Name: 살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 집파리(Musca domestica)의 카르복실에스터레이스 단백질을 대규모로 생산하고 퍼메트린 대사 기능을 특성화하는 방법을. 이 기술은 살충제 내성 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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1. 식 및 곤충 세포 잠재 중재 식 시스템 대상 단백질의 격리
<ol><li>으로 집에서 파리에서 대상 단백질의 무뚝뚝한 끝난 PCR 제품을 복제.<ol>
<li>녹색 형광 단백질 (GFP)의 PCR 뇌관과 집 플라이 MdαE7 유전자 그들의 순서 및 선택한 벡터 (표 1)의 특별 한 요구에 따라 디자인.</li>
		<li>내, 교정 DNA 중 합 효소 및 단계 1.1.1에서에서 프라이 머를 사용 하 여 수행 (30 µ L의 반응 버퍼, 10mm dNTPs, DNA 중 합 효소의 1.5 µ L, 하우스 비행 템플릿 DNA, 앞으로 뇌관의 7.5 µ L의 6 µ L의 3 µ L 150 µ L PCR 반응 최종 볼륨 150 µ L 물으로 역 뇌관의 7.5 µ L). 30에 대 한 98 ° C에 PCR 반응 열 10 98 ° C의 35 주기 다음 s s, 53 ° C 30에 대 한 s, 및 60 72 ° C s, 그리고 2 분 동안 72 ° C에서 최종 확장).<ol>
<li>PCR 제품의 150 µ L로 1 %agarose 젤을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>소비 세는 agarose에서 대상 DNA 조각을 선명 하 고 깨끗 한 메스로 젤: MdαE7 및 858 1317 혈압 혈압 GFP에 대 한. 상업적으로 사용 가능한 젤 추출 키트 다음 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)를 사용 하 여 DNA를 정화. 15 µ L의 증류수에 순화 된 DNA를 분해.</li>
		<li>무결성 검사를 순화 된 DNA의 1 µ L와 1 %agarose 젤을 실행 합니다. 순화 된 DNA의 또 다른 1 µ L를 사용 하 여 측정 농도 분 광 광도 계.</li>
	</ol>
</li>
	<li>구성 대상 단백질에 대 한 항목 플라스 미드<ol>
<li>복제 반응을 설정 합니다. 믹스 갓 정화 단계 1.1.3에서에서 DNA 제품 및 상용 항목 1: 1의 몰 비에 포함 at &amp; tL-사이트 (자료 테이블)를 벡터 (0.5-2 µ L 70-200 ng / µ L 농도에서 신선한 PCR 제품의: 0.5 µ L 벡터). 다음 상용 소금 솔루션 (1.2 M NaCl2 와 0.06 M MgCl2)의 1 µ L를 더하고 물 6 µ L의 최종 볼륨을 부드럽게 혼합 하 고 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
		<li>전송 단계 1.2.1 화학적 유능한 대장균 의 50 µ L에서에서 반응 제품을 복제의 4 µ L 셀. 30에 대 한 셀 30 분 열-충격에 대 한 얼음에 품 어 동요 없이 42 ° C 물 욕조에 s.</li>
		<li>실내 온도 S.O.C. 매체 (2 %tryptone; 0.5% 효 모 추출 물; 10 mM NaCl; 2.5 m m KCl; 10 m m MgCl2, 10 m m MgSO4, 20 mM 포도 당)의 또 다른 2 분 추가 250 µ L에 대 한 얼음에 다시 튜브를 넣어. 부드럽게 떨고와 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>50-200 µ L 세균성 문화 선택적 파운드 플레이트 (tryptone의 1 g, NaCl의 1 g; 효 모 추출 물 0.5 g; 천 증류수 100 mL에 용 해의 1.5 g에 1.2.3 단계에서의 확산. 고압 대 50 mg/mL의 0.1% 추가). 식민지 성장 위한 37 ° C에서 16 h에 대 한 파운드 플레이트를 품 어.</li>
		<li>5-10 식민지를 선택 하 고 다시 개별적으로 5 µ L의 증류수로 그들을 중단.</li>
		<li>반응 버퍼의 5 µ L, 0.5 µ L 10 mM dNTPs의 DNA 중 합 효소, 일시 중단 된 식민지의 1 µ L, 10 µ M M13 앞으로 뇌관의 1.25 µ L의 0.25 µ L을 추가 하 여 PCR을 수행, 대상 유전자와 25 µ L의 최종 볼륨을 물 10 µ M 역 뇌관의 1.25 µ L 열 PCR 30에 대 한 98 ° C에 반응 10 98 ° C의 35 주기 다음 s s, 53 ° C 30에 대 한 s, 및 60 72 ° C s, 그리고 2 분 (표 1)에 대 한 72 ° C에서 최종 확장.</li>
		<li>다시 3 µ L 단계 1.2.5 TB 미디어 (0.17 M KH2포4 와 0.72 M K2HPO4 tryptone, 효 고의 2 개 mL 12 g 6 g를 포함 하는 기본 국물 매체의 450 mL를 포함 하는 인산 염 버퍼의 100 mL에서에서 일시 중단 된 식민지의 문화 글리세롤, 소독, 0.1 P mg/mL 대 포함) 16 헤에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 따르고 울트라 순수 플라스 미드 DNA 추출.</li>
		<li>단계 1.2.7 상업 Sanger에서에서 사용 200 ng / µ L 울트라 순수 플라스 미드 시퀀싱 M13 정방향 및 역방향 뇌관으로. 제조업체에서 제공 하는 순서에 따라 벡터에 대상 유전자의 정확한 삽입을 확인 합니다.</li>
		<li>-20 ° c.에 MdαE7 그리고 GFP의 시퀀스 확인 매우 순수한 플라스 미드 DNA 샘플을 저장 참고: 이것은 GFP와 항목 플라스 미드 DNA의 MdαE7입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재조합 잠재 람다 재결합 (LR) 반응을 수행 하 여 구성 합니다.<ol>
<li>각각 300 ng / µ L 항목 플라스 미드 DNA의 GFP, 단계 1.2.7에서에서 MdαE7 또는 페니 acetyltransferase 유전자 (고양이) 상용 (포함 at &amp; tL 사이트)의 5 µ L로 세포 transfection 키트에 의해 제공의 항목 플라스 미드 DNA의 1 µ L를 혼합 C-기간 선형 DNA ( at &amp; tR 사이트 포함) 250 µ L에서 PCR 튜브 합니다. TE 버퍼 8 µ L의 총 볼륨을 추가 합니다. 참고: GFP와 고양이의 반응은 제어 그룹으로 사용 되었다.</li>
		<li>상업적으로 이용 가능한 람다 재결합 (LR) 효소 혼합 (자료 테이블) LR 반응 촉매를 1.3.1 단계의 각 혼합물으로의 2 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 25 ° C에서 하룻밤 (≈16 h) 품 어. 참고: LR 반응은 at &amp; tL 포함 항목 플라스 미드 DNA는 at &amp; t는 at &amp; tB 포함 된 표현 바이러스를 생성 하 C 기간 선형 DNA 포함 하는 R와의 재결합을 촉진 한다. 이 단계는 각 대상 단백질에 대 한 재조합 잠재를 생성합니다.</li>
		<li>희석 단계 1.3.2에서에서 LR 반응 제품의 1 µ L 20 X. Polyhedrin 앞으로 뇌관을 사용 하 여 PCR을 수행 하 고 V5 반전 뇌관 (표 1). PCR 제품의 5 µ L를 사용 하 여 품질을 확인 하려면 1 %agarose 젤을 실행. 그림 1 MdαE7 유전자에서 LR 반응 제품의 한 예를 보여 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig1.jpg"> 그림 1: PCR 분석에 의해 MdαE7 LR 반응의 결과 예. 200-fold LR 반응의 2 µ L를 희석 하 고 희석 Polyhedrin 앞으로 뇌관 및 V5 역방향 뇌관의 2 µ L 25 µ L PCR를 사용 하 여. PCR 제품의 5 µ L를 사용 하 여 1 %agarose 젤 LR 반응의 품질을 확인 하기 위해서. 는
<ol start="4"><li>곤충 Sf9 셀 transfect<ol>
<li>T25에 완전 한 세포 성장 매체 (10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 혈 청 자유로운 매체)의 5 mL와 함께 문화 곤충 Sf9 셀 27 ˚C에서 플라스 크 취급.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 신선한 완전 한 세포 성장 매체의 3 mL와 함께 하단에 연결 된 셀을 플러시. 새로운 치료 T25 플라스 크에 다시 중단된 셀의 0.5 mL를 전송 합니다. 완전 한 성장 매체의 4.5 mL를 추가 합니다. 다음 전송까지 3-4 일 동안 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>씨 로그 단계 성장 곤충 Sf9의 2 개 mL 세포 문화 (≈3.0-5.0 × 106 셀) 잘 세포 배양에 균등 하 게. 셀 후드에서 실내 온도에 적어도 3 h에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
		<li>250 X에서 거꾸로 위상 현미경으로 관찰 하 여 셀 첨부 파일을 확인 합니다. 세포 배양 매체를 제거 하 고 품위의 곤충 매체의 2 개 mL를 바꿉니다.</li>
		<li>Transfection 혼합물 A 솔루션 (8 µ L 상용 세포 감염 시 약 (자료 테이블)의 그레이스의 곤충 매체의 100 µ L로) 및 각 대상 유전자 (9 µ L 단계 1.3에서에서 LR 반응 제품의 transfection 혼합물 B 솔루션 준비 unsupplemented 그레이스의 곤충 매체의 100 µ L)으로 1.5 ml에서 원심 튜브, 각각.</li>
		<li>부드럽게 함께 튜브를 활용 하 여 transfection 혼합물 A와 B를 혼합. 후드에서 35 분 실 온에서 품 어.</li>
		<li>균등 하 게 단계 1.4.4에서에서 시드 셀에 dropwise 1.4.6 단계에서 혼합물을 추가 합니다. 밀봉 테이프와 웰 스 하 고 하룻밤 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>완전 한 성장 매체의 2 mL에 그레이스의 곤충 매체의 2 mL 바꿉니다. 각 잘 비 재조합 잠재에 대 한 부정적인 선택에 100 µ M ganciclovir를 추가 합니다. 밀봉 테이프와 웰 스 하 고 72 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>각 우물에서 72 h 포스트 감염 세포 배양 매체를 수집 하 고 1.5 mL 원심 관에 전송. 셀 또는 큰 파편을 제거 하 4 ° C에서 5 분 동안 1500 x g에서 원심.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 원심 분리기 튜브는 상쾌한을 전송 합니다. 빛 으로부터 보호와 4 ° C에서 그들을 저장 합니다. 참고: 이들은 각 대상 유전자에 대 한 P1 바이러스 재고 솔루션입니다.</li>
		<li>높은 titer P2 바이러스 성 주식 (5 × 107-1 × 108 pfu/mL)을 낮은 titer P1 바이러스 성 주식 (1 × 105-1 × 106 pfu/mL)를 증폭.</li>
		<li>씨 로그 단계 성장 곤충 Sf9의 2 개 mL 세포 문화 (≈3.0-5.0 × 106 셀) 잘 세포 배양에 균등 하 게. 셀 후드에서 실내 온도에 적어도 3 h에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
		<li>P1 바이러스 재고 단계 셀에서 1.4.10 시드 단계 1.4.12의 각각에서 얻은 5 µ L 예방 그런 다음, 각 잘을 100 µ M ganciclovir를 추가 합니다. 우물을 밀봉 하 고 72 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>P2 바이러스 72 h 게시물 감염의 재고 솔루션을 수집 합니다. 빛 으로부터 보호와 4 ° C에서 저장 합니다. 참고: 이들은 각 대상 유전자에 대 한 P2 바이러스 재고 솔루션입니다.</li>
		<li>(선택 사항) P3 바이러스 재고 솔루션을 수집 하 P2 바이러스 주식의 5 µ L로 단계 1.4.12-1.4.14를 반복 합니다. 참고: 이들은 각 대상 유전자에 대 한 P3 바이러스 재고 솔루션입니다.</li>
		<li>빛 으로부터 보호와 4 ° C에서 생성 된 모든 잠재를 저장 합니다. 참고: GFP와 고양이 유전자 제어 그룹으로 역임 했다. 그림 2 는 셀 때 다른 증폭 단계에서 GFP 재조합 잠재 감염의 징후를 보여주었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig2.jpg"> 그림 2: 다른 잠재 증폭 단계에서 세포 Sf9의 감염된 징후의 예. 그림은 빛 자연광과 형광등 아래 GFP 재조합 잠재 세포를 보여줍니다. P1 감염 단계에서 감염 비율이 낮습니다. P2 감염 단계에서 감염 비율 크게 향상 되었습니다. P3 감염 단계에서 세포 성장 중단 셀 직경의 증가 거의 모든 세포 세포 배양 접시에서 초연의 증상을 보였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58106/58106fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="5"><li>곤충 Sf9 셀에 대상 단백질의 대규모 식<ol>
<li>문화 로그 단계 성장 곤충 Sf9 셀 T25 치료 비 플라스 크에 완전 한 성장 매체의 10 mL.</li>
		<li>세포 배양 단계 1.5.1 72 h에서에서 감염을 P2 바이러스 재고 솔루션 (단계 1.4.14에서에서 얻은)의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>72 시간 게시물 감염 세포 배양 매체를 수집 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 1500 x g에서 원심 분리기</li>
		<li>1 mL의 0.1 M PBS 버퍼 (pH 7.5)로 두 번 세척 하 고 표면에 뜨는 펠 릿을 삭제 합니다.</li>
		<li>완전히 분해 곤충 세포 단백질 추출 및 세포의 용 해 버퍼 (자료 테이블)의 1 mL와 함께 셀 펠 릿. 세포 세포의 용 해에 10% 글리세롤을 추가 합니다. -80 ° c.에 즉시 저장</li>
		<li>컨트롤 그룹으로 고양이 단백질의 P2 바이러스 재고 솔루션 단계 1.5.1-1.5.5를 반복 합니다. 참고: 다른 단백질 준비에 대 한 3 중에 1.5 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 셀 기반 MTT 세포 독성 분석 실험
<ol><li>문화 로그 단계 성장 (1.5-2.5 × 106 셀/mL) 곤충 Sf9 셀 T25 치료 비 플라스 크에 완전 한 성장 매체의 5 mL.</li>
	<li>27 ˚C에서 부드러운 떨고와 48 h 2.1 단계에서 세포 배양을 감염 P1 바이러스 재고 솔루션 (단계 1.4.14에서에서 얻은)의 25 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>100mm 이기에 permethrin 표준 재고 솔루션을 준비 합니다. 이기를 사용 하 여 1000 µ L의 총 볼륨에서 62.5 µ L permethrin 재고 솔루션, 125 µ L, 250 µ L, 500 µ L를 각각 추가 하 여 6.25 m m, 12.5 m m, 25mm, 50mm를 희석.</li>
	<li>균등 하 게 단계 2.2 완전 한 성장 매체의 300 µ L 2 × 105 셀/mL의 조밀도에 24-잘 접시에 보충에서 감염 된 세포 배양의 200 µ L 씨.</li>
	<li>최종 농도 50 µ M, 100 µ M, 200 µ M 및 400 µ M를 각각 있도록 각 우물에 permethrin 표준 솔루션 (6.25 m m, 12.5 m m, 25 m m 50 m m)의 4 µ L를 추가 합니다. 만 셀 생존 능력 계산 (그림 3)에 대 한 웰 스에 이기의 4 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>테이프와 플레이트를 봉인 하 고 빛 으로부터 보호 48 h 27 ° C에서 품 어.</li>
	<li>버퍼에 녹아 5 mg/mL MTT (Thiazolyl 블루 Tetrazolium 브롬) 시 약 준비 (NaCl, KCl, 0.05 g의 2.0 g 0.36 g NaH2포4∙2H2O, NaH2포4, 0.05 g의 0.28 g KH2PO4 200 mL에 녹의 증 류 물, pH 7.5)입니다.</li>
	<li>아래 연결 된 셀 레이어를 건드리지 않고 후 48 h 인큐베이션 단계 2.6에서에서 세포 배양 매체를 제거 합니다. 각 잘 2.7 단계에서의 MTT 시 약 200 µ L를 추가 합니다. 각 잘 (그림 3)에서 어두운 자주색 formazan 침전 형성 될 때까지 4 h 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>어두운 자주색 formazan 각 우물에서 침전 될 때까지 4 h 37 ° C에서 품 어. DMSO 완전히 침전 (그림 3) 해산의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig3.jpg"> 그림 3: MTT 결과의 예. 48 h 후 고양이 재조합 잠재 솔루션의 P1 바이러스 재고 솔루션 감염을 균등 하 게 씨앗 500 µ L 셀 24-잘 셀 문화 접시에 고양이 유전자 표현 게시. 각각 400 µ M, 200 µ M, 100 µ M, 50 µ M 최종 농도 만들기 위해 각 행에는 다른 복용량 (6.25 m m, 12.5 m m, 25mm, 50mm)에서 4 µ L permethrin를 추가 합니다. 컨트롤 행 이기만 치료 하 고 접시에 CK로 표시 했다. (A) 후 27 ° C에 외피의 48 h, 상위 층에 세포 배양 매체를 삭제 하 고 노란색 색된 MTT 시 약의 200 µ L를 바꿉니다. 그 후 품 어 48 h. 어두운 자주색 착 색된 감소 각 잘 나타내는 생존 세포는 노란 색을 물질 대사로 변화 시키기의 형태로 침전 물에 대 한 37 ° C에서 MTT 시 약 어두운 자주색 착 색된 침전으로. (DMSO 용 매 B) 500 µ L 각 잘 형성된 된 침전을 해산에 추가 되었습니다. 각각의 흡 광도 값은 잘 분 광 광도 계 540에 의해 발견 되었다 nm. Permethrin 농도 증가, 색 것으로 점차 변경 진한 빨간색에서 빛 빨강, 제안 셀 viabilities 점차적으로 감소 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58106/58106fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="10"><li>96 잘 접시에 녹은 솔루션의 200 µ L를 전송 합니다. 흡 광도 값에서 540 nm microplate 리더 (테이블의 재료)를 사용 하 여.</li>
	<li>그 취급 이기 셀만 permethrin 처리 셀의 흡 광도 값을 비교 하 여 세포 생존 능력을 계산 합니다.</li>
	<li>컨트롤 그룹에 대 한 솔루션과 P2 바이러스 주식 페니 acetyltransferase (고양이) 재조합 잠재 단계 1.4에서에서 얻은의 모든 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>다른 바이러스 준비에 대 한 4 번 반복 합니다.</li>
</ol>3. 대사 분석 결과 생체 외에서
<ol><li>100mm 이기에 permethrin 표준 재고 솔루션을 준비 합니다. 이기를 사용 하 여 6.25 m m, 12.5 m m, 25mm, 50mm를 희석. HPLC를 사용 하 여 각 농도에서 해당 피크 지역 검색. 만들고 permethrin 다른 permethrin 농도와 피크 지역에 따라 표준 곡선을 계산 합니다.</li>
	<li>브래드 퍼 드 방법21단계 1.5에서에서 단백질 농도 측정 합니다.</li>
	<li>40 µ M permethrin 표준 대사 반응의 700 µ L와 단계 1.5 0.2 M Tris HCl 버퍼 (pH 7.4)에 용 해에서 얻은 단백질의 1 밀리 그램 준비 합니다. 부드러운 진동으로 2 h 30 ° C에서 품 어. 빛 으로부터 보호 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 이기의 700 µ L을 추가 하 여 반응을 끄다. 부드러운 진동으로 또 다른 30 분 30 ˚C에서 품 어. 빛 으로부터 보호 합니다.</li>
	<li>실 온에서 2 분 동안 16000 x g에서 반응 혼합물 원심 상쾌한와 0.45 μ 막 통해 필터를 수집 합니다. 여 HPLC 분석에 대 한 깨끗 갈색 유리 튜브로 전송 합니다.</li>
	<li>최적의 크로마 조건 (모바일 단계 a: 90% 이기와 10% 물; HPLC를 실행 모바일 단계 b: 5% 이기 조정 85% 인산으로 pH 2.3). 그라데이션 1 mL/min과 232의 파장에서 측정의 유량과 elute nm.</li>
	<li>단백질 견본 추가 없이 반응 비교 하 여 permethrin의 소모 비율을 계산 합니다.</li>
	<li>1.5.6 단계에서 얻은 고양이 단백질을 사용 하 여 컨트롤 역할.</li>
	<li>다른 단백질 준비 단계 1.5.7에서에서 모든 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>

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최근 수십 년간, 분리 식 시스템 널리 표현 하 고 많은 양의 단백질, 생화학 및 기능 확인 및 체 외에서효소의 특성화 되므로 격리 사용 되었습니다. 날짜 하려면, 대장균, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae및 Spodoptera frugiperda 를 포함 하 여 여러 다른 모델 시스템은 재조합 형 단백질 표정, 그리고의 선택에 대 한 적응 되었습니다는 생체 외에서 시스템 관심된 단백질22,23,,2425의 대규모 세대를 위해 결정적 이다. 우리의 연구에서 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 집 비행 거리 carboxylesterases를 생성 하는 곤충 세포에 유사...

살충제 저항은 현재 하우스 비행 제어 전세계1,2의 주요 문제 이다. 살충제 저항 메커니즘을 결정 하는 노력이 문제의 더 나은 이해를 용이 하 게 하 고 따라서 새로운 전략을 효과적으로 방지 하거나 저항 개발3의 확산을 최소화를 제공 합니다. Carboxylesterases, 주요 해독 효소 중 하나로 격리 및 다양 한 곤충4,,56에 살충제를 metabolizing에서 그들의 역할에 대 한 관심을 많이 받고 있다. 우리의 이전 연구는 집 파리에 여러 carboxylesterases를 발견 했다와 그들의 식 레벨만 constitutively 최대 저항 하는 ALHF 긴장에 규제 있었지만 또한 높은 유발된 수준 permethrin 치료7에 대 한에서 일 수 있다 . 그러나, 살충제를 metabolizing에서이 carboxylesterase 유전자의 기능 characterizations 탐험 남아 있다.
초기 1980 년대8에서 첫 번째 보고서 이후 외국 유전자 잠재 중재 식 시스템은 널리 고용 높은 단백질 생산 효율성 및 기능9를 처리 하는 진 핵 단백질. 이 이진 시스템은 두 개의 필수 요소 구성: 생성 된 재조합 잠재 호스트 세포와 세포 재조합 잠재 감염 하 여 관심된 단백질의 대규모 식으로 외국 유전자를 제공. 지난 수 십년 동안 잠재 중재 셀 식 시스템 곤충에 막 도약 단백질을 cytosolic 효소에서 배열 하는 재조합 단백질의 수천을 생산 하기 위해 널리 이용 되는 고 포유동물 세포10. 우리의 이전 연구는 성공적으로이 시스템11곤충 Sf9 세포에 여러 CYP450 효소를 표현 했다. 이 연구에서 우리 곤충 Sf9 세포를 감염 하는 carboxylesterase 재조합 잠재 건설, 셀 공차를 다른 permethrin 처리 및 대규모 표현된 carboxylesterase 단백질에서 체 외에 대 한 탐구 기능 탐구입니다. 이전 연구12,13로 채택 곤충 homogenates에서 여러 carboxylesterase isozyme 혼합물을 조사, 대신이 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 특정 식 수 및 그들의 생 화 학적 및 구조적 특성의 더 나은 특성에 대 한 타겟된 단백질의 격리.
Tetrazolium 소금 기반 시험 (MTT)은 높은 처리량 색도계 방법 개발 및 세포 생존 능력을 측정 하도록 최적화입니다. 이 분석 결과 살아있는 세포만 분석 될 수 있다 colorimetrically 유기 용 매14에에서 용 해 한 후, 어두운 자주색 색깔된 formazan 침전에 노란색 색 MTT 시 약을 물질 대사로 변화 시키기의 수 있는 메커니즘에 따라 15. Trypan 블루 제외 등 티 미 딘 적정 분석 결과16,17시간이 걸리는 방법, 그러나 더 정확 하 게 몇몇 최근 몇 년 동안에서 개발 되었습니다. 그러나, 셀 기반 MTT 분석 결과 여전히 현재 인식 가장 신속 하 고 쉽게 운영 방법으로 신속 하 게 세포 생존 능력을 감지 하. 여기, MTT 분석 결과 사용 하 여 살충제 처리에 대 한 셀 공차를 탐험. 셀 때 강하게 carboxylesterase 재조합 잠재 감염의 향상 된 공차에 살충제 저항에 그들의 관련을 건의 하는 살충제에 carboxylesterases의 대사 역할을 지원 합니다.
또한, 생체 외에서 대사 분석 결과 또한이 연구에서 실시 되었다. 생체 외에서 대사 연구는 정확한 방법으로 여겨진다 carboxylesterases의 가수분해 활동을 반영 하기 위해 일반적인 기판 α-napthyl 아세테이트 (α-나) 등 β naphthyl 아세테이트 (β-없음)를 사용 하는 일반적인 carboxylesterase 분석 실험에 비해, 직접 carboxylesterases 살충제18대의 활동을 측정 합니다. 이 방법은 성공적으로 다양 한 곤충에 살충제 저항11,,1920와 협회에서 여러 시 토 크롬 P450s 하를 고용 하고있다. 그러나,이 방법은 하지 아직 적용 되었습니다 carboxylesterase 연구에서. 잠재 중재 식 시스템에 의해 생산 하는 carboxylesterase 단백질의 가용성, 우리는 체 외에서 대사 연구 permethrin, 더는 참여의 강력한 증거를 제공할 수 있는 방향으로 carboxylesterases의 실행할 수 있다 집에서 pyrethroid 저항을 부여에 carboxylesterases의 파리.

<table><tbody><tr><td>Q5 고충실도 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs inc.</td><td>M0491L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 겔 추출 키트</td>, <td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO 클로닝 키트, ONE Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K240020</td><td>S.O.C 배지 및 범용 M13 염기서열 프라이머가 이 키트에 포함되었습니다.</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K210002</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II BaculoDirectTM Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>11791-023</td><td></td></tr><tr><td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>12562-019</td><td>Cellfectin transfection 시약 및 ganciclovir가 이 키트에 포함되었습니다.</td></tr><tr><td>pENTR-CAT 플라스미드</td><td>Invitrogen by life technology</td><td></td><td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit에 포함, 농도: 0.5 ug/uL</td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청,</td><td>Life Technologies 인증 Gibco</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 세포 Sf-900 III SFM</td><td>Gibco by Life</td> Technologies <td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>곤충 세포-PE LB 곤충 세포 단백질 추출 & A</td> Geno Technology Inc의 Lysis Buffer <td>G Biosciences</td><td>786-411</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM (1&times;) Life Technologies의 Serum Free Medium Complete</td><td>Gibco</td><td>12658-019</td><td></td></tr><tr><td>Grace's Insect Medium, Unsupplemented</td><td>Gibco by Life</td> Technologies <td>11595030</td><td></td></tr><tr><td>Permethrin (isomers) 분석 표준</td><td>SUPELCO by Solutions WithinTM</td><td>442748</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (analytical graded)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (분석 등급)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>GHP Acrodisc 25 mm 주사기 필터 0.45 &mu; m GHP 멤브레인(HPLC 인증)</td><td>Pall Life Sciences</td><td>21890388</td><td></td></tr><tr><td>Alliance Waters 2695 HPLC 시스템</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycle</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c 분광 광도계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 세포 이미징 다중 모드 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 carboxylesterases의 기능 특성

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Carboxylesterase 중재 대사는 다양 한 곤충의 살충제 저항에 중요 한 역할을 생각입니다. 몇몇 carboxylesterase 유전자 살충제 저항을 부여에 있는 그들의 역할 탐구 될 남아 반면 내성 집 비행 긴장에서 최대 통제 발견 됐다. 여기, 우리는 carboxylesterases의 기능 특성에 대 한 프로토콜 설계 되었습니다. 3 예제 실험 제공 됩니다: (1) 식과 잠재 중재 곤충 Spodoptera frugiperda (Sf9) 셀 식 시스템을 통해 carboxylesterase 단백질의 격리 (2) 셀 기반 MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드) 세포 독성 분석 결과 다른 permethrin 치료; 곤충 세포의 허용 오차를 측정 하 (3) 생체 외에서 대사 연구를 permethrin로 carboxylesterases의 대사 기능을 탐구 하 고. MdαE7 저항 하는 집에서 복제는 carboxylesterase 유전자 변형 ALHF 조종 하 고 Sf9 세포 감염에 대 한 재조합 잠재를 구성 하는 데 사용. 셀 viabilities 다른 permethrin 치료에 대 한 MTT 분석 결과와 측정 되었다. Permethrin 제어 그룹 (고양이 재조합 잠재 감염 세포와 GFP 재조합 잠재 감염 세포)의 그들과 비교 된 실험 그룹 (MdαE7-재조합 잠재 감염 세포)의 향상 된 셀 허용 치료는 살충제, 화학 손상에서 세포를 보호 함으로써 metabolizing에서 MdαE7의 기능을 제안 했다. 게다가, carboxylesterase 단백질 곤충 Sf9 세포에 표현 되었고 고립 생체 외에서 대사 연구를 실시. 우리의 결과 중요 한 생체 외에서 대사 효율을 MdαE7의 향해 permethrin, 직접 살충제를 metabolizing에서 carboxylesterases의 개입을 나타내는 표시를 따라서 집에서 살충제 저항을 부여 있습니다.

다른 permethrin 치료 (MTT assay)으로 세포 생존 능력
Permethrin의 세포 독성 MdαE7 재조합 잠재 감염 Sf9 셀 (실험 그룹)과 고양이 재조합 잠재 감염 (잠재 감염 키트에 의해 제공) 셀 (제어 그룹)에서 시험 되었다. 향상 된 셀 공차 세포를 강하게 표현 하는 MdαE7에 permethrin 살충제와 화학 손상에서 따라서 보호 셀이이 carboxylesterase의 대사 역할을 지원 합니다. 우리의 연구에서 다른 permethrin 농도 대 한 세포 생존 능력 (50, 100, 200 및 400 µ M) 이기 혼자 치료 하는 세포와 비교 하 여 계산 되었다. 우리의 결과 나타났다는 세포를 표현 하는 MdαE7의 생존 (86.00%에서 101.92%에 배열 되는) 상당히 높은 (그림 4B</stron...

여기, 우리 제시 집 플라이 carboxylesterase 단백질에서 생체 외에서 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템으로 생산 하 고 나중 기능 metabolizing permethrin에 그들의 역할을, 특성화를 프로토콜 pyrethroid 부여 셀 기반 MTT 분석 결과 및 체 외에서 대사 연구를 실시 하 여 저항.

살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

이 방법은 곤충 독성학 분야의 핵심 질문에 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 모든 대사 해독 유전자를 발현하는 경우 살충제 내성에 관여합니까? 이 기술의 주요 장점은 더 큰 규모의 단백질을 생산할 수 있고 시험관 내에서 살충제 대사에서 이러한 단백질의 기능을 특성화할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Xuechun Feng입니다.Xuechen의 박사 학위 연구는 집파리, Musca domestica의 기생충 저항성에서 카르복실 에스테라제의 기능 특성화에 중점을 두고 있습니다. 시작하려면 250 마이크로리터 PCR 튜브에 1마이크로리터의 GFP 엔트리 플라즈마 DNA와 5마이크로리터의 시판되는 C-term 선형 DNA를 혼합합니다. 다음으로, 시판되는 람다 재조합 믹스 2마이크로리터를 각 PCR 튜브에 첨가합니다.튜브를 부드럽게 섞고 섭씨 25도에서 밤새 배양합니다. 2ml의 로그 위상 성장 곤충 SF9 세포 배양을 세포 배양 플레이트의 웰에 고르게 파종합니다. 그런 다음 세포가 후드에 실온에서 최소 3시간 동안 부착되도록 합니다.250x에서 반전상 현미경을 사용하여 세포 부착을 확인합니다. 그런 다음 세포 배양 배지를 제거하고 2ml의 Grace's insect medium으로 교체합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 따라 transfection 혼합물 A 및 B 용액을 준비합니다.그런 다음 튜브를 두드려 트랜스펙션 혼합물 A와 B를 함께 부드럽게 혼합합니다. 혼합물을 후드에서 실온에서 35분 동안 배양합니다. 다음으로, 혼합물을 파종된 세포에 적하 방향으로 첨가합니다.우물을 테이프로 밀봉하고 섭씨 27도에서 밤새 세포를 배양합니다. Grace의 곤충 배지 2ml를 완전한 성장 배지 2ml로 교체하십시오. 그런 다음 각 웰에 100마이크로몰 Ganciclovir를 추가합니다.웰을 테이프로 밀봉하고 섭씨 27도에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 감염 후 72시간이 지나면 각 웰에서 배지를 채취하여 1.5ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 1500회 G에서 튜브를 원심분리합니다.웰에 1ml의 완전 성장 배지를 추가하고 형광등 현미경을 사용하여 P1 baculovirus 증폭 단계에서 세포의 감염 징후를 관찰합니다. 상층액을 새로운 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮기고 어두운 조건에서 섭씨 4도에서 보관합니다. 그 후, 세포 배양 플레이트의 웰에 2ml의 로그 위상 성장 곤충 SF9 세포 배양을 고르게 파종합니다.세포가 후드에서 실온에서 최소 3시간 동안 부착되도록 합니다. 5마이크로리터의 P1 바이러스 스톡을 세포 파종 웰에 접종한 다음 각 웰에 100마이크로몰 Ganciclovir를 추가합니다. 웰을 밀봉하고 섭씨 27도에서 72시간 동안 세포를 배양합니다.먼저, T25 처리되지 않은 플라스크에서 완전한 성장 배지와 함께 5ml의 로그 위상 성장 곤충 SF9 세포를 배양합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 P1 바이러스 원액을 첨가하여 섭씨 27도에서 48시간 동안 부드럽게 흔들어 세포 배양액을 감염시킵니다. 아세토니트릴을 사용하여 100밀리몰 퍼메트린의 연속 희석액을 준비합니다.그런 다음 300마이크로리터의 완전 성장 배지가 보충된 200마이크로리터의 감염된 세포 배양액을 24웰 플레이트에 파종합니다. 퍼메트린이 아세토니트릴에 완전히 용해되어 플레이트의 각 웰에 고르게 전달되는지 확인합니다. 퍼메트린을 첨가한 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 배지에 퍼메트린이 완전히 혼합되도록 합니다.그런 다음 플레이트를 테이프로 밀봉하고 어두운 조건에서 섭씨 27도에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 바닥에 부착된 세포층을 방해하지 않고 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거합니다. 각 웰에 200마이크로리터의 MMT 시약을 추가합니다.그런 다음 각 웰에 짙은 자주색 포르마잔 침전제가 형성될 때까지 섭씨 37도에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다. 침전제를 완전히 용해시키기 위해 각 웰에 500마이크로리터의 DMSO를 추가합니다. 그런 다음 용해된 용액 200마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.침전물을 DMSO에 완전히 용해시키는 것은 결과의 정확성에 매우 중요합니다. 플레이트의 샘플에 DMSO를 첨가한 후, 침전물이 완전히 용해될 때까지 피펫을 사용하여 샘플을 여러 번 세척합니다. 마지막으로, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540나노미터에서 플레이트의 흡광도 값을 측정합니다.P1 단계에서는 감염률이 낮습니다. P2 단계에서는 감염 비율이 유의하게 향상되었습니다. P3 감염 단계에서 거의 모든 세포가 세포 배양 플레이트에서 분리, 세포 지름 증가, 세포 성장 중단 등의 증상을 보였습니다.검출된 흡광도 값을 기반으로 Md alpha E7 발현 세포는 대조군 CAT 세포에 비해 훨씬 더 높은 생존율을 보여주었습니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 실험을 수행하기 전에 병 및 튜브와 같은 물질의 표면을 70% 에탄올로 닦아서 모든 단계에서 세포 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 카르복실 에스테라제 단백질과 퍼메트린 리간드 간의 상호 작용과 같은 추가 질문에 답하기 위해 상동성 모델링 및 다크 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 기술은 곤충 독성학 연구자들이 곤충의 살충제 저항성에 대한 유전자 및 메커니즘의 기능적 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 살충제로 작업하는 것은 매우 해로울 수 있으며 이러한 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 실험복과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

functional-characterization-carboxylesterases-insecticide-resistant

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

전기 생리 학적 시험에 의해 측정 Aedes aegypti의 주요 부속 미각 유전자 발현을 추정하기 위해 두 가지 방법을 사용하여, 우리는, 추정되는 쓴맛 반발 화합물 신경 반응을 기본 유전자 세트를 확인했다.

생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱 Aedes aegypti

지중해초파리(medfly) Ceratitis capitata(Diptera: Tephritidae)는 전 세계 농업 해충입니다. 이 식물의 생물학에 대한 깊은 이해는 메드플라이 개체군을 통제하여 경제적 영향을 줄이는 데 중요합니다. 배아 미세주입(embryo microinjection)은 이 종에서 생식세포 형질전환(germ-line transformation)과 역유전학(reverse genetics) 연구를 모두 가능하게 하는 근본적인 도구입니다.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

안정적인 파리 (Stomoxys calcitrans) 양육 절차 제공 됩니다. 절차는 다이어트 구성 요소, 장비 및 공급에 대 한 로컬 사용 가능한 재료를 사용합니다.

실험실 안정적인 파리와 다른 Muscoid Diptera의 양육

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

이 논문은 동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 표준화 된 프로토콜에 의해 제공되는 상세한 단계는 B. dorsalis에서 기능적 유전자 연구를위한 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.

동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 프로토콜

이 프로토콜은 나비목 곤충 유충에 대한 식물 화학 물질의 잠재적 독성 효과를 평가하기 위한 의무 섭식 분석을 설명합니다. 이것은 확장성이 뛰어난 곤충 생물 검정으로 치사 및 치사 용량, 억제 활동 및 생리학적 효과를 쉽게 최적화할 수 있습니다. 이것은 친환경 살충제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

Helicoverpa armigera에 대한 Phytochemicals의 살충 효과를 평가하기 위한 공급 분석 시스템 개발

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer(포레스트 우드 보어의 곤충병원성 곰팡이의 격리, 행동 식별 및 병원성 평가)

다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도), 예를 들어, mannan를 사용 하 여 구조 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

배우세요 집파리(Musca domestica)의 카르복실에스터레이스 단백질을 대규모로 생산하고 퍼메트린 대사 기능을 특성화하는 방법을. 이 기술은 살충제 내성 메커니즘 연구에 필수적입니다.

살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성

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