Name: 감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 Zika 바이러스 감염 시 Ifnar1-/- 생쥐의 면역특권 장기에서 항원특이적 T 세포 반응을 평가하는 방법입니다. 테트라머 기반 흐름세포측정법으로 뇌와 고환에서 바이러스 특이 T 세포를 추적하여 면역보호 및 면역병리 기전을 규명하고 백신 효능을 평가합니다.

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저자는 영어 버전에 대 한 게리 왕 감사합니다. 이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (그랜트 2017YFC1200202)에 의해 지원 되었다 (그랜트 2016ZX10004222-003) 중국 연구 전염 성 질병에 대 한 주요 특별 프로젝트. 조지 F. Gao는 국가 자연 과학 재단의 중국 혁신적인 연구 그룹 (그랜트 81621091)의 주요 책임자 이다.

동물 실험은 바이러스 성 질병 관리 및 예방, 중국 CDC 기관 동물 관리 및 사용 위원회 국립 연구소에 의해 승인 되었다. 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 승인 동물 프로토콜을 수행 했다.
1. 바이러스 감염
<ol><li>계속 성인 (6 8 주 오래 된) 표준 특별 한 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 Ifnar1-/- (남성 50%와 50% 여성) 쥐 그리고 그들에 게 음식과 물에 대 한 일반적인 접근을 허용.</li>
	<li>ZIKV을 통해 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 하는 버퍼 1 x 104 초점 형성 단위 (FFUs) 바이러스의에 ZIKV의 100 µ L의 복고풍-궤도 접종으로 Ifnar1/- 생쥐를 감염. 마찬가지로 PBS의 동일한 볼륨 컨트롤 마우스를 제공 합니다. 주의: ABSL2 조건에서 쥐를 감염 하 고 biosafety 내각에서 바이러스에 감염 된 쥐와 함께이 절차를 수행.</li>
	<li>15 일 동안 무게와 쥐의 임상 증상 (떨림, 비틀 거리 며 3 월, 양국 이완 된 뒷 다리) 매일 모니터링 합니다.</li>
</ol>2입니다. ZIKV 백신과 예방 접종
<ol><li>나이의 6 그리고 8 주 사이 Ifnar1-/- (남성 50%와 50% 여성) 마우스를 사용 합니다. 음식과 물에 18-29 ° C와 액세스와 12 h 명암 주기 표준 SPF 상태에서 생쥐를 유지.</li>
	<li>ZIKV 백신 Ifnar1/- 생쥐를 면역: AdC7-M/E의 100 µ L를 주사 [4 x 1010 (바이러스 입자)] PBS에 23-G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 근육 주사 (인스턴트 메신저 경로)를 통해 버퍼.</li>
	<li>마찬가지로 PBS의 동일한 볼륨 컨트롤 마우스 주사.</li>
</ol>3. 비장에서 Monocytes의 격리
참고: 비장에서 monocytes의 격리는16에서 설명한 대로 설명 되어 있습니다.
<ol><li>(1 L/min의 유량)과 5% isoflurane concentrationin 100% 산소를 사용 하 여 면역 및 ZIKV 감염 쥐 7 d 후 접종 anesthetize 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사. 다음, 즉시 75% 에탄올으로 전체 마우스를 찍어. 주의: 앞으로이 단계에서 모든 실험 절차에서에서 수행 되어야 합니다 aseptically biosafety 내각.</li>
	<li>바늘을 사용 하 여 해결할 (안락사, 이전 감염 접종) 쥐의 사지 거품 접시에 향하도록 복 부.</li>
	<li>복 부 정중 선 따라 피부 살 균 메스와 흉부에,가 위로 잘라 복 부 근육, 복 부 구멍을 노출 잘라내어 간 제거. 참고: 복 부의 왼쪽에 긴, 다크 레드 기관은 비장 이다.</li>
	<li>비장을 제거, 그것을 씻어 모든 혈액을 제거 하 여 차가운 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI)의 1.5 mL에 PBS에 3 배. 얼음에 비장을 유지.</li>
	<li>비장에서 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 organ(s) 50 mL 튜브 위에 불 임 40 µ m-메쉬 셀 여과기에 놓고 얼음 처럼 차가운 RPMI 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)의 2 개 mL를 추가 합니다. 5 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 기계적으로 매 시는 organ(s) 하 고 때까지 기관 완전히 메시를 통해 지상 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 600 x g 4 ° c.에 5 분에서 그것을 원심합니다 제거는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 셀 (NH4Cl, 나2EDTA, 및 KHCO3; 테이블의 자료를 참조) 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 5 mL을 품 어 5-6 분 동안 실내 온도에 세포의 용 해 반응 하 고.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 RPMI/FBS 매체의 10 mL와 RBC 세포를 중지 하 고 원심 관 600 x g 4 ° c.에 5 분에서 제거는 상쾌한.</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체 (10 %vol / vol FBS와 RPMI 100 U/mL 페니실린-스) 10 mL와 셀 resuspend 작은 튜브에 세포 현 탁 액의 10 µ L를 전송, 0.4 %wt / 집 trypan 파랑의 10 µ L를 혼합 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산.</li>
</ol>4. 두뇌와 고환에서 Monocytes의 격리
<ol><li>(1 L/min의 유량)과 5% isofluranein 100% 산소를 사용 하 여 ZIKV에 감염 된 남성 쥐 7 d 후 접종 anesthetize 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사. 다음, 즉시 75% 에탄올으로 전체 마우스를 찍어. 주의:이 단계 이후,에서 모든 실험 절차 수행 되어야 합니다 aseptically biosafety 내각에서. 두뇌와 고환에서 monocytes의17에서 설명한 대로 설명 되어 있습니다.</li>
	<li>(안락사, 이전 감염) 남성 마우스 마에서 발생 하기 쉬운 위치에 고정</li>
	<li>직선 1 x 2 이빨 집게와 두 피를 보호 하 고 노출 두개골을 두 피에 중간 절 개를 아이리스가 위를 사용 하 여.</li>
	<li>날카로운 핀셋으로 궤도의 두 측면을 클램프 및 두뇌를 수정. 구멍 매그넘 에 날카로운가 위를 홍 채의 1 개의 끝을 놓고 옆으로 두개골에 잘라. 다른 측면에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>사용을 신중 하 게 동일한 구멍을 코 쪽으로 중간에서 잘라 아이리스가 위 날카로운. 뇌 부상 방지 가능한 표면가 위의 끝을 유지 하려고 합니다.</li>
	<li>집게와 두뇌를 들어올린 날카로운 아이리스가 위를 사용 하 여 신중 하 게 두개골 신경 섬유를 해 부. 집게와 두뇌를 제거 하 고 차가운 RPMI/10% FBS 매체의 5 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에.</li>
	<li>집게와 복 부 피부를 잡아 하 고 날카로운 아이리스가 위를 사용 하 여 외피와 복 벽을 통해 세로 절 개를 누르시면 부분의 복 부를 노출. 절 개까지 testes를 밀어. 부드럽게 핀셋으로 지방 레이어를 당겨 하 고 양쪽에 구형 고환 노출.</li>
	<li>사용 날카로운 아이리스가 신중 하 게 지방 층 및 epididymis 해 부를 위. 집게와 얼음 RPMI/10% FBS 매체의 5 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 testes를 놓습니다.</li>
	<li>뇌 또는 testes에서 단일 세포 현 탁 액을 생성, 50 mL 튜브 위에 100 µ m 메쉬 멸 균 셀 여과기에 기관 놓고 차가운 RPMI/10% FBS 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 5 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 장기를 매 시 고 때까지 기관 완전히 메시를 통해 지상 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 600 x g 4 ° c.에 5 분에서 그것을 원심합니다 제거는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 30% 밀도 그라데이션 중간의 5 mL와 함께 셀을, 다음, 매우 느리게 15 mL 튜브에서 70% 밀도 그라데이션 중간의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>브레이크 해제 스위치와 원심 800 x g 30 분 받기에 4 ° C에서 튜브 중간 계층에서 림프 톨.</li>
	<li>신선한 15 mL 튜브에 interphase 전송, 찬 RPMI/10% FBS 매체의 10 mL을 추가 하 고 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 관을 원심 제거는 상쾌한.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 RPMI/FBS 매체의 10 mL와 함께 셀 resuspend 및 4 ° c.에서 5 분 동안 600 x g 에서 원심 제거는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 완전 한 RPMI 매체의 10 mL와 함께 셀과 단계 3.9 에서처럼 셀 수 있습니다.</li>
</ol>5. tetramer 준비
<ol><li>NdeI 및 XohI 제한 사이트18pET28a 벡터를 사용 하 여 α3 도메인 및 β2m C-말단에 biotinylated 사이트 태그와 H-2Db 의 세포 외 도메인을 표현 하는 플라스 미드를 생성 합니다.</li>
	<li>익스프레스 고 H-2Db 와 β2m 앞에서 설명한20의 포함 시체를 준비 합니다.</li>
	<li>
Renature 정화는 MHC/펩 티 드 복잡 한 2D Hb-E294-302.
	<ol>
<li>[100 mM Tris HCl (pH 8.0), 400 m m L-아르기닌, 2 mM EDTA-나, 5mm GSG, 그리고 0.5 m m GSSG] refolding 솔루션 200ml를 준비 합니다. 프로 테아 제 억제제를 추가: phenylmethylsulphonyl 불 소 (PMSF, 재고 100 m m), 100 µ L의 pepstatin (재고 2 mg/mL), 및 leupeptin (재고 2 mg/mL)의 100 µ L의 2 mL. 멋진 30 분 동안 4 ° C에서 버퍼.</li>
		<li>Β2mbH-2D, 펩 티 드 refolding 솔루션에 추가 합니다.<ol>
<li>500 µ L 주사기를 사용 하 여 guanidine 솔루션 (주식 30 mg/mL)에 녹 β2m의 주사. 이 위해 5 mL 주사기 23 G 바늘을 사용 하 고 refolding 솔루션에 의해 드롭 β2m 주입. 지속적으로 하 고 천천히 4 ° c.에서 150 rpm에서 감동 하는 솔루션을 유지</li>
			<li>Refolding 솔루션에서 β2m를 해산 후 DMSO의 200 µ L에서 E294-302 펩 티 드의 2 밀리 그램을 해결 하 고 신속 하 게 refolding 솔루션을 피 펫을 사용 하 여 그것을 주입. 천천히 15 분 동안 4 ° C에서 150 rpm에서 솔루션을 저 어.</li>
			<li>H-2Db guanidine 솔루션에 용 해의 1.5 mL를 주사. H-2Db 8-10 h 4 ° C에서 refolding 위해 150 rpm에서 저 어 바 회전 유지. 참고: 솔루션 추운 방에 닫힌된 상자에 배치 했다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>10 kDa 막으로 가압된 챔버에 refolded 단백질을 집중 한다. 실로 버퍼 [20 mM Tris HCl (pH8.0), 50 mM NaCl]를 교환 하 고 30-50 mL의 최종 볼륨을 집중.</li>
		<li>원심 분리기 튜브 refolding 솔루션 전송 및 4 ° c.에 15 분 동안 2500 x g 에서 회전</li>
		<li>조심 스럽게 10 kDa 원심 필터에는 상쾌한을 전송 하 고 2500 x g 30 분 동안에 500 µ L의 최종 볼륨에 더 집중.</li>
		<li>신선한 튜브는 상쾌한 전송 하 고 S200과 단백질에서 12000 x g 15 분 Purify 스핀 10/300 GL 젤 ﬁltration 착 색 인쇄기.</li>
		<li>MHC 복잡 한 피크를 수집 하 고 350 µ L의 최종 볼륨을 집중.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biotinylation에 대 한 500 µ L 반응 볼륨을 생성 하려면 다음과 같은 순서로 regents 추가: 솔루션의 100 µ L [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µ L 솔루션 B의 (100 m m ATP, 100 mM MgOAc, 200 µΜ biotin), 추가 d-비오 틴 (biotin 500 µΜ)의 100 µ L BirA 효소 (60 µ g)의 20 µ L, 0.5 µ L의 pepstatin (2 mg/mL), 및 leupeptin (2 mg/mL)의 0.5 µ L. 4 ° c.에 하룻밤 반응 관을 품 어 주의: biotinylating 반응에 어떤 EDTA를 추가 하지 마십시오.</li>
	<li>MHC는 S200를 사용 하 여 정화 10/300 GL 젤 여과 열 제거 어떤 여분의 biotin을.</li>
	<li>
Streptavidin 시프트 분석 결과18와 biotinylating 효율성을 결정 합니다.
	<ol>
<li>3 샘플, A, B, 및 C, 30 분 동안 얼음에 준비 합니다. 분석 결과 10 %SDS 페이지. Biotinylated MHC 분자의 8 µ L 및 exchange 버퍼, biotinylated MHC 분자의 8 µ L의 샘플 B와 streptavidin (20 mg/mL), 및 streptavidin (20 mg/mL)의 2 µ L의 샘플 C 8 µ L 교환 버퍼 2 µ L의 2 µ L 샘플 A에 의하여 이루어져 있다. 주의: 샘플 끓여 야 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multimers biotinylated MHC 분자의 형성.
	<ol>
<li>모든 biotinylated MHC 분자의 완전 한 바인딩 되도록 1: 5의 몰 비율로 streptavidin phycoerythrin 표시는 biotinylated E294-302 펩 티 드 H2Db 복잡 한 혼합 하 여 tetramer를 생성 합니다.</li>
		<li>Streptavidin 공액 tetramerization에 필요한 금액을 계산 합니다.<ol>
<li>MHC/펩 티 드 복합물 단백질 농도 어 금 니 무게에 대 한 회계의 두더지를 결정 (예: 1.8 mg 총 단백질의 40 nmol =).</li>
			<li>5 MHC/펩 티 드의 두더지를 분할 하 여 필요한 streptavidin 켤레의 두더지를 계산 (예: 40/5 = 8 nmol streptavidin 켤레의).</li>
			<li>(µ G)에서 필요로 하는 streptavidin의 양을 계산 streptavidin 켤레에 따라 (예: streptavidin-PE [300000 g/M] → 8 nmol 필요 = 2400 g).</li>
		</ol>
</li>
		<li>10 샘플 streptavidin phycoerythrin 나눕니다. Biotinylated E294-302 펩 티 드 H2Db 복잡 한, 20 분의 간격을 포함 하는 관을 각 샘플을 추가 합니다. 마지막 샘플 로딩 후 어둠 속에서 하룻밤 4 ° C에서 반응 관을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Multimerized 시 약 100 kDa 스핀 관으로 적용 하 고 그것의 볼륨에 4 ° C에서 2000 x g 에서 원심 분리 하 여 집중 < 100 µ L.</li>
	<li>4 ml PBS (pH 8.0)를 사용 하 여 스핀 튜브에 샘플을 희석 하 고 그것을 다시 집중 < 100 µ L.</li>
	<li>PBS (pH 8.0)에서 버퍼 교환 단계 반복 4 배.</li>
	<li>총 볼륨 500 다시 채워 µ L PBS (pH 8.0)를 사용 하 여. 4 ° c.에 2000 x g 에 2-2.5 mg/mL의 추정된 농도에 샘플을 집중 4 ° c.에 어둠 속에서 샘플을 저장</li>
</ol>6. Cytometry
<ol><li>어떤 불특정 바인딩 방지 하기 위해 10 분, 20 µ L (희석 비율 1: 200) 당 반대로 murine CD16/CD32 Fc 수용 체 차단 약의 0.1 µ L와 4 ° C에서 (에서 3.9 단계 또는 단계 4.15) 셀 정지를 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 적어도 15 분 동안 20000 x g 에서 tetramer 튜브 원심</li>
	<li>96 잘 platecontaining 1 x 106 세포에 세포 현 탁 액의 20 µ L를 각각 잘 추가 합니다.</li>
	<li>모든 실험 관 얼룩 E294-302 tetramer 믹스의 충분 한 볼륨을 준비 합니다. 계정에이 혼합의 총 볼륨의 15% 초과 pipetting 오류에 대 한 준비. FACS 버퍼에서 E294-302 tetramers (2 mg/mL, 1 µ L/테스트) 희석 (PBS, 0.5 %FBS)를 20 µ L E294-302 tetramer 믹스의 각 테스트에 추가 됩니다.</li>
	<li>96 잘 접시를 20 µ L E294-302 tetramer 믹스를 추가 합니다. 이 단계 말까지 각 잘에서 최종 볼륨 40 µL.Incubate 30 분 방 온도에서 어둠 속에서 판 이어야 한다.</li>
	<li>세포 현 탁 액에 1 µ L/테스트에서 1 차 항 체 (FITC 활용 또는 APC 활용 된 안티-CD3 (0.2 mg/mL), PerCP 활용 된 안티-CD8 (0.2 mg/mL))를 추가 하 고, 다음, 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>2 세포를 씻어 FACS 버퍼 및 원심 분리기 600 x g 5 분 대에 그들 신중 하 게는 상쾌한 발음 및 resuspend FACS 버퍼의 200 µ L로 세포의 2 개 mL x.</li>
	<li>흐름 cytometric 분석까지 어둠 속에서 4 ° C에서 일시적으로 샘플을 저장 합니다.</li>
	<li>
흐름 cytometric 분석에 대 한 다음과 같은 제어 전략을 사용 합니다.
	<ol>
<li>앞으로 분산형 (FSC) 측면 살포 (SSC) 지역 대 를 그려서 대각선 클러스터 된 singlets에는 게이트를 만듭니다.</li>
		<li>다음, CD3에 게이트 옆 살포 (SSC) 대 CD3;에 의해 세포가+ 다음, CD3에 게이트+ CD8+ 세포; 마지막으로, CD8 개요+ + tetramer 셀19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. histopathology, 면역 형광 검사, 및 Immunohistochemistry 분석 결과
<ol><li>
Histopathology 분석 결과
	<ol>
<li>ZIKV 감염 Ifnar1/- 생쥐 7 d 후 접종의 두뇌와 고환 조직 수집 하 고 4% 중립 버퍼링 포름알데히드에 그들을 수정. 주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오.</li>
		<li>파라핀에 조직을 포함 합니다.</li>
		<li>섹션 5 m m는 vibratome를 사용 하 여 조직.</li>
		<li>얼룩 hematoxylin와 오신 (H & E) 조직.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunohistochemistry 분석 결과
	<ol>
<li>Deparaffinize, rehydrate, 및 항 원 검색 조직의 절차에 따라 섹션21설명한.</li>
		<li>10 분 동안 PBS (pH 7.6)에 3% H2O2 와 조직 단면도 취급 하 고 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 10 분 동안 그들을 차단.</li>
		<li>쥐 반대로 마우스 CD3 항 체와 조직 단면도 품 어 (희석: 1/1000) 실내 온도에 8 h에 대 한 그리고, 다음, 품 어 그들 4 ° C에서 하룻밤.</li>
		<li>PBS 가진 조직 헹 구 고, biotinylated 이차 항 체의 3 드랍 스와 다음, 그들을 품 어 (희석: 1/1000) 실 온에서 2 h, 다음 avidin 비타민 b 복합체 과산화 효소 3 방울 (희석: 1/200) 30 분 동안 실내 온도에.</li>
		<li>30, 3 방울과 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride 바인딩 (희석: 1/1000), 앞에서 설명한22.</li>
		<li>메이어의 hematoxylin와 조직 단면도 counterstain</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역 형광 분석 결과
	<ol>
<li>실 온에서 10 분 동안 냉동된 고환 섹션 (6 m m) 건조</li>
		<li>10 분 동안 차가운 아세톤으로 그들을 수정.</li>
		<li>3 x PBS와 섹션을 세척 하 고 블로킹 버퍼와 그들을 차단 (1 %BSA, 0.3% 트리톤, 1 x PBS) 30 분 동안 37 ° C에서.</li>
		<li>1 차적인 항 체 (z 6)와 조직 단면도 품 어 (20 µ g/mL) 4 ° C에서 하룻밤.</li>
		<li>PBS 가진 조직 린스 하 고 이차 항 체를 적용 (희석 비율: 1/200) 37 ° c.에 1 시간에 대 한</li>
		<li>PBS 가진 조직 단면도 세척 하 고 사용 하 여 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵에 대 한 counterstain (희석 비율: 1/1000), 제조업체의 지침에 따라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 선언할 수 없다.

면역성 T-셀 epitope 병원 체23에 대 한 세포 면역에 중요 한 역할을 한다. 따라서, immunoprivileged 장기에서 ZIKV 전용 T 세포의 검출은 자연 ZIKV 감염에 대 한 T 세포 응답을 이해 하는 중요 한 방법론 이다. 한편, T 세포 응답 감지 바이러스 백신의 효능을 조사 하는 훌륭한 도구입니다. 여기, 우리는 비장, 뇌, 그리고 ZIKV에 감염 된 마우스, immunodominant epitope E294-302 tetramer의 준비의 testes에서 림프 톨의 격리를 포함 하는 실험을 시각화 하는 포괄적인 프로토콜 표시와 ZIKV 전용 CD8의 인식+ T immunoprivileged ZIKV에 감염 된 쥐의 장기에서 세포.
이전 학문은 보여주었다 라이브 ZIKV 또는 그것의 RNA는 ZIKV 수 있습니다 혈액 고환 방 벽을 무시 하 고 생식24에서 자체 복제를 나타내는 남성 환자의 정액에서 검출 될 수 있다. 이전에, 우리도 ZIKV testes 손상 될 수 있고 쥐25에서 남성 불 임으로 이어질 보였다. ZIKV 감염으로 이어질 수 있는 붉은 털 원숭이에 니와 내장 기관 뿐만 아니라 중앙 신경 시스템 (CNS), 바이러스 성 RNA를 검출 될 수 있다. Immunohistochemistry는 CNS와 여러 주변 장기26ZIKV 특정 항 원 제시 했다 밝혔다. Murine 모델의 ZIKV 감염 강력한 항 바이러스 CD8을 일으킬 수 있다 또한,+ 비장에 CNS26T 세포 응답.
이전 작품에 비해,이 연구 ZIKV 전용 CD8 감지 체계적인 방법을 설정+ T-세포 두뇌와 고환, immunoprivileged 사이트에 응답. 그것은 ZIKV에 감염 된 쥐의 immunoprivileged 장기에서 바이러스 관련 T 세포의 기능을 평가 하는 것이 중요입니다. ZIKV 전용 CD8 감지 하는 tetramers의 사용+ T-셀 immunoprivileged 기관에 응답 ZIKV 감염 및 그들의 호스트 면역 반응에 대 한 우리의 이해를 크게 향상 시킬 것 이다. E294-302 tetramer 사용 하 여, 뇌와 고환에 바이러스 관련 T 세포 수 고립 될 cytometry에 의해 ZIKV 감염 시 보호와 immunopathogenesis의 세포 메커니즘을 조사. 한편, 연구자는 CD8 기능 추가 조사에 대 한 도움이 됩니다+ T 세포 제어 ZIKV, 또는 ZIKV 감염 시 이러한 기관에서 immunopathogenesis를 강화.
항 원 특정 murine CD8 분석+ T 세포 응답 immunoprivileged 장기에 우리는 H-2Db-E294-302 tetramer 준비 하 고는 CD8 감지 cytometry에 의해+ T 세포. Tetramers은 항 원 특정 T 세포를 감지 하는 강력한 도구입니다. 여기, 형광 색소 활용 된 streptavidin (APC, PE 및 BV421)의 세 가지 유형 생성 했다. APC-, BV421-고 항 원 특정 T 세포, PE 표시 된 pMHC을 탐지 하기 위한 tetramers PE 표시에 통계적으로 유의 한 차이가 있지만-내가 tetramers 최고의 결과 굴복. 따라서, PE 라는 tetramer이이 연구에 걸쳐 사용 되었다. 흥미롭게도, 우리 뇌와 고환에 혈액에서 바이러스 관련 T 세포의 마이그레이션 능력을 나타내는 항 원 특정 T 세포의 높은 비율을 감지 PE 표시 H-2Db-E294-302 tetramer을 바탕으로, immunoprivileged 기관입니다.
그러나, 프로토콜에 몇 가지 제한이 있습니다. H-2Db-E294-302 tetramer tetramer 탐지는 MHC 제한에 의존 하기 때문에 인간 T 세포 검출, 유용 하지 않습니다. Immunodominant HLA 제한 펩 티 드의 심사는 여전히 필요 합니다. 게다가, 역 궤도 감염 ZIKV 감염에 효과적입니다 하지만 일부 조사에 대 한 편리한 작업 수 있습니다. 따라서, 감염, 복 막, 피하, 또는 정 맥를 포함 하 여 다른 경로 또한 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 프로토콜에서 중요 한 단계는 두뇌와 고환에서 monocytes의 격리입니다. 높은-품질 림프 톨; 취득 하는 것이 중요 하다 따라서, 예를 들어 원심 속도, 연 삭 조직의 힘과 두뇌와 고환 조직의 해 부에 관심을 지불 하는 것이 중요 하다. 게다가, tetramer 준비에 대 한 protease 억제제 (PMSF, pepstatin, leupeptin)는 도움이 타락에서 단백질을 보호 하는 경우. 따라서, 그것을 추가 하는 프로 테아 제 억제제 refolding 버퍼 고 tetramer 준비의 과정에서 버퍼를 교환 의미가 있습니다.
결론적으로, 우리는 ZIKV 감염에 대 한 Ifnar1-/- 마우스 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 검출 하는 방법 제시. 이 플랫폼 신흥 고 다시 신흥 혈액 및 immunoprivileged 기관 사이의 장벽을 우회할 수 있는 바이러스의 면역 메커니즘을 조사를 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 또한,이 연구 후보 백신과 immunotherapies의 미래 발전에 대 한 방법을 포장 수 있습니다.

ZIKV 이다 모기 부담 flavivirus는 먼저 격리 하 1947 년에 우간다에 열 병 붉은 털 원숭이. 최근에 ZIKV 공중 보건 비상 사태를, 아메리카 및 그것의 예기치 않은 링크 microcephaly Guillain-바레 증후군1,2,3를 그것의 급속 한 보급으로 인해 되고있다. 역학 자료에서 ZIKV는 약 4, 000 당 1에 Guillain-바레 증후군의 원인을 감염 성인4의심 되었습니다. 또한, ZIKV 및 testes 감염/피해 마우스 모델 사이의 상관 관계 입증 되었습니다, ZIKV 감염의 특정 상황에서 혈액 고환 방 벽을 무시 하 고 결국 남성 불 임 증5 이어질 수 제안 . 이러한 연구 결과 ZIKV 감염 시 보호 또는 pathologic 면역 반응의 유도 완전히 이해의 중요성을 강조 표시 합니다.
많이 ZIKV에 대 한 세포 면역 응답에 대해 배울 수 있다. CD4+ 와 CD8+ T 세포 응답 capsid, 봉투, 및 nonstructural 단백질 1 (NS1) ZIKV에 감염 된 원숭이 인간6,7,8에서 관찰 되었습니다. 여러 연구에서 쥐, 표명 그 CD8+ T 세포 제어 ZIKV 복제9,,1011에 보호 역할. 중요 한 것은, 후라도 그 외 여러분 ZIKV 감염의 혈액-뇌 장벽 붕괴에 CD8의 혈관 주위 침투 결과 시연+ Ifnar1/- 생쥐 고환 내에서 효과 기 T 세포. 또한, 그들이 보여주는 CD8+ T 셀 ZIKV 관련 마비를 선동 하 고 신생아 뇌 immunopathology에서 역할을 표시. 이전 연구에서 우리는 ZIKV-E294-302 tetramer 준비 하 고 보여 그 ZIKV 전용 CD8+ T 세포는 두뇌 및 디자인에 대 한 중요 한 의미를 가질 수 있는 ZIKV 감염 Ifnar1/- 생쥐의 척수에 존재 그리고 ZIKV 백신10의 개발입니다.
ZIKV 감염을 방지 하기 위해 예방 접종에 대 한 긴급 한 필요에 대응, 여러 백신의 개발, RNA 재조합 벡터 기반 백신, 백신, 순화 된 단백질 소 단위 백신을 포함 하 여 전 임상 단계에 있습니다. 플라스 미드 DNA 백신은 단계 1 임상 시험12입니다. 안전 평가 및 ZIKV 백신의 효능은, 그러므로, 중요 하다. 백신의 장점 중 하나는 ZIKV에 대 한 보호에 대 한 중요 한 될 수 있는 특정 T 세포 응답을 유도 하는 능력입니다. ZIKV에서 파생 된 T-세포 epitope 관련 tetramers를 사용 하 여 아 데 노 바이러스 벡터 기반 ZIKV 백신에 의해 유도 된 T 세포 immunoreactivity 면역된 생쥐에서 검출 될 수 및 M과 E glycoproteins 강력한 항 원 특정 CD8 유도 표시 했다+ T-셀 immunoreactivity13.
바이러스 감염 시의 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 분자 T 세포 수용 체 (TCR)를 제시한 펩 티 드 항 원 인식 호스트14를 보호 하기 위한 중요 한 T 세포 중재 하는 메커니즘입니다. 이 이론에 따라, tetramer 기술은 항 원 특정 T 세포 면역 반응15규제에서 재생 하는 역할을 명료 하 게 하는 독특한 도구입니다. 이 프로토콜 tetramer 기술을 사용 하 여 비장, 뇌, 그리고 쥐의 고환에 반응 T 세포의 탐지 그리고 ZIKV 감염, Ifnar1-/- 마우스 모델의 설립을 설명 합니다. 또한, 우리는 감지 하 고 면역된 생쥐의 ZIKV 백신 (AdC7-M/E)에 의해 유도 된 T 세포 immunoreactivity를 평가 ZIKV-E294-302 tetramer를 사용. 이 연구 조사 기관 immunoprivileged에서에서 T 세포 응답에 대 한 지침을 제공 하 고 태 반 이나 태아 두뇌에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 참조를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Z6</td><td>우리 연구실</td><td></td><td>Ma W, Li S, Ma S, et al. 지카 바이러스는 고환 손상을 일으키고 생쥐의 남성 불임을 유발합니다. 셀, 2016, 167: 1511-1524 e1510</td></tr><tr><td>CD3</td><td>산타</td>크루즈 <td>sc-1127; RRID: AB_631128</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 접합 아피니퓨어 염소 항인간 IgG(H+L)</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZF-0308</td><td></td></tr><tr><td>토끼 항염소 IgG, FITC 접합</td><td>CWBIO CW0115</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD3</td><td>Biolegend</td><td>17A2</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD3</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td></td></tr><tr><td>PerCP 안티 마우스 CD8a</td><td>바이오레전</td><td>드 100732</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>P8370</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Ameresco</td><td>0754-5G</td><td>독성 및 부식성 시약. 주의해서 다루십시오</td></tr>. <tr><td>Streptadivin</td><td>BD</td><td>S4762-FZ</td><td>는 PBS에서 10mg/ml의 농도로 명확한 해결책을 제공하며, -20°C에서 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>펩스타틴</td><td>시그마</td><td>P4265-5MG</td><td>5 mg 2.5 mL DMSO, -20 &ordm에 저장된 분취액; C</td></tr><tr><td>류펩틴</td><td>시그마</td><td>L8511</td><td>5 mg 2.5 mL dH2O, -20 &ordm에 저장된 분취량; C</td></tr><tr><td>펩티드</td><td>Scilight 펩티드는</td><td></td><td>DMSO에 재현탁하고 -20°C에 보관해야 합니다. C</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30809.01</td><td>4°C에서 보관해야 합니다. C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP</td><td></td> 219605590 <td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>APC-Streptadivin</td><td>BD</td><td>554067 <</td><td>br/> 4 >C에 보관 및 유지 관리해야 합니다. 얼리지 마십시오.</td></tr><tr><td>FITC-Streptadivin</td><td>BD</td><td>554060</td>은 <td> 4 &deg;C.에 보관 및 유지 관리해야 합니다. 얼리지 마십시오.</td></tr><tr><td>PE-Streptadivin</td><td>BD</td><td>554061 <</td><td>br/> 4 >C.에 보관 및 유지 관리해야 합니다. 얼리지 마십시오.</td></tr><tr><td>BV421-Streptadivin</td><td>BD</td><td>563259 <</td><td>br/> 4 >C.에서 보관 및 유지 관리해야 합니다. 얼리지 마십시오.</td></tr><tr><td>PageRuler 염색되지 않은 단백질 사다리</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>26614</td><td>4°C에 보관해야 합니다. C</td></tr><tr><td>Cell Strainers</td><td>BF</td><td>BF10-5040</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 100 kDa</td><td>Millipore UFC510024</td><td></td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Cantol</td><td></td><td></td><td>유세포 분석기에는 사용된 염색 패널과 호환되는 레이저와 필터가 포함되어야 합니다.</td></tr><tr><td>Superdex 200 증가 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>AKTA 퓨어</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Solarbio</td><td>R1010</td><td>4°C에 저장.</td></tr></tbody></table>

감염 된 ifnar1/- 생쥐의 immunoprivileged 장기에서 zika 바이러스 관련 t 세포 응답의 평가

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Guillain-바레 증후군을 선도 하 고 고환을 손상 Zika 바이러스 (ZIKV) immunoprivileged (예를 들어, 뇌와 고환), 장기에 염증을 일으킬 수 있습니다. ZIKV 감염, 동안 면역 세포 조직에 침투 하기 위해 표시 되었습니다. 그러나, ZIKV 감염 시 보호 및 이러한 면역 세포의 immunopathogenesis를 정의 하는 셀룰러 메커니즘 여전히 크게 불명 하다. 여기, 우리는 ZIKV에 감염 된 쥐의이 immunoprivileged 장기에서 바이러스 전용 T 세포 기능을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 포함 한) ZIKV 감염 및 Ifnar1/- 생쥐에서 백신 접종 b) histopathology, 면역 형광 검사, 및 뇌, 고환, 비장;에서 바이러스 감염과 염증 감지 immunohistochemistry 분석 실험 c)의 ZIKV에서 파생 된 T-세포 epitopes; tetramer의 준비 뇌, 고환, 비장에서 분리 하는 monocytes에 ZIKV 전용 T 세포의 d) 검색. Immunoprivileged 기관으로 침투 하는 항 원 특정 T 세포를 감지 하 고 감염 기간 동안이 T 세포의 기능을 평가 하는 이러한 방법을 사용 하 여,: 잠재적인 면역 보호를 통해 바이러스 정리 및 염증을 악화 또는 immunopathogenesis. 이러한 연구 결과 또한 ZIKV에 대 한 예방 접종에 의해 유도 된 T 세포의 기여를 명확히 하는 데 도움이 있습니다.

이러한 방법에 따라 우리는 ZIKV 감염 murine 모델을 개발 했습니다. 나이의 6-8 주에 Ifnar1/- 생쥐 1 x 104 초점 형성 단위 (: FFU)는 ZIKV의 retroorbital 주입 하 여 감염 되었습니다. 병 적인 증상 및 징후 (그림 1A), 뿐만 아니라 체중 변화 (그림 1B), Ifnar1/- 생쥐에는 ZIKV와 감염 후 관찰 되었다. Murine 두뇌 보였다 명백한 부 종과 충 (그림 1C). Testes 점차적으로 긴축 하는 한편, (그림 1D). 또한, 병 적인 변화와 조직의 파괴는 두뇌와 고환 (그림 2A)에서 발견 됐다. 우리 뇌와 고환 (그림 2B)에 ZIKV를 감지 하는 면역 형광 분석 결과 수행. 높은 바이러스 부하는 immunostaining (그림 2B)에 의해 두뇌와 고환에 감지 했다. Immunohistochemistry CD3의 강력한 침투 했다+ T ZIKV (그림 2C) 감염 후 생쥐 뇌 세포.
감지 하 고 평가 하는 ZIKV 전용 T 세포 응답, 우리는 마우스 MHC 준비-나 H-2Db-E294-302 tetramer. 펩 티 드 전자294-302 H-2Db renature를 제대로 도울 수와 녹는 MHC의 높은 금액을 얻을-나 (그림 3A). 교대 분석 실험에서 biotinylation에 높은 효율 (그림 3B) 관찰 될 수 있었다. 그 후, 3 개의 streptavidin 형광 (APC, PE 및 BV421)-pMHC 태그-난 tetramers ZIKV 전용 T 세포 (그림 3C) 감지 생산. PE 라는 tetramer 했다 특정 CD8 감지 하는 높은 효능+ 비록 차이 통계적으로 중요 한 APC 및 BV421 표시 된 tetramers에 비해 T 세포.
우리 cytometry ZIKV (3.49 ± 0.45%)의 7 일 후 접종에 의해 감염 된 마우스의 비장에 ZIKV 관련 T 림프 톨을 감지 전자294-302 tetramer를 사용 하 여. 또한, AdC7-M/E 백신의 4 주 후 예방 접종과 함께이 프로토콜의 섹션 3에서에서 설명 하는 방법을 유사한, ZIKV 관련 T 림프 톨에에서 검색 된 비장 (6.89 ± 1.36%) (그림 4)입니다.
또한, 우리는 ZIKV 감염 후 뇌와 고환, immunoprivileged 기관으로 침투 하는 세포를 감지. 문 CD3 선택으로 설정 된+CD8+ T 세포는 두뇌와 고환의 총 림프 톨. E294-302 tetramer 전용 T 세포의 높은 비율 두뇌에서 검출 될 수 (CD3에서 42.2%+CD8+ T 세포)는 고환과 (c d 3에서 26.4%+CD8+ T 세포) 세포 (그림 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig1.jpg"> 그림 1 : Ifnar1/- 생쥐에서 ZIKV 감염의. 나이의 6-8 주에 Ifnar1/- 생쥐에 감염 되었습니다 104 초점 형성 단위 (: FFU)는 ZIKV의 retroorbital 주입, 그리고 PBS를 주입 하는 쥐 감염 되지 않은 컨트롤으로 사용 되었다. 형태학 (A) 및 (B) 감염된 Ifnar1/- 생쥐의 체중 변화 감시 되었다. 빨간색 화살표는 Ifnar1/- 생쥐는 감염 후 myeloparalysis와 모터 paraparesis 제시를 나타냅니다. 7 d 후 접종에서 (C) 두뇌와 0, 7, 14, 그리고 30 일 후 접종 (D) testes 수확 했다. 두뇌와 쥐에서 고환의 대표 이미지 크기를 표시 하는 눈금자 함께 표시 됩니다. 오차 막대 대표 평균 ± SEM. n = 실험 당 그룹당 10 쥐. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig2.jpg"> 그림 2 : ZIKV 두뇌 및 ZIKV 감염 Ifnar1/- 생쥐 고환 세포의 검출. 두뇌와 7 d 후 접종에 부정적인 컨트롤에 비해 ZIKV에 감염 된 쥐에서 고환의 (A)이이 패널 쇼 histopathological 변화. 눈금 막대 = 25 µ m (왼쪽된 패널) 및 50 µ m (오른쪽 패널). (B)는 면역 형광 분석 결과 안티 ZIKV z 6 항 체 (녹색)으로 수행 되었다. 모든 조직 샘플 7 d 후 접종에서 ZIKV에 감염 된 생쥐에서 수집 되었다. 핵 (파란색)와 DAPI 스테인드 했다. 눈금 막대 CD3의 강력한 침투 50 µ m. (C) Immunohistochemistry 쇼 =+ T 세포는 두뇌와 고환에. 눈금 막대 = 25 µ m (왼쪽된 패널) 및 50 µ m (오른쪽 패널). 보라색 되며, 브라운 CD3 항 체를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig3.jpg"> 그림 3 : ZIKV 특정 pMHC의 준비-난 tetramers. (A) E H-2Db 294-302 의 바인딩은 생체 외에서 refolding 의해 해명. 블루 H-2Db-E294-302 단백질을 나타냅니다. 오렌지는 펩 티 드 없이 부정적인 컨트롤을 나타냅니다. (B)이이 패널 H-2Db-E294-302 변화 분석 결과를 보여 줍니다. (C) mock PBS 컨트롤을 나타냅니다. 3 streptavidin 형광 (APC, PE 및 BV421)-pMHC 태그-난 tetramers ZIKV 전용 T 세포를 감지 하는 데 사용 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig4.jpg"> 그림 4 : 바이러스 관련 CD8의 cytometric 분석 흐름 + 및 ZIKV 감염 백신 접종 생쥐의 비장에 T 세포. 나이의 6-8 주에 Ifnar1/- 생쥐 104 초점 형성 단위 (: FFU) ZIKV의 감염 중 하나 되었습니다 또는 단일-AdC7-M/E 또는 부정적인 컨트롤로 PBS의 4 x 1010 바이러스 성 입자의 복용량을 받았다. 감염 된 후 7 일 후 4 주 후 예방 접종, 마우스 splenocytes 수확 되었고 cytometry에 의해 분석. 으로 평균 ± sd. 통계 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행한 데이터 표시 됩니다 (중요 하지: P &gt; 0.05; *P &lt; 0.05; * *P &lt; 0.01; * * *P &lt; 0.001; * * *P &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig5.jpg"> 그림 5 : 두뇌와 ZIKV에 감염 된 쥐의 고환에+ T 세포 바이러스 관련 CD8의 전략 및 대표 결과 게이팅. 대표 작은 두뇌와 (B)는 고환 (A)에 침투 림프 톨에 대 한 표시 됩니다. 게이츠의 승계 림프 분산형+ 와 CD3 선택 설정+ 이벤트. 이들의 CD8+ 이벤트 epitope 전용 T 세포의 분석에 대 한 문이 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Zika 바이러스 감염 도중, T 세포는 바이러스 제거를 위한 면역 특권 기관에 침투할 수 있습니다 그러나 또한 Guillain-Barre 증후군 또는 고환 상해와 같은 면역 병인에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Zika 바이러스 감염 과 백신 예방 접종 후 모두 면역 특권 기관에서 항원 별 T 세포의 테트라머 기반 검출을 용이하게한다는 것입니다. 이 모델에서, Zika 바이러스 감염은 인터페론 알파/베타 수용체 녹아웃 마우스에서 시작되어 뇌, 고환 및 비장에서 Zika 바이러스 특이적 T 세포의 추적을 허용합니다.테트라머 염색 접근법을 사용하여, 면역 보호 및 면역 병원성 세포에 T 세포 기여를 탐구하기 위하여 Zika 바이러스 특정 T 세포에 침투하는 면역 특권 기관의 단지 특성을 조사할 수 있습니다. Zika 바이러스 감염을 위해, 6-8 주 된 인터페론 알파 /베타 수용체 녹아웃 마우스로 레트로 궤도 접종을 통해 PBS의 100 마이크로 리터에서 Zika 바이러스의 4 개의 초점 형성 단위에 10 을 10 을 전달합니다. 그런 다음, 15 일 동안 매일 감염된 동물의 체중과 임상 징후를 모니터링하십시오.7일 후 접종후, 수술폼의 척추 위치에 감염된 동물을 고정하고, 멸균 메스를 사용하여 복부의 중간선을 따라 피부 절개를 한다. 가위를 사용하여 복부 근육을 열고 간을 부드럽게 추출하십시오. 이어서, 비장을 제거하고, PBS에서 조직을 세 번 헹구고 혈액을 제거한다.마지막 세척 후, 비장을 모든 비장이 수집 될 때까지 얼음에 얼음 차가운 RPMI 매체의 1.5 밀리리터에 비장을 놓습니다. 단일 셀 서스펜션을 생성하려면 비장을 멸균, 40 마이크로미터 메쉬 셀 스트레이너를 50 밀리리터 튜브 위에 넣고 10%의 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충된 얼음 냉기 RPMI 배지 2밀리리터를 스트레이너에 추가합니다. 이어서, 5밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 필터를 통해 조직을 제거하고, 신선한 배지를 사용하여 메쉬를 통해 방출된 세포를 플러시한다.단일 세포 현탁액을 원심분리를 위한 15밀리리터 원모튜브로 옮기고, 적혈구 용해 완충제의 5밀리리터에서 펠릿을 재보선한다. 실온에서 5~6분 후에는 얼음 냉간 RPMI 10밀리리터와 FBS로 리시스를 멈추고 두 번째 원심분리를 위해 펠릿을 10밀리리터의 완전한 배지로 재보습합니다. 7일 후 접종, 안락사, 감염, 수컷 마우스를 도마에 걸리기 쉬운 위치에 고정하고, 직선 1-2-2-치아 집게로 두피를 고정시한다.홍채 가위를 사용하여 두피에 중간 선 절개를 하고 두개골을 노출하고 날카로운 핀셋을 사용하여 날카로운 핀셋으로 궤도의 양면을 고정하여 뇌를 고정시하십시오. 날카로운 홍채 가위의 한 쪽 끝을 포라멘 매그넘에 넣고 측면으로 양쪽의 두개골로 자른다. 조심스럽게 같은 구멍에서 중간선까지 잘라, 코를 향해, 뇌를 다치게하지 않도록 가능한 피상적 인 가위 팁을 유지.집게로 뇌를 들어 올리고 날카로운 홍채 가위를 사용하여 두개골 신경 섬유를 조심스럽게 해부하십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 얼음 차가운 RPMI 와 FBS 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 뇌를 전송하십시오. 고환을 분리하려면, 집게로 복부 피부를 들어 올리고, 홍채 가위를 사용하여 정립및 복벽을 통해 세로 절개를 하고 복부의 가장 낮은 부분을 노출하십시오.고환을 절개까지 밀어 내고 핀셋을 사용하여 지방 층을 부드럽게 당겨 양쪽에 구형 고환을 노출시십시오. 홍채 가위를 사용하여 지방 층과 부피증을 조심스럽게 해부하고 고환을 얼음 차가운 RPMI 플러스 FBS 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 옮춥춥시튜브로 옮춥춥시다. 수확된 조직 중 하나에서 단일 셀 서스펜션을 생성하려면 50 밀리리터 튜브 위에 100 미크론 메쉬가 있는 멸균 세포 스트레이너에 장기를 배치하고, 스트레이너에 얼음 차가운 RPMI 플러스 FBS 2밀리리터를 추가합니다.5 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 으깨고 필터를 메쉬를 통해 완전히 접지 될 때까지 신선한 배지로 필터를 씻으셔도됩니다. 단일 셀 서스펜션을 원심분리를 위한 15밀리리터 튜브로 옮기고, 30% 밀도 그라데이션 배지의 5밀리리터로 펠릿을 재보선한다. 새로운 15 밀리리터 튜브에 70%밀도 그라데이션 배지의 2밀리리터 위에 세포 용액을 신중하게 층동하고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리합니다.그런 다음, 두 밀도 그라데이션 사이의 중간 단계에서 다른 원심분리를 위해 10밀리리터의 콜드 RPMI 플러스 FBS를 포함하는 새로운 15 밀리리터 튜브로 세포를 전송하고, 계산을 위해 10 밀리리터의 얼음 차가운 RPMI/FBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 재연한다. 세포순환을 유동하여 분석하기 위해 FACS 완충 농도에서 100마이크로리터당 6개의 세포로 세포를 5배 10으로 희석시키고, 샘플당 항체를 차단하는 10마이크로리터로 세포 샘플을 배양한다. 실온에서 10분 후, 실험적인 유동 세포분석 스테인링 프로토콜에 따라 96웰, 라운드 하단 플레이트의 적절한 수의 우물에 20 마이크로리터를 추가하고, 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 각 웰에 E-protein 테트라메트 믹스 20마이크로리터를 첨가한다.인큐베이션의 끝에서, 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 30분 배양에 대한 관심있는 세포 표면 항체를 세포에 추가한다. 다음으로, 세척당 FACS 버퍼 200 마이크로리터로 세포를 두 번 세척하고 신선한 FACS 버퍼 200 마이크로리터로 각 우물의 세포를 조심스럽게 재보힙합니다. 그런 다음, 유동 세포계에 대한 분석까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다.골마비및 운동 파라파증과 같은 병리학적 증상 및 징후는 인터페론 알파/베타 수용체 1 녹아웃 마우스에서 관찰되며 7일 동안 지카 바이러스를 접종한 후 접종을 하였다. 감염된 인터페론 알파/베타 수용체 1 녹아웃 동물의 체중 변화는 15일 동안 모니터링되었으며, 감염 후 4일 후 체중 감소가 처음 관찰되어 감염 후 7일째부터 감염 및 체중 회복이 시작되었습니다. 감염된 뮤린 뇌의 대표적인 이미지는 Zika 바이러스를 가진 명백한 부종 및 hyperemia 7 일 후에 접종을 드러냅니다.뮤린 지카 감염 고환의 대표적인 이미지는 감염 후 7일에서 30일로 점진적으로 감소하는 것을 보여줍니다. Zika에 감염된 두뇌 및 고환 조직 단면도의 조직 병리학 분석은 또한 감염되지 않은 통제에 비교된 파괴적인 병리학적인 변경의 효력을 보여줍니다. 매크로 및 조직 병리학 분석에서 예상대로, 높은 바이러스 부하는 또한 면역 염색에 의해 Zika 바이러스 감염 마우스의 두뇌 및 고환에서 검출됩니다.그것은 강력한 CD3 양성 T 세포 감염 후 뇌에 침투동반. Zika 바이러스 특이적 CD3 양성, CD8 양성 T 림프구는 E-단백질 테트라머 염색에 의한 Zika 바이러스 감염 및 백신 면역 마우스 에서 모두 검출된다. E-단백질 테트라머 특이적 CD8 양성 T 세포는 또한 뇌에서 검출될 수 있고 Zika 바이러스를 가진 7일 후에 접종을 고환할 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 동물 모델의 자연 감염 중 면역 유행 기관에서 병원균 별 T 세포 특성화 의 연구에서 연구원을위한 길을 열었습니다. 이 방법은 또한 다른 면역 유행 기관에 적용 될 수 있습니다., 태 반 또는 눈 등, 바이러스 성 감염 및 암 둘 다에. 이 절차에 따라, MHC-I 테트라머는 뇌 또는 고환 침투 T 세포의 분포에 액세스하기 위해 병원체 별 T 세포의 면역 조직 화학 적 또는 면역 형광 검출에 사용될 수 있다.

evaluation-zika-virus-specific-t-cell-responses-immunoprivileged

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

이 비디오는 초점 형성 분석을 통해 여러 마우스 장기에서 지카 바이러스를 정량화하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 포유류 세포 단층을 바이러스에 감염된 조직 균질액으로 감염시킨 다음 메틸 셀룰로오스를 사용하여 바이러스 확산을 방지하는 작업이 포함됩니다. 그 후, 장기 특이적 감염성을 정밀하게 정량화하고 측정할 수 있도록 면역염색을 사용합니다.

감염된 마우스의 장기에서 바이러스 역가를 정량화하기 위한 초점 형성 분석

이 비디오는 인간 병원체인 지카 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 있는 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 숙주 세포 내에서 지카 바이러스는 내재화 시 증식을 거쳐 주변 세포를 감염시키고 뚜렷한 영역 또는 바이러스 플라크를 생성합니다. 항바이러스제 역할을 하는 I형 인터페론은 바이러스 증식을 방해하여 숙주 세포 단층에서 바이러스 플라크의 형성을 방지합니다.

지카 바이러스 성장의 강력한 억제제로서 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석

두 가지 유세포 분석 기반 방법인 체외 T 세포 프라이밍 분석 및 세포 내 사이토카인 염색을 사용하여 수지상 세포의 항원 제시 능력과 마우스의 웨스트 나일 바이러스 돌연변이 감염에 대한 항원 특이적 T 세포 반응을 측정했습니다.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 감염성 cDNA 클론으로부터 감염성 Zika 바이러스의 회수를 설명합니다.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

Zika 바이러스 유도 신경 장애 Intracerebral 주입 전략을 사용 하 여 마우스 모델을 수립: 배아, 신생아, 및 성인

우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

우리는, 사용 하 여 인간의 혈 청 기본 인간 세포 감염 부 량 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대 한 기존의 면역의 효과 평가 하는 방법을 설명 합니다.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

프로토콜의 목표는 감염 다음 마우스에 있는 다중 기관에서 Zika 바이러스를 격리하고 정량화하여 바이러스성 질병을 조사하기 위하여 이용된 기술을 설명하는 것입니다.

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

배우세요 Zika 바이러스 감염 시 Ifnar1-/- 생쥐의 면역특권 장기에서 항원특이적 T 세포 반응을 평가하는 방법입니다. 테트라머 기반 흐름세포측정법으로 뇌와 고환에서 바이러스 특이 T 세포를 추적하여 면역보호 및 면역병리 기전을 규명하고 백신 효능을 평가합니다.

감염 된 Ifnar1^/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

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