의 부분은 거의 같은 대 식 세포 프로토콜의 해당 부분 (4.6-4.12 단계. 대 식 세포 프로토콜의). 실험에 대 한 부착 셀만 사용 합니다. 하루 10-12, 수집, EDTA를 사용 하 여 셀에 계산 하 고 새로운 표면에 접시. 수지상 세포의 표면 차별화 마커의 식 확인 (CD11c +, CD11b + F4/80-) cytometry에 의해.</li>
</ol>6. BMDMs와 관심의 EGFP 태그 단백질을 표현 하는 BMDCs의 생산
<ol><li>3.10 단계에서에서 얻은 골 수 세포의 펠 릿 resuspend DMEM에서 10 %FBS 항생제 보충과 셀. 감염에 대 한 사용 2-5 x 106 6 잘 조직 배양의 당 BM 셀의 플레이트 취급.</li>
	<li>1 ml 당 준비 된 DMEM 미디어의 셀 음, M-CSF BMDMs에 차별화 또는 GM-CSF BMDCs. 차별화에 대 한 보충 판 37 ° c.에 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 4-6 h에 대 한 셀을 유지</li>
	<li>Polybrene (12 µ g/mL, 셀에 추가 후 최종 농도 8 µ g/mL)와 보충 갓 수집 된 바이러스 ("표면에 뜨는 1")의 2 개 mL를 추가 합니다. 참고: 바이러스 포함 된 상쾌한의 얼어붙은 약 수 사용할 수 있습니다 또한, 하지만 효능은 낮은 것 이다.</li>
	<li>90 분 (느린 가속도와 감속) 30 ° C에서 1250 x g에서 격판덮개 원심 그런 다음, 5% CO2 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어</li>
	<li>옵션: 대체 문화 미디어의 2 mL 신선한 매체 포함 각각 cytokine (M-CSF 또는 GM-CSF)와 37 ° c.에 5% CO2 와 문화 두 번째 날, 문화 미디어의 2 개 mL를 제거 하 고 갓 수집 된 바이러스 ("표면에 뜨는 2")의 2 개 mL로 전체 감염 절차 (6.3-6.4 단계)를 반복 합니다. 참고:이 단계는 감염 효능을 증가할 수 있습니다. 개선 후 두 번째 감염 세포 유형 및 대상 단백질에 및 우리의 경험에 따라 변화할 수 있다 30% 증가에서 효율에서 개선 전혀.</li>
	<li>수집 비 부착 한 세포 15ml 원심 관에 전송 하 고 5 분 (4 ° C) 500 x g에서 회전. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>M-CSF 또는 GM-CSF 문화 미디어 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend, 셀 10cm 조직 문화 치료 페 트리 접시에 놓고 37 ℃, 5% CO2에서 문화. 10 cm의 요리에 대 한 셀의 최적 수는 5-10 x 106 BM 파생 된 세포 및 10-15 x 106 BM 파생 수지상 세포. 참고: 작은 접시 또는 접시 사용할 수 있습니다, 하지만 셀 번호를 적절 하 게 조정 해야 합니다.</li>
	<li>따라는 대 식 세포와 수지상 세포 및 분화 프로토콜 4 및 5 단계에서 설명한.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

대상 셀에 관심사의 단백질의 표정은 다양 한 생물 학적 연구에에서 중요 한 단계. 차별화 된 대 식 세포와 수지상 세포는 표준 transfection retroviral 변환 기법에 의해 transfect 어렵다. 이러한 소성 cDNAs의 식을 수 있도록 중요 한 단계는 골 수 창시자, 그들은 이미 원하는 구문을 수행할 때 차별화 뒤 retroviral 변환으로 이러한 차별화 된 세포의 transfection를 무시 셀 유형입니다. 이 방법의 성공적인 사용의 예는 우리의 최근 게시25에서 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 안정적인 표현의 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포는이 접근을 사용 하 여 선택의 구조를 달성 하기 위한 비용 효율적인 프로토콜을 제공 합니다. 우리가 제시 하는 절차는 상대적으로 저렴 하 고 간단 하 고, 아직 매우 좋은 결과 제공. 시 약이이 프로토콜에 사용 되는 상대적으로 제한적인 예산 에서도 일상적인 사용에 대 한 수 있습니다. 같은 E transfectio...

골수성 세포는 병원 체에 대 한 우리의 방어 메커니즘의 필수적인 부분을 나타냅니다. 그들은 죽어가는 세포 뿐 아니라 미생물, 빠르게 제거 수 있습니다. 또한, 그들은 또한 관련 규제 조직 개발 및 수리 및 항상성1,2,3를 유지. 모든 골수성 세포는 골 수에서 일반적인 골수성 창시자에서 차별화. 많은 기능 및 형태학 상으로 가지 하위 집합으로 그들의 차별화는 cytokines와 그들의 다양 한 조합4제어 대부분입니다. 가장 집중적으로 공부 골수성 세포 하위 집합 neutrophilic granulocytes, 대 식 세포와 수지상 세포를 포함합니다. 이러한 인구 중 결함 잠재적으로 생명을 위협 문제 원인의 인간과 쥐,12,3,5, 의 면역 체계의 심각한 장애를 일으킬 6.
Neutrophilic granulocytes, 달리 수지상 세포와 대 식 세포는 조직 거주 세포 그리고 면역 기관에 그들의 풍부는 상대적으로 낮은. 그 결과, 분리와 기본 수지상 세포와이 세포의 많은 수를 요구 하는 실험에 대 한 세포의 정화 이며 비싼 종종 불가능. 이 문제를 해결 하려면 프로토콜 동종 대 식 세포 나 수지상 세포 생체 외의 다량을 얻기 위해 개발 되었습니다. Cytokines의 존재 murine 골 수 세포의 분화를 기반으로하는 이러한 접근: 대 식 세포 그리고 granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 또는 Flt3 리간드에 대 한 대 식 세포 콜로 니 자극 요소 (M-CSF) 수지상 세포7,8,9,10,,1112. 이 메서드에 의해 생성 된 셀 일반적으로 문학에서 골 수 유래 세포 (BMDMs) 및 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs)으로 설명 합니다. 그들은 주 대 식 세포 또는 해당 셀 라인 보다 수지상 세포와 더 많은 생리 적 속성을 있다. 또 다른 주요 장점은 유전자 이러한 세포 형태를 얻기의 가능성 수정 마우스13입니다. 야생-타입 셀 간의 비교 연구 하 고 유전자 변형된 생쥐에서 파생 된 세포는 유전자의 잠복 소설 기능 또는 관심사의 단백질에 대 한 중요 한.
살아있는 세포에 있는 단백질의 subcellular 지 방화의 분석 vivo에서관심사의 단백질에 형광 라벨의 결합을 필요합니다. 이것은 가장 일반적으로 유전자 인코딩된 퓨전 구문 형광 단백질을 (종종 짧은 링커)을 통해 결합 하는 분석 된 단백질의 구성으로 표현 하 여 달성 (예., 녹색 형광 단백질 (GFP))14,15 , 16. 수지상 세포 나 대 식 세포에 붙일 태그가 단백질의 식을 도전 이다. 이 세포는 일반적으로 표준 transfection 절차에 의해 transfect 어렵다 고 효율성 매우 낮은 경향이. 또한,는 transfection는 일시적, 그것은 세포 스트레스를 생성 하 고 달성된 강도의 형광 현미경 검사 법17에 대 한 충분 한 되지 않을 수도 있습니다. Transgene 식 retroviral 골 조상 세포의 감염의 충분 한 수준으로 이러한 셀의 합리적인 부분을 얻기 위해 벡터와 BMDMs 또는 BMDCs에 그들의 후속 차별화 되고있다 매우 효율적 접근입니다. 그것은 그들의 원래 세포 환경 안정 된 상태에서 또는 먹어서, 면역학 시 냅 스 형성 또는 마이그레이션 같은 면역 반응에 대 한 중요 한 프로세스 동안 골수성 근원의 단백질의 분석에 대 한 허용 했다. 여기, 우리 파생 murine 골 수 세포와 수지상 세포에 붙일 태그가 단백질의 안정적인 식 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,</td><td>USA 10270</td><td>미디어 확산용</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Lachema, Brno, Czech Republic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>BB Pharma AS, 프라하, 체코 공화국</td><td>N/A</td><td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&Aacute; SOL' BIOTIKA</td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치 (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S9137</td><td>스트렙토마이신 설페이트 염 분말</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&aacute; lov&eacute;, Czech Republic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td><td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>IMG ASCR, Prague, Czech</td> <td>Republic의 미디어 시설에서 자체 준비N/A</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse/human CD11b 항체, clone M1/70</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101212</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>PE anti-mouse F4/80 항체, clone BM8</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>123110</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD11c 항체, 클론 N418</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>117310</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>H1398</td><td>유세포 분석 사용 1-2 &micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

수지상 세포와 대 식 세포는 병원 체에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 형성 하는 중요 한 세포 이다. 그들은 또한 적합 한 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생합니다. 이러한 세포와 실험 작업은 오히려 도전적 이다. 그들의 풍부한 장기와 조직에 상대적으로 낮습니다. 결과적으로, 그들은 큰 숫자에서 고립 될 수 없습니다. 그들은 또한 transfect cDNA 구문으로 어렵다입니다. Murine 모델에서 이러한 문제는 골 수 세포에 대 한 M-CSF 또는 수지상 세포에 대 한 GM-CSF의 창시자에서 생체 외에서 분화에 의해 부분적으로 극복할 수 있습니다. 이 방법에서는, 아주 몇몇 동물에서 이러한 셀의 대용량을 얻을 수입니다. 또한, 골 창시자 retroviral 벡터 들고 이전에 파생 하는 골 수 수지상 세포와 대 식 세포로의 분화 재배의 초기 단계 동안에 cDNA 구문으로 불리고 있습니다. 따라서, 이러한 셀에 다양 한 cDNA 구문 표현 하 retroviral 변환 뒤에 체 외에서 분화를 사용할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 형광 단백질, 탠덤 담긴 위하여 분석, 구조-기능 분석, 대 한의 포함 하 여 이러한 셀에 수행할 수 있는 실험의 범위를 확장 하는 실질적으로 소성 단백질을 표현 하는 능력 모니터링 바이오 센서와 다른 많은 세포질 기능. 이 문서에서는, 우리 붙일 태그가 단백질 코딩 벡터와 retroviral 변환 파생 murine 골 수 수지상 세포와 대 식 세포에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 두 어댑터 단백질, OPAL1 및 PSTPIP2, 예를에 우리 cytometry에 현미경의 실용적인 응용 프로그램을 보여 줍니다. 우리는 또한 장점 및이 방법의 한계를 설명.

신호 어댑터 단백질은 어떤 효소 활동 없이 일반적으로 작은 단백질. 그들은 다양 한 상호 도메인을 소유 또는21tyrosine kinases, 가수분해, 유비퀴틴 ligases 등 신호 변환에 관련 된 주제, 다른 단백질 바인딩 중재. 이 프로토콜의 기능의 데모에 대 한 PSTPIP2 및 OPAL1 골수성 세포 어댑터 선정 됐다. PSTPIP2 잘 특징이 단백질 염증 반응을22의 규칙에 관련 된 이다. 그것은 또한 F 바 도메인을 통해 세포 막 채용 될 수 있는 세포질 단백질입니다. 두 번째 단백질은 막 횡단 어댑터 OPAL1, 세포 멤브레인과 연결 될 것으로 예상 된다. 그것의 생리 기능은 아직 알려져 있지 않습니다. 그러나, 급성 림프 구성 백혈병에서 OPAL1 표현의 더 나은 예 지23와 연결 됩니다.
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이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

이 방법은 이러한 세포 유형에 있는 각종 단백질의 세포 소소화 및 역학에 관하여 대식세포 및 수지상 세포 생물학의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 저렴하며 사용 가능한 대부분의 다른 방법보다 표현의 효율성과 안정성을 입증한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생 인 Jarmila Kralova가 될 것입니다.레트로바이러스를 생산하기 위해, 10센티미터 페트리 접시에 플래티넘 에코 패키징 세포의 단일 세포 현탁액을 플레이트와 DMEM의 15 밀리리터에서 세포를 육성하고, 배양이 50 내지 60%의 컨실루물이 될 때까지 10%의 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충한다. 다음 날, 관심의 레트로 바이러스 구조의 20 마이크로 그램과 부드러운 혼합과 함께 세럼없이 DMEM의 1 밀리리터에 PCL 에코 패키징 벡터의 10 마이크로 그램을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 두 번째 튜브에 세럼과 항생제없이 DMEM의 1 밀리리터에 75 마이크로리터의 PEI를 추가하고 실온에서 추가로 10 분 배양을 위해 두 튜브의 내용을 혼합합니다.다음으로, 플래티넘 에코 셀의 배지를 2%의 FBS로 보충한 신선한 섭씨 37도의 8밀리리터로 조심스럽게 교체하고, 플레이트에 낙하하여 경질 혼합물을 조심스럽게 첨가한다. 섭씨 37도에서 4시간 배양 후, 수퍼네티드를 섭씨 37도의 10밀리리터로 대체하고, 섭씨 37도에서 24시간 배양시 10%의 FBS를 보충합니다. 다음 날, 5 밀리리터 파이펫을 사용하여 에코트로픽 레트로바이러스 입자 함유 슈퍼나텐트를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의한 이물질을 제거하고 세포를 포함한다.한편, 섭씨 37도의 밀리리터 10밀리리터와 10%의 FBS를 문화 요리에 추가하여 섭씨 37도에서 24시간 배양을 더하고, 방금 입증된 바와 같이 두 번째 바이러스 성 입자를 수집합니다. 골수를 수확하려면 조직 배양 후드에서 핀셋과 가위를 사용하여 뒷다리에서 근육의 피부와 부분을 제거하고 대퇴골을 깨지 않고 엉덩이 관절에서 아세타부를 조심스럽게 제거하십시오. 발목 관절에서 발을 자르고 뼈를 70 %에탄올로 스프레이하십시오.그런 다음 종이 타월로 근육의 나머지 부분을 제거하고 2 % FBS로 보충 된 PBS의 5 센티미터 페트리 접시에 뼈를 놓습니다. 다음으로 각 뼈 세트의 무릎 관절을 구부리고 뼈를 가위로 조심스럽게 분리합니다. 가위를 사용하여 한 뼈의 각 표피의 약 1 ~2 밀리미터를 제거하고 신선한 PBS 플러스 FBS가장착 된 2 개 또는 5 밀리리터 주사기를 사용하여 뼈의 양쪽 끝에서 골수를 15 밀리리터 원심분리기로 플러시하십시오.골수가 각 뼈로부터 수집되었을 때, 원심분리에 의해 뼈 세포를 펠릿과 실온에서 2~3분 동안 적혈구 용해 버퍼의 2.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 용해 후, 새로운 15 밀리리터 원심 분리기 튜브로 100 마이크로 미터 세포 여과기를 통해 세포를 필터링하고 PBS 플러스 FBS의 12 밀리리터와 끈기를 복원합니다. DMEM에서 펠릿을 다시 중단, 계산 및 10 센티미터에서 여섯 번째 골수 세포에 5 ~ 10 배 10 배 10 배, 비 조직 배양 처리 페트리 접시에 10 혈청 및 대식세포 식민지 자극 계수, 또는 MCSF에 펠릿을 다시 중단.문화의 5 일째에, 조심스럽게 세포 배양 접시를 기울이고 접시의 가장자리 근처 표면에서 매체의 약 5 밀리리터를 제외한 모든 제거. 그런 다음 FBS 및 MCSF로 보충된 신선한 섭씨 37도 의 20 밀리리터를 접시에 추가하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 세포를 수확하려면 6~7일째에 모든 배지 및 부동 세포를 제거하고 37도 의 PBS로 배양을 세척한다.조직 배양인인큐베이터에서 섭씨 37도에서 3~5분간 5밀리리터와 PBS의 5밀리리터를 부착하고 5밀리리터 파이펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 분리된 세포를 부드럽게 플러시합니다. 그런 다음 신선한 PBS의 25 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 세포를 전송합니다. 골수 유래 항원 제시 세포에서 EGFP 태그 단백질 발현을 유도하기 위해, 세포 분화 프로토콜의 시작 부분에서, 골수 세포를 DMEM 플러스 FBS 및 항생제 의 밀리리터 당 6세포당 2~5배 10배로 희석시키고, 적절한 상이한 사이토킨으로 보충하였다.세포 배양 인큐베이터에서 4~6시간 후, 폴리브레인으로 보충된 수집된 바이러스의 첫 번째 라운드의 밀리리터 2개를 추가하고 세포 배양배기에서 원심분리및 4시간 배양에 의해 세포 배양을 트랜스듀스한다. 전이 기간이 끝나면, 각 웰에서 비부착 세포를 개별 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 세포의 더 큰 양이 필요한 경우, 세포는 여러 우물에서 동일한 단점으로 감염될 수 있으며 분화 전에 풀로 만들 수 있습니다.그런 다음 적절한 분화 사이토카인으로 보충된 배양 배지의 10밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 튜브당 10센티미터 비조직 배양처리페트리 접시에 세포를 플레이트, 6~8일 배양에 대해 단지 입증하였다. 슈퍼네이트를 함유한 제2 바이러스의 수집 후 혈류 세포측정에 의한 플래티넘 에코 경화의 효능에 대한 평가는 PSTPIP2-EGFP의 평균 회전 효율이 62%, OPAL1-EGFP의 경우 53%의 평균 경전 효율을 나타낸다. 레트로바이러스 트랜스듀션은 두 배양에서 세포의 90% 이상을 가진 골수 유래 세포의 분화 상태에 영향을 미치지 않으며, 둘 중 어느 바이러스와도 의전후 각각의 마커에 대한 양성을 입증한다.그리고 분화 된 세포의 두 가지 유형에 대해 관찰 된 적절한 특성 형태학적 변화가 있습니다. 참고, EGFP의 전반적인 발현은 레트로바이러스의 종류에 관계없이 골수 유래 수지상 세포 배양에서 하부되었다. 이 절차를 시도하는 동안, 실험을 위해 접시에서 세포를 제거하려는 경우 일반적으로 박테리아를 재배하는 데 사용되는 비 조직, 문화 치료 플라스틱 요리를 사용하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 다른 방법은 세포 이미징, 슈퍼 해상도 현미경 검사또는 현미경 검사법의 다른 유형은 수지상 세포 및 관심의 세포 단백질의 세포 소세포 국소화 및 역학에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 사용될 수있다. 이 기술은 대식세포와 수지상 세포에 의해 표현된 단백질의 분포 그리고 간격 관계를 탐구하고 면역 반응 도중 이 단백질의 기능에 대한 우리의 이해를 발전시키기에서 면역학 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 바이러스 성 입자와 함께 작업하는 것은 매우 위험 할 수 있으며 에어로졸 생성을 최소화하고 보호 장비를 착용하고 라미나르 유동 후드를 사용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

돌기 세포의 이해의 항원과 T 세포 항원 처리를 제시 면역 기관으로 마이 그 레이션. Qdot nanocrystal 라벨은 오랫동안 안정 형광 신호를 제공합니다. 이것은 형광 현미경에 의해 다른 기관에 돌기 세포 추적하실 수 있습니다.

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)로 배양된 골수 세포는 대식세포와 수지상 세포(DC)를 포함하는 이종 배양을 생성합니다. 이 방법은 MHCII 및 히알루로난(HA) 결합을 사용하여 GM-CSF 배양의 DC와 대식세포를 구별하는 방법을 강조합니다. 이 문화권의 대식세포는 폐포 대식세포와 많은 유사점을 가지고 있습니다.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

이 연구는 cytometry 반응성 산소 종 (선생님) 생산은 FcγR의 활성화에서 결과 검색의 사용을 보여줍니다. 항균 및 산화 환 원 신호 면역성이 있는 복합물, opsonized 미생물, 또는 직접 FcγR cross-linking에 식 세포의 기능을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정

대식세포, 특히 1차 대식세포는 비자기 기원의 분자를 검출하는 것을 전문으로 하기 때문에 트랜스펙트에 도전하고 있습니다. 우리는 플라스미드와 같은 DNA 템플릿에서 생성된 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고도로 능률적인 형질혈을 허용하는 프로토콜을 기술합니다.

체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

배우세요 생쥐 골수 유래 수지상 세포와 대식세포에서 형광 융합 단백질을 발현하는 방법을. 레트로바이러스를 이용한 유전자 전달과 세포 분화 과정을 통해 단백질 역학을 연구할 수 있습니다.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

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