Name: 절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 학습하세요 인간 치포 줄기 세포의 일시적 유전자 조작 방법을 통해 재생의학에서 안전한 줄기세포 치료 개선 방안을 탐색하세요. 이 기법은 microRNA 도입으로 유전체 통합 위험 없이 세포 특성을 향상시킵니다.

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이 작품의 젖은 기초 (2016-11)로 스톡 대학 의료 센터 (889018)와 FORUN 프로그램에 의해 지원 되었다. 또한, 오후 R.D. BMBF (VIP + 00240)에 의해 지원 됩니다.

HDFSCs 부의 구강 및 악 안 면 성형 수술으로 스톡 대학 의료 센터에서 제공 하는 추출 된 사랑니의 치과 여 포에서 격리 됩니다. 동 및 서 면된 승인 모든 환자에서 얻은 했다. 이 연구는로 스톡 대학 (권한 No. 2017-0158)의 로컬 윤리 위원회에 의해 허가 했다.
1입니다. hDFSCs의 격리
참고: 세균 오염을 방지 하기 위해, 사랑니 해야 하지 추출 하기 전에 발생 될
<ol><li>
필요한 솔루션의 준비
	<ol>
<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비 / 페니실린-스-글루타민 (P-S-G) 솔루션: P-S-G 솔루션의 5 mL PBS의 495 mL 혼합. 4 ° c.에 50 mL의 aliquots를 저장</li>
		<li>HDFSC 문화 매체를 준비: 혼합 기저 매체의 445 mL 5 mL 항생제 에이전트와 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL와 함께. 4 ° c.에 게</li>
		<li>콜라 종류 준비 솔루션 (30 mg/mL)을 재고: 콜라 유형 나 기저 매체의 10 mL에 1% 항생제 에이전트와 보충의 300 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 콜라의 500 µ L의 스토어 aliquots 유형 I-20 ° c.에 재고 솔루션</li>
		<li>Dispase II 재고 솔루션 (40 mg/mL) 준비: 1% 항생제 에이전트 보충 기저 매체의 10 mL에 Dispase II의 40 mg을 희석. 적극적으로 솔루션을 혼합. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. -20 ° c.에 Dispase II 재고 솔루션의 500 µ L의 aliquots를 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
외과 절차
	<ol>
<li>충분 한 양의 주사 (최대: 2 mL) 로컬 마 취의.</li>
		<li>만들고 3 면 mucoperiosteal 플랩 발생 합니다. 언어 플랩 높이 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>Periosteal 엘리베이터가 언어 측면을 보호 합니다.</li>
		<li>부드럽게 밀 볼 및 원심 뼈와 함께 라운드 하드 금속 버.</li>
		<li>Periosteal 엘리베이터와 뿌리의 조직을 풉니다. 조심 스럽게 후부 (제 3-모 랄) 집게와 완전 한 치아 (세균)와 왕관을 철수 하 여 여 포 (및 뿌리) 제거.</li>
		<li>Debride 하 고 철저 하 게 NaCl 용액으로 소켓을 관개.</li>
		<li>Mucoperiosteal 플랩을 vicryl 봉합 ( 재료의 표참조) 바꿉니다.</li>
		<li>구강에서 치아 뿌리를 제거 하 고 PBS/P-S-G 솔루션 50 mL의 약 수에 그들을 배치. 참고: 샘플 추가 처리까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
치아 뿌리의 효소 소화
	<ol>
<li>미리 따뜻한 hDFSC 문화 매체와 실내 온도 (RT) PBS/P-S-G 솔루션.</li>
		<li>나 및 Dispase II 재고 솔루션 각 콜라 종류의 한 약 수를 녹여. 각 콜라의 500 µ L 타입 I과 기저 중간 포함 1% 항생제 에이전트의 4 ml Dispase II 재고 솔루션을 추가 하 여 3 mg/mL 콜라 종류의 소화 솔루션 어 4 mg/mL Dispase II 준비.</li>
		<li>멸 균 페 트리 접시에 추출 된 뿌리를 놓고 추출 된 조직 씻어 PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>약 1 m m x 1 m m PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 포함 하는 페 트리 접시 내 살 균 메스의 조각에 추출 된 뿌리를 말하다.</li>
		<li>50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 페 트리 접시에서 다진된 조직 및 PBS/P-S-G 솔루션을 전송. PBS/P-S-G 솔루션의 10 mL를 페 트리 접시를 세척 하 고 동일한 관으로 솔루션을 전송.</li>
		<li>원뿔 원심 분리기 튜브 RT에서 353 x g 에서 10 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>수송과 조직에 소화 솔루션의 5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 솔루션 및 조직. 떨고 인큐베이터에 2 h 37 ° C, 5% CO2 혼합물을 품 어.</li>
		<li>원심 분리기에서 실시간 삭제는 상쾌한 10 분 353 x g 세포/조직 정지를 소화 하 고 다시 hDFSC 문화 매체의 6 mL에서 얻은 펠 릿을 일시 중단.</li>
		<li>25 cm2 종자 세포 현 탁 액 문화 플라스 크 셀 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 20% O2에 셀을 품 어. 참고: 조직을 완전히 소화 되지 않습니다 경우 나머지 조직 셀 뿐만 아니라 문화 플라스 크에 전송.</li>
		<li>중간 신중 하 게 24 시간 후 바꿀 셀 시드. 나중에 매체 confluency까지 3 일 마다 변경 합니다. 참고: HDFSCs는 플라스틱 부착 24 h 셀 시드 후 고 단순히 매체를 변경 하 여 비 부착 한 세포 및 혈액 구성 요소에서 분리 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 수확
	<ol>
<li>미리 따뜻하게 hDFSC 문화 매체, PBS/P-S-G 솔루션 및 실시간 트립 신/Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션</li>
		<li>문화 플라스 크에서 상쾌한 삭제 하 고 PBS/P-S-G 솔루션의 5 mL confluent 셀을 씻어.</li>
		<li>문화 플라스 크를 1 mL의 트립 신/EDTA 솔루션을 추가 하 고 37 ° c.에 3 분 동안 품 어 문화 플라스 크를 hDFSC 문화 매체의 3 mL를 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다.</li>
		<li>15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실시간 삭제는 상쾌한에 353 x g 에서 10 분 동안 현 탁 액을 원심 hDFSC 문화 매체의 적절 한 금액에 펠 릿을 다시 일시 중단.</li>
		<li>셀: 부드럽게 Trypan 블루 솔루션의 10 µ L 10 µ L 세포 현 탁 액의 혼합. 세 실로 10 µ L을 적용 하 고 hDFSC 셀 금액 계산.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. hDFSCs의 특성
<ol><li>
Immunophenotyping
	<ol>
<li>셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비<ol>
<li>필요한 솔루션의 준비<ol>
<li>PBS/EDTA (2mm) 준비: 996 mL PBS의 EDTA (0.5 M)의 4 mL와 혼합.</li>
				<li>얼룩 버퍼 준비: BSA의 5 g 995 mL PBS/EDTA (2 mM)의 혼합. 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 솔루션을 필터링 하 고 사용까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
				<li>준비 paraformaldehyde (PFA) 재고 솔루션 (4%): 4 g PFA PBS의 100 ml에서를 희석 하 고 열 80 ° c 솔루션 솔루션을 혼합 하 고 pH 값 7.3 조정. 약 수 사용까지 해당 금액 (1.5 mL)에-20 ° C에서 저장소 PFA 솔루션을 얻을. 주의: PFA 연기 독성 때문에, 통풍이 증기 두건에서 PFA 솔루션을 준비 합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>셀 (1.4)를 수확, 후 1.5 mL microcentrifuge 튜브 14 5 x 104 의 세포 샘플을 전송 합니다. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한. 참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 셀 및 얼음에 시 약을 계속.</li>
			<li>다시 셀 얼룩 버퍼 (4 ° C)의 특정 금액을 일시 중단 하 고 FcR 시 (4 ° C)을 차단 하는 표 1에 표시 된 대로 추가 합니다.</li>
			<li>표 1에 표시 된 대로 각 샘플의 안쪽에 다음 항 체를 추가: Allophycocyanin (APC) 마우스 안티 인간 CD29; APC 마우스 IgG1 κ isotype 제어; Peridinin-엽록소 단백질 (PerCP)-Cyanine5.5 마우스 안티 인간 CD44; PerCP-Cyanine5.5 마우스 IgG2b κ isotype 제어; V500 마우스 안티 인간 CD45; V500 마우스 IgG1 κ isotype 제어; Phycoerythrin (PE) 마우스 안티 인간 CD73; PE 마우스 IgG1 κ isotype 제어; PerCP-Cyanine5.5 마우스 안티 인간 CD90; PerCP-Cyanine5.5 마우스 IgG1 κ isotype 제어; 반대로 인간의 CD105 마우스: 알 렉 사 Fluor (AF) 488; IgG1 부정적인 제어 마우스: AF488; PE-Cyanine7 마우스 안티 인간 CD117; PE-Cyanine7 마우스 IgG1, κ isotype 제어 합니다. 각 샘플에 항 체를 추가한 후 항 체 아래로 회전 하 고 부드럽게 혼합. 4 ° c.에서 10 분에 대 한 솔루션을 품 어</li>
			<li>1 mL의 PBS (4 ° C)를 추가 하 고 샘플을 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 폐기는 상쾌한.</li>
			<li>다시 100 µ L의 PBS (4 ° C)에 있는 셀을 일시 중단 하 고 PFA (4%)의 33 µ L를 추가 합니다. 솔루션을 믹스와 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>셀의 흐름 cytometric 측정 참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 측정까지 얼음에 셀을 계속.<ol>
<li>표현의 표면 항 원 검사, 튜브 흐름 cytometric 측정을 위한 적합 한 샘플을 전송.</li>
			<li>적어도 2 × 104 이벤트 흐름 cytometer를 사용 하 여 측정 합니다. 그림2에서와 같이 분석.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HDFSCs multipotent 차별화 가능성
	<ol>
<li>상업적으로 이용 가능한 인간 중간 엽 줄기 세포 기능 식별 키트를 사용 하 여 adipogenic, osteogenic 및 hDFSCs의 chondrogenic 감 별 법 잠재력을 확인 하. 적용 지방산 의무적인 단백질 4 (FABP4)의 얼룩에 대 한 당나귀 안티 염소 AF488 이차 항 체와 aggrecan osteocalcin의 얼룩에 대 한 당나귀 반대로 마우스 AF488 이차 항 체에 뿐만 아니라. 핵의 얼룩, 설치 매체와 함께 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 사용 합니다. 참고: 현미경 분석에 대 한 부정적인 컨트롤로 기본 항 체 없이 샘플을 준비 합니다.</li>
		<li>레이저 공초점 현미경을 스캐닝 하 여 단백질의 표현 분석. 현미경 설정: 기름 침수;와 40 x 목표 (AF488)에 대 한 여기 레이저 488 nm 및 405 nm (DAPI)에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. hDFSCs의 transfection
<ol><li>셀 (1.4) 수확 후 24-잘 셀 문화 접시 transfection 이전 24 시간에 hDFSCs 씨. 참고: 잘 당 약 4 x 104 셀은 셀 밀도 시작. 세포는 transfection 요일에 ~ 80% 합류가 되어야만 합니다. 참고: 종자 하나 추가 셀 샘플 제어 흐름 cytometric 분석에 대 한.</li>
	<li>Transfection 복합물의 준비 참고: 오염을 방지 하기 위해 RNases에서, 직접 transfection 단지 RNase 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 준비 하기 전에 작업 영역을 청소. RNase 소재 및 솔루션을 사용 합니다. 참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다.<ol>
<li>준비 하는 미르 재고 솔루션 (50 µ M): 다시 Cy3 표시 전조 미르 (5 nmol) 100 µ L nuclease 무료 물에서 중단. 약 수를 취득 해당 금액 (5 µ L) 미르 재고 솔루션 저장소-20 ° C에서 어둠 속에서 사용까지.</li>
		<li>미르 (50 µ M 미르 재고 솔루션의 0.8 µ L) 감소 된 혈 청 매체의 66.7 µ L에서의 40 pmol 희석. 부드럽게 솔루션 혼합</li>
		<li>감소 된 혈 청 매체의 66.7 µ L에서 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 0.67 µ L를 희석. 솔루션을 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어</li>
		<li>부 화, 후 미리 희석된 미르를 미리 희석된 transfection 시 약을 추가 합니다. 솔루션을 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>직접 셀에 문화 매체에 dropwise 준비 transfection 단지를 추가 합니다. 24 잘 셀 문화 접시와 락으로 부드럽게 혼합.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2, 그리고 24 h에 대 한 20% O2 에 셀을 품 어.</li>
</ol>4입니다. Transfection 분석
참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다.
<ol><li>
세포 transfection 후 수확 참고: 모든 셀 솔루션 같은 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 하나의 샘플을 수집 합니다.<ol>
<li>transfection, 후 24 h 각각 원심 분리기 튜브 샘플의 상쾌한을 수집 합니다.</li>
		<li>셀 1 mL의 PBS로 세척, 각각 원심 분리기 관으로 PBS를 전송 및 추가 500 µ L 트립 신/EDTA (RT) 셀에. 37 ° c.에 3 분에 대 한 솔루션을 품 어</li>
		<li>문화 매체 (RT)의 1 mL을 추가 하 여 셀을 각각 원심 분리기 관으로 전송 솔루션 trypsinization를 중지 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 세포 참고: 이 시간에서 달리 명시 하지 않는 한 셀 및 얼음에 시 약 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀의 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비
	<ol>
<li>폐기는 상쾌한. 다시 셀 얼룩 버퍼 (4 ° C) 및 전송 셀 솔루션 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 100 µ L 일시 중단 합니다.</li>
		<li>라이브와 죽은 세포를 구별 하기 위해 샘플에 아민 반응성 염료의 0.5 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 솔루션 및 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
		<li>셀을 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 1 mL의 PBS (4 ° C)를 추가 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>다시 100 µ L의 PBS (4 ° C)에 있는 셀을 일시 중단 하 고 PFA (4%)의 33 µ L를 추가 합니다. 솔루션을 믹스와 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀의 흐름 cytometric 측정 참고: 오히려 회색된 룸에서 다음 작업을 수행 합니다. 측정까지 얼음에 셀을 계속.<ol>
<li>흐름 cytometric 측정을 위한 적합 한 튜브 샘플을 전송 합니다.</li>
		<li>세포 생존 능력 및 미르 통풍 관 효율 교류 cytometer를 사용 하 여 검사 합니다. 적어도 2 × 104 이벤트를 측정 합니다. 그림 4에 묘사 된 제어 전략을 사용 합니다. 참고: 부정적인 통제로 untransfected 세포를 사용 하 여 Cy3 긍정적인 셀 게이팅 정렬 하 고 계산 transfection에 기인한 세포 죽음.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

성인 줄기 세포는 현재 여러 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 집중에 있습니다. 특히, 뼈 골 수 (BM)-줄기 세포, 조 혈 줄기 세포 (HSCs)를 포함 하 여 파생 된 MSCs, 집중 임상 조사47그리고. 그러나, BM 수확 기부 사이트에 통증을 일으키는 침략 절차 이며48부작용 이어질 수 있습니다. 최근, 출생 후 치과 조직 줄기 세포에 대 한 소스를 쉽게 접근할 수 있는 고로 떠오르고 있다. 이 치과 줄기 세포는 모든 MSC 특성에 맞게 표시 되었고 BM 파생 된 줄기 세포49높은 확산 능력을 보여주었다. 여기, 우리는 추출, 특성화 및 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 상세한 프로토콜을 제시.
이 조직 일반적으로 추출 하 고 의료 폐기물19로 처분 설명된 격리 절차의 영향 을된 지혜의 이빨, 인간의 치과...

인간의 치과 여 포 개발 치아1,2를 둘러싼 느슨한 ectomesenchymally 파생 결합 조직 이다. Osteoclastogenesis 및 골 치아 분화 과정에 대 한 조정 하는 기능 옆에 있는이 조직 특히 periodontium3,,45의 개발에 대 한 줄기와 조상 세포를 항만. 따라서, 치과 여 포는 인간 성인 줄기 세포6,7을 수확 하 대체 소스로 간주 됩니다.
여러 연구 결과 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs) osteoblasts, 인 대 섬유 아 세포, cementoblasts8,,910 을 포함 한 치 주 혈통으로 차별화 할 수 있다 설명 했다 . 또한, 이러한 세포 mesenchymal stromal 세포 (MSCs)의 자기 갱신 용량, 플라스틱 준수, 표현의 특정 표면 마커를 포함 하 여 모든 특성에 맞게 표시 했다 (예:, CD73, CD90, CD105)으로 osteogenic 뿐만 adipogenic 및 chondrogenic 분화 잠재적인11,,1213. 다른 연구는 또한 hDFSCs2,,1415,16,,1718의 신경 감 별 법 잠재력을 계시 했다.
그들의 유망한 속성 및 쉬운 접근, hDFSCs 최근 조직 공학19,,2021관련 되었다. 첫 번째 연구는 치 주 뼈 생성에 DFSCs의 잠재력에 집중 하 고 치아 뿌리19,22,23,,2425,26, 27,,2829,30. HDFSCs의 neurogenic 기능의 지식, 신경 퇴행 성 질환에 대 한 잠재적인 치료로 그들의 응용 프로그램은 이후 조사31,,3233. HDFSCs 또한에 중요성을 얻고 있다 고 다른 조직 (예: 각 막 상피)34,35의 재생. HDFSC의 치료 잠재력은 그들의 paracrine 활동에 뿐만 아니라 그들의 직접적인 감 별 법 잠재력에만 근거 하지 않는다. 최근, hDFSCs 보였다 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 인슐린과 같은 성장 인자 (IGF), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) hepatocyte 성장 등 생리 활성 요인의 분 비 인수 (HGF), 신생, immunomodulation, 개장 하는 엑스트라 세포 매트릭스 및 회복 과정36에 대 한 중요 한 역할입니다.
그러나, 줄기 세포 치료의 광범위 한 임상 번역은 여전히 대규모 초기 세포 죽음 및 낮은 도움이 줄기 세포 효과37,38등 여러 문제에 의해 손상 된다. 유전 공학 이러한 과제를 해결 하기 위해 유망 전략을 제공 하 고 따라서 매우 줄기 세포38,,3940의 치료 효능을 강화할 수 있다. 변이 세포 조작, microRNAs (미르)는 적합 한 후보자, 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합41,42, 의 위험 없이 줄기 세포의 행동으로 43. 날짜, 여러 가지 유익한 미르 확인 된 줄기 세포 증식, 생존, 유도, paracrine 활동 뿐만 아니라 여러 계보44로 그들의 차별화 홍보. 예를 들어, 미르 133a 설계 MSCs 수정 되지 않은 MSCs45에 비해 향상 된 심장 기능의 결과로 infarcted 쥐 마음에 증가 생존 및 engraftment를 보여주었다. 마찬가지로, 미르-146a overexpressing MSCs 분 비 허 혈 성 조직46에서 향상 된 치료 효율 주도 차례에 VEGF의 더 높은 금액을 표시 했다.
이 원고는 선택적 추출 및 hDFSCs의 유전 공학에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 목적을 위해 우리 인간의 치과 여 포의 수확과 효소 소화 뿐만 아니라 hDFSCs의 후속 격리를 설명합니다. 고립 된 세포의 성격을 나타내기 위하여 MSC 속성의 확인에 대 한 중요 한 지침13세포 치료 대 한 국제 사회의 지침에 따라 포함 되었습니다. 또한, 우리는 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략과 transfection 효율 및 세포 독성 평가 적용 하 여 미르 수정 hDFSCs의 생성에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>마우스 anti human CD105 항체: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Clone SN6, monoclonal</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 negative control 항체: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD29 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>559883</td><td>Clone MAR4, monoclonal</td></tr><tr><td>APC Mouse IgG1, &kappa; 동형 제어 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>Clone MOPC-21, monoclonal</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD73 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Clone AD2, monoclonal</td></tr><tr><td>PE Mouse IgG1, &kappa; 동형 제어 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>클론 MOPC-21, 단클론</td></tr><tr><td>PE-Cy7 마우스 Anti-Human CD117 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>339217</td><td>클론 104D2, 단클론</td></tr><tr><td>PE-Cy7 마우스 IgG1, &kappa; 이소타입 제어 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>557872</td><td>클론 MOPC-21, 단클론</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 마우스 Anti-Human CD44 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>클론 G44-26, 단클론</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 마우스 IgG2b, &kappa; 이소타입 제어 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone 27-35, 단클론</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 마우스 Anti-Human CD90&nbsp; 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>Clone 5E10, 단클론</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 마우스 IgG1, &kappa; 동종 제어 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>55095</td><td>클론 MOPC-21, 단일 클론</td></tr><tr><td>V500 마우스 Anti-Human CD45 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>560777</td><td>클론 HI30, 단일 클론</td></tr><tr><td>V500 마우스 IgG1, &kappa; 이소타입 제어 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>560787</td><td>Clone X40, monoclonal</td></tr><tr><td>FcR 차단 시약, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0.5M, pH 8.0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>SCGPT05RE 0.22 &micro; m, 방사선 멸균, 폴리에테르설폰</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>머크 밀리포어</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>인간 중간엽 줄기세포 기능 식별 키트</td><td>R& D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>RNase 오염 제거 솔루션; RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션</td><td>: Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 표지 전구체 miR; Cy3 염료 표지 Pre-miR 음성 대조군 #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>AM17120 5 nmol</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA 전구체 음성 대조군 #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>AM17110 5 nmol</td></tr><tr><td>양이온성 지질 기반 형질주입 시약; Lipofectamine 2000 형질주입 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>환원 혈청 배지; Opti-MEM I 감소 혈청 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 항 염소 IgG (H + L) 교차 흡착 2 차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>다클론</td></tr><tr><td>당나귀 항 마우스 IgG (H + L) 고도의 교차 흡착 2 차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>다클론</td></tr><tr><td>장착 매체; DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>조직학 장착 매체</td>를 사용한 Fluoroshield</tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 소프트웨어 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN2011 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 용액(0.05%/ 0.02%)</td> PBS의 <td>바이오크롬</td><td>L2143</td><td>, w/o: Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>아민 반응성 염료; 라이브/데드&트레이드; 고정성 근적외선 데드 셀 염색 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH: 7.4; w/o: Ca 및 Mg</td></tr><tr><td>P-S-G (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>기초 배지; Dulbecco's Modified Eagle 배지/영양 혼합물 F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>항생제, ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>필터, Sterifix 주사기 필터 0.2 &micro; m</td><td>브라운</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,002</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크, 25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>동결 매체, Biofreeze</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>377267</td><td>1.8 mL</td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr><tr><td>계수 챔버</td><td>Paul Marienfeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>국소 마취제, 자일로시틴(리도카인 염산염) 2%와 에피네프린(아드레날린) 0.001%</td><td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl 용액</td><td>브라운</td><td></td><td>0.9 %</td></tr><tr><td>Vicryl 포화, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

날짜 하려면, 서로 다른 발달 단계에서 여러 줄기 세포 유형 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 초점에 있습니다. 그러나, 초기 대규모 세포 죽음 및 낮은 치료 효과 등의 특정 양상 그들의 광범위 한 임상 번역 손상. 유전 공학 이식 전에 줄기 세포의 줄기 세포 치료 효과 최적화 하는 유망한 방법으로 등장. 그러나, 안전 하 고 효율적인 유전자 전달 시스템은 여전히 부족 합니다. 따라서, 적당 한 방법의 개발 줄기 세포 기반 요법에서 현재의 과제를 해결 하는 접근 방식을 제공할 수 있습니다.
현재 프로토콜은 그들의 비 바이러스 성 유전자 조작 뿐만 아니라 추출 및 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs)의 특성을 설명합니다. 출생 후 치과 여 포는 높은 확산 잠재력을 보유 하는 성인 multipotent 줄기 세포를 수확 한 유망 하 고 쉽게 접근할 수 있는 소스로 발표 했다. 설명된 격리 절차 영향 을된 지혜의 이빨에서 hDFSCs 수확 간단 하 고 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 또한이 프로토콜 구성 고립 된 세포의 줄기 세포 특성을 정의 하는 방법. HDFSCs의 유전 공학에 대 한 최적화 된 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략 세포 독성 효과 유발 하지 않고 사용 하면 매우 효율적인 예측에 관한 소개를 제공 됩니다. 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합의 위험 없이 줄기 세포의 행동 MicroRNAs 과도 셀 조작에 대 한 적합 한 후보자는. 따라서,이 프로토콜 최적화 그들의 치료 효능에 대 한 중요 한 될 수 있습니다 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 안전 하 고 효율적인 절차를 나타냅니다.

여기, 우리 인간의 치과 여 포 조직에서 hDFSCs을 수확 하는 상세한 격리 명령을 제시. 일상적인 수술 동안 치과 여 포의 쉬운 접근으로 성체 줄기 세포의 추출에 대 한 유망한 근원 이다.
격리 된 hDFSCs MSCs13의 정의 대 한 설명 하는 모든 특성을 보였다. 사실, 셀 플라스틱 부착 했다 아래 문화 상태를 설명 하 고 표시 구와 같은 형태 (그림 1). 흐름 cytometric 분석 hDFSCs 등 CD29, CD44, CD73, CD90 CD105, CD45 CD117 했다 (그림 2)에 결 석 하는 동안 특정 표면 항 원의 패널을 표현 밝혔다. 또한, adipogenic, osteogenic 및 특...

이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

이 방법은 인간 치과 여포 줄기 세포가 그들의 치료 특성을 향상하기 위하여 유전으로 설계될 수 있던 것과 같은 재생 의학의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 줄기 세포가 안정적인 게놈 통합의 위험없이 microRNA 도입에 의해 변형 될 수 있다는 것입니다. 실온, 인간 치과 여포 줄기 세포 또는 hDFSC 배양 배지 및 PBSPSG 용액으로 미리 온난화하여 두 여포의 효소 소화 절차를 시작합니다.콜라게나아제 타입 I및 디스파세 II 주식 솔루션의 각 알리쿼트 1개를 해동하십시오. 콜라게나아제 타입 I 스톡 솔루션 500마이크로리터와 디스파제 II 스톡 솔루션 500개소리터를 1%항생제제를 함유한 기저형 4밀리리터에 첨가하여 소화용액을 준비한다. 인간 치과 여포 줄기 세포 격리 세척 버퍼 및 사용 된 배양 매체 동안 사이트 오염을 피하기 위해 항생제를 포함 해야합니다.추출된 치아 여포를 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 추출 된 조직을 세척하는 PBSPSG 용액의 10 밀리리터를 추가합니다. 용액을 흡기하고 폐기하고 신선한 PBSPSG 용액을 추가하여 세척을 반복합니다.멸균 메스를 사용하여 추출된 여포를 조각으로 약 1 x 1 밀리미터로 다진다. 페트리 접시에서 다진 조직 및 PBSPSG 용액을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 페트리 접시를 PBSPSG 용액 10밀리리터로 세척하고, 용액을 동일한 튜브로 옮킨다. 원심 분리는 10 분 동안 실온에서 353 x g에서 원심 튜브를 분리합니다.팔레트 조직에 5 밀리리터의 소화 용액을 넣고 용액과 조직을 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 섭씨 37도, 흔들리는 인큐베이터에 5%CO2로 2시간 동안 배양합니다. 2 시간 후, 원심 분리는 실온에서 10 분 동안 353 g에서 소화 된 세포 및 조직 현탁액을 분리합니다. 상체를 폐기하고 HDFSC 배양 배지의 6 밀리리터에서 획득한 팔레트를 다시 중단합니다.25 평방 센티미터 세포 배양 플라스크에서 세포 현탁액을 시드하고 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. HDFSC의 세포 수확 및 특성화 후 텍스트 프로토콜에 기재된 바와 같이, 종자 hDFSC는 24웰 세포 배양 판에서 한다. 섭씨 37도, CO2 5%, 산소 20%로 24시간 동안 배양합니다.다음 날에는 66.7 마이크로리터의 미생물RNA 40피코몰을 희석시키고 용액을 소용돌이시다. 0.67 마이크로리터의 양이온지질계, 경질 시약은 66.7 마이크로리터의 감소된 혈청 배지, 용액을 소용돌이치며 실온에서 5분간 배양한다. 5분 후 미리 희석된 microRNA를 미리 희석된 형질 전환 시약에 넣고, 용액을 혼합하고, 실온에서 15분 동안 배양한다.다음으로, 준비된 경피 복잡성을 세포상배양배지에 직접 드롭와이즈로 추가한다. 앞뒤로 24 잘 세포 배양 판을 흔들어 부드럽게 섞는다. 24 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오.24 시간 경질 후, 각각15 밀리리터 원심 분리 튜브에서 샘플의 상퍼를 수집합니다. PBS의 1 밀리리터로 세포를 세척하고 PBS를 각각의 원심분리기 튜브로 이송합니다. 500 마이크로리터의 드립과 EDTA를 세포에 추가하고 24개의 웰 플레이트를 섭씨 37도에서 3분간 배양합니다.세포배양 배지의 1 밀리리터를 추가하고 용액을 각각의 원심분리기 튜브로 이송하여 트립시화를 중단한다. 세포를 300 x g및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 여기서부터 는 달리 명시되지 않는 한 세포와 시약을 얼음에 보관하십시오.상체를 버리고, 염색 버퍼의 100 마이크로리터에서 세포를 재일시 중단하고, 세포 용액을 1.5 밀리리터 미세원심분리기로 옮기다. 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 각 샘플에 amine 반응성 염료의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 용액을 부드럽게 섞고 섭씨 4도에서 10분간 배양합니다.세포에 PBS 1 밀리리터를 추가하고, 10분 동안 300g및 섭씨 4도에서 원심분리기를 슈퍼나티를 버리고 PBS의 100 마이크로리터에서 세포를 재연하고, 파라포름데히드의 33마이크로리터를 추가하고, 용액을 혼합하여, 시토메트릭 측정까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 시료를 유동 세포 측정에 적합한 튜브로 옮기고 텍스트 프로토콜에 설명된 게이팅 전략을 사용하여 유동 세포측정을 수행한다. 고립 된 인간 치과 여포 줄기 세포는 중간 엽 기질 세포의 정의에 대해 설명 된 모든 특성을 보여주었으며, 세포는 플라스틱 부착되어 표준 배양 조건하에서 형태와 같은 유리 섬유를 표시했다.유동 세포 측정 분석은 hDFSCs가 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105를 포함한 특정 표면 항원 패널을 발현한 것으로 나타났습니다. CD45 및 CD117이 없는 동안. 특이적 생체외 배양 조건 하에서 세포의 비증, 골다겐성 및 연골 분화 잠재력은 면역스테인링, 지방산 결합 단백질: Osteocalcin 및 Aggrecan에 대한 것으로 확인되었다.세포 독성 및 Cy3 라벨 microRNA 섭취 효율 24 시간 트랜스페션 후, 실행 가능한 세포의 100%에서 microRNA 섭취를 확인 의 정량화에 사용 된 게이팅 전략. 유사하게 감염된 시료와 비감염된 시료에 있는 죽은 세포의 비교양은 microRNA가 세포독성 효력 없이 능원하게 소개된다는 것을 표시합니다. 이 절차에 따라 Cytolab 가소성과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 과분과 같은 다른 방법을 수행 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

방법 중 하나를 사용하여 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 (hDPSCs)의 분리 및 특성...

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

지속적으로 성장 마우스 앞니는 치아 상피 줄기 세포 (DESCs)에서 치아 조직의 재생을 연구하기위한 모델을 제공합니다. 일관되고 안정적으로 앞니에서 이러한 세포를 획득하고 체외에서 그 확장을위한 강력한 시스템은 여기에보고됩니다.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

우리는 분리, 표현형 특성화 및 쥐의 잇몸에서 면역 세포의 기능 분석을위한 기술을 설립했다.

절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

성체 줄기세포 생물학을 연구하기 위한 이상적인 모델은 쥐의 모낭입니다. 여기에서는 모낭, 줄기세포 및 표피 각질세포의 다양한 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시하며, 쥐 등쪽 피부의 효소 분해와 FACS 분석을 사용합니다.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

여기 우리는 프리온 단백질 표정 신경 분화 과정을 평가 하기 위해 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 분리 및 전파에 대 한 프로토콜을 제시.

절연, 전파, 그리고 인간의 치과 펄프의 줄기 세포의 신경 분화 동안 프리온 단백질 표정

치과 여포에는 상피 인구와 중간 엽 세포가 포함되어 있습니다. 상피 인구는 뚜렷한 배양 배지를 제공함으로써 이질적인 치과 여포 세포 집단으로부터 선택되었다. 상피 세포는 혈청이없는 배지에서 생존하고 식민지를 형성했다.

인간 치과 여포에서 상피 세포의 격리

우리는 인간의 치아에서 시작하여 상피 오가노이드 문화를 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 오가노이드는 견고하게 확장 가능하며 아멜로아세포 분화 능력을 포함하여 치아의 상피 줄기 세포를 재생산합니다. 독특한 오가노이드 모델은 치아 재생 접근법에 대한 관점으로 인간 치과 (줄기 세포) 생물학을 연구 할 수있는 유망한 도구를 제공합니다.

기계론적 연구 및 재생 요법을 향한 강력한 도구로 인간의 치아에서 오가노이드를 확립

이 논문은 외식물 배양 방법을 사용하여 치수 줄기세포의 1차 배양을 확립하고 ICSCRT 지침에 따라 이러한 세포의 특성을 분석하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 분리된 세포는 추가 응용을 위한 중간엽 줄기 세포로 간주될 수 있습니다.

치과용 치수줄기세포의 1차 배양

이 프로토콜은 효소 소화를 통해 치수에서 다분화능 줄기 세포의 추출, 배양 및 보존을 강조합니다. 또한 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 분화할 수 있는 잠재력을 보여주며 공정에서 정밀도와 일관성의 중요성을 강조합니다.

Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth(인간 낙엽 및 영구치에서 치과용 치수 줄기 세포의 분리, 배양 및 특성화)

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI높은MFGE8높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBIhighMFGE8high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

학습하세요 인간 치포 줄기 세포의 일시적 유전자 조작 방법을 통해 재생의학에서 안전한 줄기세포 치료 개선 방안을 탐색하세요. 이 기법은 microRNA 도입으로 유전체 통합 위험 없이 세포 특성을 향상시킵니다.

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

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