살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성

이 방법은 곤충 독성학 분야의 핵심 질문에 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 모든 대사 해독 유전자를 발현하는 경우 살충제 내성에 관여합니까? 이 기술의 주요 장점은 더 큰 규모의 단백질을 생산할 수 있고 시험관 내에서 살충제 대사에서 이러한 단백질의 기능을 특성화할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Xuechun Feng입니다.

Xuechen의 박사 학위 연구는 집파리, Musca domestica의 기생충 저항성에서 카르복실 에스테라제의 기능 특성화에 중점을 두고 있습니다. 시작하려면 250 마이크로리터 PCR 튜브에 1마이크로리터의 GFP 엔트리 플라즈마 DNA와 5마이크로리터의 시판되는 C-term 선형 DNA를 혼합합니다. 다음으로, 시판되는 람다 재조합 믹스 2마이크로리터를 각 PCR 튜브에 첨가합니다.

튜브를 부드럽게 섞고 섭씨 25도에서 밤새 배양합니다. 2ml의 로그 위상 성장 곤충 SF9 세포 배양을 세포 배양 플레이트의 웰에 고르게 파종합니다. 그런 다음 세포가 후드에 실온에서 최소 3시간 동안 부착되도록 합니다.

250x에서 반전상 현미경을 사용하여 세포 부착을 확인합니다. 그런 다음 세포 배양 배지를 제거하고 2ml의 Grace's insect medium으로 교체합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 따라 transfection 혼합물 A 및 B 용액을 준비합니다.

그런 다음 튜브를 두드려 트랜스펙션 혼합물 A와 B를 함께 부드럽게 혼합합니다. 혼합물을 후드에서 실온에서 35분 동안 배양합니다. 다음으로, 혼합물을 파종된 세포에 적하 방향으로 첨가합니다.

우물을 테이프로 밀봉하고 섭씨 27도에서 밤새 세포를 배양합니다. Grace의 곤충 배지 2ml를 완전한 성장 배지 2ml로 교체하십시오. 그런 다음 각 웰에 100마이크로몰 Ganciclovir를 추가합니다.

웰을 테이프로 밀봉하고 섭씨 27도에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 감염 후 72시간이 지나면 각 웰에서 배지를 채취하여 1.5ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 1500회 G에서 튜브를 원심분리합니다.

웰에 1ml의 완전 성장 배지를 추가하고 형광등 현미경을 사용하여 P1 baculovirus 증폭 단계에서 세포의 감염 징후를 관찰합니다. 상층액을 새로운 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮기고 어두운 조건에서 섭씨 4도에서 보관합니다. 그 후, 세포 배양 플레이트의 웰에 2ml의 로그 위상 성장 곤충 SF9 세포 배양을 고르게 파종합니다.

세포가 후드에서 실온에서 최소 3시간 동안 부착되도록 합니다. 5마이크로리터의 P1 바이러스 스톡을 세포 파종 웰에 접종한 다음 각 웰에 100마이크로몰 Ganciclovir를 추가합니다. 웰을 밀봉하고 섭씨 27도에서 72시간 동안 세포를 배양합니다.

먼저, T25 처리되지 않은 플라스크에서 완전한 성장 배지와 함께 5ml의 로그 위상 성장 곤충 SF9 세포를 배양합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 P1 바이러스 원액을 첨가하여 섭씨 27도에서 48시간 동안 부드럽게 흔들어 세포 배양액을 감염시킵니다. 아세토니트릴을 사용하여 100밀리몰 퍼메트린의 연속 희석액을 준비합니다.

그런 다음 300마이크로리터의 완전 성장 배지가 보충된 200마이크로리터의 감염된 세포 배양액을 24웰 플레이트에 파종합니다. 퍼메트린이 아세토니트릴에 완전히 용해되어 플레이트의 각 웰에 고르게 전달되는지 확인합니다. 퍼메트린을 첨가한 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 배지에 퍼메트린이 완전히 혼합되도록 합니다.

그런 다음 플레이트를 테이프로 밀봉하고 어두운 조건에서 섭씨 27도에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 바닥에 부착된 세포층을 방해하지 않고 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거합니다. 각 웰에 200마이크로리터의 MMT 시약을 추가합니다.

그런 다음 각 웰에 짙은 자주색 포르마잔 침전제가 형성될 때까지 섭씨 37도에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다. 침전제를 완전히 용해시키기 위해 각 웰에 500마이크로리터의 DMSO를 추가합니다. 그런 다음 용해된 용액 200마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.

침전물을 DMSO에 완전히 용해시키는 것은 결과의 정확성에 매우 중요합니다. 플레이트의 샘플에 DMSO를 첨가한 후, 침전물이 완전히 용해될 때까지 피펫을 사용하여 샘플을 여러 번 세척합니다. 마지막으로, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540나노미터에서 플레이트의 흡광도 값을 측정합니다.

P1 단계에서는 감염률이 낮습니다. P2 단계에서는 감염 비율이 유의하게 향상되었습니다. P3 감염 단계에서 거의 모든 세포가 세포 배양 플레이트에서 분리, 세포 지름 증가, 세포 성장 중단 등의 증상을 보였습니다.

검출된 흡광도 값을 기반으로 Md alpha E7 발현 세포는 대조군 CAT 세포에 비해 훨씬 더 높은 생존율을 보여주었습니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 실험을 수행하기 전에 병 및 튜브와 같은 물질의 표면을 70% 에탄올로 닦아서 모든 단계에서 세포 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 카르복실 에스테라제 단백질과 퍼메트린 리간드 간의 상호 작용과 같은 추가 질문에 답하기 위해 상동성 모델링 및 다크 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 곤충 독성학 연구자들이 곤충의 살충제 저항성에 대한 유전자 및 메커니즘의 기능적 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 살충제로 작업하는 것은 매우 해로울 수 있으며 이러한 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 실험복과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.