Name: 생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 개 호중구에서 형광 현미경을 이용한 중성구 세포외 함정(NET) 형성의 실시간 관찰 및 정량화 방법을. 면역 형광을 통해 citH3 발현을 분석하여 면역 반응 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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해당 작가 모리스 동물 재단 (D15CA-907)에 의해 투자 되었다. 연구 캘리포니아 대학, 데이비스, 말 건강 센터 및 동반자 동물 건강을 위한 센터에서 기금에 의해 지원 되었다 (2016-24-F). 저자는 비디오와 함께 그녀의 지원에 대 한 수치와 응이 구 엔 그녀의 지원에 대 한 지 나 Ng를 인정 하 고 싶습니다.

여기에 설명 된 모든 방법을 기관 동물 관리 및 사용, 데이비스가 주 대학에 위원회에 의해 승인 했다 (번호를 프로토콜: 18338).
1. 혈액 컬렉션
<ol><li>21g 바늘을 사용 하 여 주사기 포부에 의해 두 부 또는 jugular 정 맥에서 혈액 10 mL을 그립니다.</li>
	<li>과도 한 전단 응력을 방지 하려면 나트륨 덤플링을 (75 USP)를 포함 하는 tube(s)로 혈액을 전송 하기 전에 주사기에서 바늘을 제거 합니다. 부드럽게 반전 튜브 몇 번 응고 제와 혈액의 적절 한 혼합 되도록. 혈전 또는 얼음에 샘플을 배치 하기 전에 레드 셀 집계를 확인 합니다.</li>
</ol>2. 호 중구 절연
<ol><li>얼음 처럼 차가운 Dubecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) (pH 7.4, divalent 양이온 없이)의 동등한 양으로 anticoagulated 혈액 희석. 8 mL 희석된 혈액의 포함 ( Leuconostoc 종 0.9% 염화 나트륨 용액에 녹아 있는)에서 3 %dextran 25 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 관으로 전송 합니다. 튜브를 집계 및 적혈구의 침 강 30 분 동안 실내 온도에 똑바로 놓습니다.</li>
	<li>신중 하 게 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 위에 백혈구 풍부한 혈장 (그림 1)의 5 mL를 계층. 2 솔루션11혼합에 아닙니다 조심 하십시오.</li>
	<li>400 x g 가속/감속을 실 온에서 30 분 동안 0 (브레이크) (A/D) 설정에서 튜브 원심</li>
	<li>5 mL를 사용 하 여 혈 청 학적인 피펫으로 플라즈마 및 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 층 (그림 1)를 우회 하 여 granulocyte 셀 레이어를 수집 합니다. 오염을 최소화 하기 위해 새로운 피펫으로 각 시간을 사용 합니다.</li>
	<li>폴 리 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브에 polymorphnuclear (PMN) 세포 층의 4 ~ 6 mL를 배치 합니다. 적은 양의 적혈구 집계 PMN 레이어와 함께 발음 될 수 있습니다, 이후 1 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 부드럽게 제거 적혈구 집계는 튜브의 하단에 정착.</li>
	<li>차가운 초순 물 20 mL와 나머지 적혈구 lyse 부드럽게 여러 번 30 ~ 60 대 한 튜브를 반전 차가운 1.8% 염화 나트륨 해결책의 동일한 볼륨을 추가 하기 전에 적절 한 lysing 되도록 s.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분, 0 A/D 설정에 대 한 112 x g 에서 원심.</li>
	<li>이 펠 릿 나타나는 붉은 경우 적혈구 세포 단계를 반복 합니다. 혈 청 학적인 피펫으로와 신중 하 게 상쾌한 삭제 하 고 부드럽게 DPBS (5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl2, 1.9 m m CaCl2 와 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.3)의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 모든 resuspended 셀을 결합 하 고 얼음에.</li>
	<li>자동된 세포 분석기를 사용 하 여 셀 수를 수행 하 고는 hemocytometer에 의해 카운트를 확인. 필요한 경우, cytocentrifuge (1000 rpm, 5 분)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 PMNs 집중 하 고 셀의 총 수에서 호 중구의 수를 계산 하 여 호 중구의 비율을 결정.</li>
	<li>Strober 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 trypan 블루 제외 테스트를 수행 하 여는 호 중구의 생존 능력을 결정 12 성공적인 격리 95에서 100%는 생존을 산출 해야 한다 고 호 중구 95% 이상 이어야 한다.</li>
	<li>백분율 생존 및 호 중구 백분율 총 세포 수로 호 중구의 농도 결정 합니다. 성공적인 격리 6 x 106/mL을 1.5에서 호 중구의 농도 양보 한다.</li>
	<li>7.3으로 조정 하는 ph 5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl2, 1.9 m m CaCl2, 및 1% 소 혈 청 알 부 민을 포함 하는 DPBS와 호 중구 1 x 106/mL의 최종 농도에 희석.</li>
</ol>3. 라이브 호 중구의 형광 현미경
<ol><li>폴 리-L-리 신의 각 음에 호 중구 (1 x 106/mL)의 400 μ 장소 200 12-잘 문화 플레이트 코팅. 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 우물의 바닥에 준수 호 중구 수 있습니다.</li>
	<li>두 핵 산 염료 중 하나, 하나는 그대로 막 셀에 얼룩 및 투과성 멤브레인과 ( 재료의 표참조), 실 온에서 10 분에 대 한 셀에 얼룩 하나 1 μ M으로 핵 산을 라벨.</li>
	<li>100 μ g/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. 콜라이 O55와 호 중구 활성화. B5), 100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 긍정적인 통제, 또는 DPBS 180 분 37 ° c.에 대해 부정적인 컨트롤의 해당 볼륨</li>
	<li>이미지는 GFP를 사용 하 여 (여기: 470/22 nm, 방출: 525/50 nm) 및 텍사스 레드 채널 (여기: 585/29 nm, 방출: 628/32 nm) 다음 시간 지점에서 40 배 확대에 형광 현미경 검사 법에: 30, 90, 120, 및 180 분.</li>
</ol>4. NET 정량화 및 NET 구성 요소를 사용 하 여 면역 형광의 탐지
<ol><li>신중 하 게 12-잘 문화 접시의 우물에 18 m m 직경 폴 리-D-리 코팅 커버 전표를 놓습니다. 우물을 적절 하 게 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>씨앗 100 ~ 200 μ는 coverslips에 직접 neutrophils (1 x 106/mL) 절연 고 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 커버 전표를 준수 호 중구.</li>
	<li>3.3에 설명 된 대로 호 중구 활성화 합니다. 200 µΜ와 호 중구 pretreating 여 그물 형성 억제 Cl-amidine (15 분, 37 ° C) 리 외. 여 앞에서 설명한 활성화 이전 13 확인 적절 한 차량 제어 (DMSO)는 실험에 포함 됩니다.</li>
	<li>조심 스럽게 잘 집게와 커버 슬립을 제거. 4%의 2 ~ 3 방울을 얕은 웰 스를 만드는 테스트 튜브 스탠드 위에 파라핀 필름 시트를 레이어 PFA 각 잘10. 우물을 적절 하 게 분류 하 고 부드럽게 PFA 가득 우물에 거꾸로 커버 슬립을 하다. 20 분 동안 실내 온도에 고정 수를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>한 음에서 다음 이동 하 여 3 회에서 5 분 동안 DPBS 셀을 씻어.</li>
	<li>Immunolabelling 호 중구 활성화 및 고정 후 수행할 수 없습니다, 경우 커버 전표 덮개 미 끄 러 짐 얼굴-최대 흡 광도 종이의 조각에 배치 하 여 건조 공기를 되도록 허용 합니다. 커버 슬립 추가 분석까지 4 ° C에서 이라는 12 잘 문화 접시에 최대 1 주 얼굴-최대 저장할 수 있습니다. 워시 DPBS 4.4 다음 단계로 진행 하기 전에에서 설명 된 대로 동일한 기술을 사용 하 여 1 분 동안에 3 번 셀.</li>
	<li>세포를 permeabilize를 부드럽게 커버 슬립 거꾸로에 하다 NP-40는 기술을 사용 하 여 1 분 동안 4.4에서 설명 하는 1%의 드롭. DPBS 로커에 1 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>임의로 숫자를 할당 하는 각 샘플 하 고는 coverslips를 따라 다이아몬드 포인트 마커를 사용 하 여.</li>
	<li>준비 고 레이블 개별 접시 파라핀 영화 늘어서 (버퍼 차단) 필름에 5% 염소 혈 청의 100 ~ 200 μ를 배치 합니다. 블로킹 버퍼에는 coverslips를 거꾸로 누워. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 희석 (1:400 토끼 polyclonal 안티-citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 5% 염소 혈 청에서). 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>희석 이차 항 체는 5% 염소 혈 청에 fluorophore (1: 200)을 활용. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>Myeloperoxidase (MPO)의 동시 검출에 대 한 리 외. 에 설명 된 대로 수정된 더블 immunolabeling 프로토콜에 대 한 다음 단계에 따라 13
</li>
	<li>셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 각 커버 슬립 거꾸로에 누워 10% 토끼의 100 ~ 200 μ 부드러운 락 (하룻밤, 4 ° C, 어둠 속에서)에서 혈 청.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>셀 50 μ g/mL 결합형된 염소 안티 토끼 팹 어둠 속에서 로커에 실 온에서 2 h에 대 한 조각에 품 어.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 (1: 200 토끼 polyclonal 항 인간의 MPO 항 체)에 5% 염소 혈 청을 희석. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.</li>
	<li>5% 염소 혈 청에 fluorophore를 활용 된 이차 항 체를 희석 하 고 품 어 4.8에 설명 된 대로</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>간섭 제어 두 번째 면역 라벨 단계에서 어느 주 항 체를 가진 외피를 제외 하 여 준비 되어야 한다.</li>
	<li>300 DNA를 얼룩 nM의 4' 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) 실 온에서 어둠 속에서 5 분.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 1 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>유리 슬라이드에 antifade mountant의 드롭 (~ 50 μ)을 적용 합니다. 부드럽게 거꾸로 셀으로 coverslip를 탑재 하기 전에 초과 버퍼를 제거 하는 흡수 성 종이에 coverslip의 가장자리를 누릅니다. 장착 매체는 coverslip와 유리 슬라이드 사이 얇은 층을 형성 한다. 공기 방울을 제거, 매우 부드럽게 누릅니다는 coverslip에 좋은 집게와.</li>
	<li>4 ° c.에 어둠 속에서 하룻밤 치료 샘플 허용 장착 매체 집중 렌즈와 현미경 분석에 대 한 강화 해야 합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>5. 호 중구 Extracellular 함정 정량화
<ol><li>수집 하 고 분석 하는 실험 조건에 현미경 이미지 operator(s) 장 님.</li>
	<li>40 X 확대에 형광 현미경을 사용 하 여, 걸릴 10 이미지 임의로 해당 채널에서 실험에서 각 coverslip의 다른 지구에서. 노출 시간, 밝기 및 대비 각 채널의 이미지의 인수에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>사용 가능한 소프트웨어 ImageJ (NIH) 등을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. CfDNA, citH3, MPO (그림 3A, B)의 공동 지역화에 따라 그물을 식별 합니다. 계량 그물과 각 실험 조건에 대 한 10 임의의 필드에서 호 중구의 수 있습니다. 그물의 숫자 발표 비율로 표현 될 수 있습니다 (그물의 번호: 호 중구의 총 수) 각 실험 조건에 대 한.</li>
	<li>세포내 citH3 식에 치료 효과 평가 하려면 계산 세포내 citH3와 호 중구의 수와 각 채널 ( 에서 40 배 확대에 10 임의의 필드에서 세포내 citH3 없이 호 중구 수가 그림 3, 빨간색 화살표). 세포내 citH3 식 세포내 citH3 세포내 citH3 없이 호 중구의 수와 호 중구 수의 비로 나타낼 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

선물이 여기 생활 개 neutrophils 셀 permeant 염료와 셀 impermeant 염료를 사용 하 여에 핵 구조 및 cfDNA 출시를 프로토콜. 이 분석 결과의 주요 장점은 수 있다는 그물 형성의 실시간 탐지에 대 한 고해상도 현미경 셀 고정 없이 라이브 호 중구에 의해 따라서 관찰 하는 그물 형성 체 외에 는 간단 하 고 유용한 도구를 제공. 이 분석 결과 NET 구성 요소 검색에 대 한 항 체를 필요로 하지 않습니다, 때문에, 종의 항 체의 제한 된 가용성과 종에서 NETosis를 공부 하 고 이상적입니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 저자 개 호 중구에서 LPS 또는 PMA chromatin decondensation 받아야 시연 NETosis13이전 자극. 이 기술의 주요 단점은 특정 NETosis에 대 한는 것입니다. 셀 impermeant 염료는 또한 회 저 성 세포에서 핵 산 또는 lysed 호 중구에서 발표 하는 핵 산 얼룩, 때문에 cfDNA ...

호 중구는 짧은 granulocytes 병원 체 침입에 대 한 초기 방어에 대 한 책임. 먹어서, degranulation, 반응성 산소 종 (선생님)1세대에 의해 미생물을 제거 하는 호 중구, 감염의 사이트에 보충. 세균 또는 독, 있을 때 호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), extracellular chromatin의 구성된 장식 히스톤 elastase myeloperoxidase 같은 세분화 된 단백질 (MPO)2. 그물을가지고 있지만 필수적인 항균 속성, 패 혈 증 동안 불타 그물 형성 여러 장기 부전 및 죽음3,4, 으로 이어질 수 있습니다 제안 실험 및 임상 증거 증가 5 , 6.
그물 개에 유사한 병 태 생리 역할을 재생할 수 있습니다, 때문에 치료 개입을 방지 하거나 감소 그물 형성 정화 조 동물에 비 발한 치료 전략으로 봉사 할지도 모른다. 이러한 이유로, 평가 하 고 NETosis와 개에 있는 NET 구성 요소를 계량 하는 신뢰할 수 있는 기술에 대 한 필요가 있다. NET 구성 요소 셀 무료 DNA (cfDNA) 등 nucleosomes 개 호 중구 및 임상 개7,,89에서 플라즈마에 이전 평가 않았습니다. 형광 분석 실험을 사용 하 여, Goggs 및 Letendre 발견 정화 조 개 건강 개8보다 cfDNA의 더 높은 수준이 있다. 비록 이러한 기술은 매우 객관적이 고 정량적 인 NETosis의 표식으로 cfDNA 및 nucleosomes의 측정은 NETosing neutrophils 이외의 회 저 성 세포에서 파생 될 수 있기 때문에 일반적인입니다. 여기는 라이브 NETosing 호 중구의 행동 검사에 형광 현미경 검사 법을 활용 하는 기술에 설명 합니다. 우리는 또한 주관적으로 계량 그물과 MPO 등10개 호 중구에서 citH3 그들의 구성 요소를 더블-immunolabeling를 사용 하 여 수정 된 프로토콜을 선발.

<table><tbody><tr><td>Leuconostoc spp.의 덱스트란</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>분자량 450,000 &ndash; 650,000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>2가 양이온</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>2가 양이온 없음</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX 오렌지 형광 핵산 염색</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM in DMSO; stains in transmeable membranes</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>DMSO에서 1 mM; 손상되지 않은 막을 가진 세포의 얼룩</td></tr><tr><td>표면 증폭기 NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 코팅 커버 슬립</td><td>중성체</td><td>H-12-pdl</td><td>직경 12 mm</td></tr><tr><td>Anti-citrullinated histone H3 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>특이성: IgG (H+L)</td></tr><tr><td>항-골수페록시다제 항체</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-디아미디노-2-페닐린 (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

병원 균 침입에 대 한 응답, 중 성구 호 중구 extracellular 함정 (그물), 장식 된 히스톤과 항균 단백질 DNA의 세포 외 네트워크를 릴리스 합니다. 과도 한 네트워크 형성 (NETosis) 및 패 혈 증 동안 citH3 자료 여러 기관 역 기능 및 쥐와 인간 사망 관련 된 하지만 개 그 의미를 알 수 있습니다. 여기, 우리가 개 neutrophils 관찰과 NETosis의 정량화에 대 한 전체 혈액에서 분리 하는 기술을 설명 합니다. Dextran 침전에 의해 생성 된 백혈구 풍부한 플라즈마 상용 밀도 그라데이션 분리 미디어로 구분 되 고 granulocytes 수집 세포 수 및 생존 능력 테스트. 관찰 하기 위해 라이브 호 중구에서 실시간으로 NETosis, permeant 셀 및 셀 impermeant 형광 핵 산 얼룩 호 중구 활성화 lipopolysaccharide (LPS) 또는 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 추가 됩니다. 핵 형태학 및 NET 형성 변화는 시간이 지남에 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰 된다. 생체 외에서 NETosis 공동-colocalization의 세포 없이 DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) 및 citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 수정된 더블-immunolabelling 프로토콜을 사용 하 여 추가 특징 이다. 그물 그물 형성 및 citH3 식 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 객관적으로 계량을 하 고 citH3 양성 세포는 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 멀게 방식에서 계량. 이 기술은 체 외에서 의 용량 개 호 중구 NETosis을 평가 하는 특정 분석 결과 이다.

라이브 셀 이미징의이 프로토콜을 사용 하 여, 조사 핵 형태학, 원형질 막 무결성과 생활 호 중구에서 cfDNA의 존재를 확인할 수 있습니다. 손상 된 세포 막에 포함 된 셀에 셀 impermeant 핵 염색 얼룩 핵 산 레드. 다른 셀 permeant 염료, 라벨 그대로 플라즈마 멤브레인과 살아있는 세포에서 세포내 핵 산. 그들의 치료에 모든 그대로 neutrophils 녹색 표시 되 고 자극 (그림 2A) 후 0 ~ 30 분 특성 lobulated 핵을 전시 한다. PMA 처리 호 중구의 핵 약 60 분 lobulated 그들의 모습을 잃게 되 고 cfDNA (그림 2B)의 출시 될 때까지 decondense를 계속 시작 합니다. LPS, 느리고 더 생리 흥분 제 개 호 중구의 일반적으로 되지는지 않습니다 chromatin decondensation 또는 NET...

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

이 방법은 개 또는 다른 종의 호중구 세포 외 트랩 또는 NET 형성에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점에는 NET 형성의 실제 실시간 검출 및 온화한 과산화효소 및 시트룰린 화 히스톤 H3와 같은 NET 구성 요소의 식별이 포함됩니다. 건강한 개 기증자의 경정맥에서 10-20ml의 혈액을 채취하고 주사기에서 바늘을 제거한 후 과도한 공유를 피하기 위해 헤파린나트륨 튜브에 혈액을 분배하는 것으로 시작하십시오. 혈액과 항응고제가 적절하게 혼합되도록 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집고 샘플을 얼음에 놓기 전에 혈전과 적혈구 응집체가 있는지 확인합니다.항응고된 혈액을 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 PBS로 희석하고 8ml의 희석된 혈액을 여과된 3% Dextran 25ml가 들어 있는 50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 튜브를 실온에서 30분 동안 똑바로 세워 적혈구의 응집과 침전을 허용합니다. 그런 다음 14ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브에 5ml의 밀도 구배 매체 위에 5ml의 백혈구가 풍부한 혈장을 조심스럽게 레이어링합니다.밀도 구배 원심분리 후 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 중간 과립구 세포층을 50ml 원뿔형으로 옮기고 다형성 핵 세포와 함께 흡인된 모든 적혈구를 20ml의 차가운 초순수로 용해합니다. 튜브를 30-60초 동안 부드럽게 뒤집어 적절한 용해를 확인한 후 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 1.8% 염화나트륨 용액으로 세포를 세척합니다. 튜브를 몇 번 뒤집은 후 섭씨 4도에서 원심분리합니다.혈청학 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 100마이크로리터의 세포 배양 완충액에 부드럽게 재현탁합니다. trypan blue exclusion으로 생존 가능성을 계산하고 확인하십시오. 그런 다음 호중구를 세포 배양 완충액 농도 1밀리리터당 6개의 세포로 10배 희석합니다.오염 및 전단력으로 인해 체외 괴사 및 세포 용해가 발생할 수 있으므로 적절한 멸균 기술을 사용하고 분리 공정 전반에 걸쳐 호중구를 조심스럽게 취급하는 것이 필수적입니다. 형광 현미경 검사로 호중구를 이미지화하려면 폴리-L-라이신으로 코팅된 12웰 배양 플레이트의 각 웰에 200-400마이크로리터의 세포를 추가하여 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 호중구가 웰 바닥에 부착되면 실온에서 10분 동안 적절한 형광 핵산 염료로 세포에 라벨을 붙입니다.배양이 끝나면 LPS 밀리리터당 100마이크로그램, 양성 대조군으로 100나노몰 또는 음성 대조군으로 동등한 부피의 세포 배양 완충액으로 호중구를 활성화합니다. 그런 다음 표시된 시점에서 40배 배율로 형광 현미경으로 호중구 배양을 이미지화합니다. NET 정량화를 위해 18mm 직경의 poly-D-lysine 코팅된 커버슬립을 12웰 배양 플레이트의 개별 웰에 조심스럽게 배치하고 실험적 자극에 따라 웰에 라벨을 붙입니다.그런 다음 100-200마이크로리터의 분리된 호중구를 커버슬립에 직접 파종하여 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 호중구가 커버슬립에 부착되면 방금 설명한 것처럼 LPS, PMA 또는 DPBS로 각 웰의 호중구를 180분 동안 활성화합니다. 배양의 마지막 30분 동안 얕은 웰을 만들기 위해 시험관 스탠드 위에 파라핀 필름 시트를 겹겹이 쌓고 각 웰에 4% 파라포름알데히드 2-3방울을 추가합니다.웰에 실험적으로 적합한 라벨을 붙이고 가는 집게를 사용하여 각 플레이트 웰의 커버슬립을 거꾸로 채워진 적절한 해당 PFA 웰로 부드럽게 옮깁니다. 실온에서 20분 후, DPBS의 한 웰에서 다음 웰로 세포를 이동시켜 세척당 완충 식염수 2-3방울로 고정된 세포를 5분 동안 세 번 세척합니다. 세포를 투과화하려면 1% NP-40 한 방울에 커버 슬립을 1분 동안 부드럽게 거꾸로 놓고 로커에서 1분 완충 식염수를 3회 세척합니다.마지막 세척 후, 100-200마이크로리터의 5% 염소 세럼에 커버슬립을 거꾸로 놓고 새 플라스틱 파라핀 필름을 깐 개별 라벨이 부착된 페트리 접시에 넣어 섭씨 37도에서 흔들면서 1시간 동안 배양합니다. 차단 배양이 끝나면 방금 시연한 대로 흔들림과 함께 완충 식염수로 커버슬립을 세 번 세척합니다. 커버슬립을 50-100마이크로리터의 적절한 관심 항체에 담긴 개별 플라스틱 파라핀 필름이 늘어선 페트리 접시에 옮겨 흔들면서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.세척 후, 빛으로부터 보호된 섭씨 37도에서 1시간 동안 적절한 형광단 접합 2차 항체와 함께 커버슬립을 배양합니다. 2차 항체 배양이 끝나면 커버슬립을 완충 식염수로 어두운 곳에서 흔들어 3회 세척한 후 실온의 어두운 곳에서 5분 동안 DAPI로 핵산 염료 염색을 합니다. 어둠 속에서 흔들림과 함께 1분 완충 식염수를 3회 세척한 후, 샘플당 하나의 유리 슬라이드에 50마이크로리터의 퇴색 방지 마운팅 매체를 떨어뜨리고 건조된 각 커버슬립을 한 방울의 장착 매체에 거꾸로 조심스럽게 장착합니다.그런 다음 샘플을 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 밤새 경화시킵니다. 다음 날 아침, 각 커버슬립의 서로 다른 영역에서 40배 배율로 무작위로 10개의 이미지를 얻습니다. 치료에 관계없이 모든 온전한 호중구는 녹색으로 나타나야 하며 자극 후 0분에서 30분 사이에 특징적인 소엽 핵을 나타내야 합니다.약 90분이 지나면 PMA로 처리된 호중구의 핵은 소엽 모양을 잃기 시작하고 cell-free DNA가 방출될 때까지 계속 응축됩니다. 개 호중구의 느리고 생리학적 자극제인 LPS는 일반적으로 자극 후 90분이 지날 때까지 염색질 응축 또는 NETosis를 일으키지 않습니다. 120분쯤 지나면 LPS와 PMA로 활성화된 호중구가 cell-free DNA로 둘러싸여 있는 것을 볼 수 있습니다.LPS 자극 세포에 비해 더 많은 PMA 활성화 호중구는 세포 불침투성 염료로 염색된 것에서 알 수 있듯이 원형질막 무결성을 잃습니다. 자극되지 않은 호중구는 잠복기 동안 소엽 핵과 온전한 원형질막을 유지해야 합니다. 180분 동안 LPS에 의해 자극된 호중구는 근처의 호중구에 매우 근접한 눈에 띄지 않는 거미줄 모양의 NET 골격을 생성합니다.대조적으로, PMA 활성화 호중구는 면적이 눈에 띄게 큰 방대한 양의 NET을 생성합니다. 실제로, 필수 NET 구성 요소인 세포 내 시트룰린 히스톤 H3를 촉매하는 효소의 강력한 자극제인 PMA는 자극되지 않은 호중구와 LPS 자극 호중구에 비해 세포 내 시트룰린 히스톤 H3 발현 세포의 수를 더 많이 유도합니다. 이 분석을 수행하는 동안 작업자가 분석의 객관적인 평가를 유지하기 위해 실험 조건에 대한 맹검을 할 현미경 이미지를 획득하고 분석하는 것이 매우 중요합니다.이러한 절차의 절반은 ELISA 또는 유세포 분석과 같은 분석을 수행하여 세포 내 시트룰린 화 히스톤 H3를 추가로 정량화할 수 있습니다. 자극되지 않은 호중구 또는 펩티딜 아르기닌 억제제인 크롤라이드 아미딘으로 처리된 호중구로 구성된 음성 대조군을 포함하는 것을 잊지 마십시오. 또한 비특이적 결합 및 간섭을 최소화하기 위해 1차 및 2차 항체의 다양한 희석을 테스트하는 것이 좋습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

우리는 열 유도 항원 회수 및 이중 면역 표지 프로토콜을 사용하여 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 고양이 심원 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 식별하는 방법을 설명합니다.

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

배우세요 개 호중구에서 형광 현미경을 이용한 중성구 세포외 함정(NET) 형성의 실시간 관찰 및 정량화 방법을. 면역 형광을 통해 citH3 발현을 분석하여 면역 반응 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

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