Name: 절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 심근 내 면역세포를 분리하고 정량화하는 방법을 마우스 모델에서. 흐름세포분석법으로 희귀 면역세포 아형을 정확히 식별하여 심장 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (148808 148792)에 의해 지원 되었다, SE는 심 혼 및 치기 기초, 온타리오 주정부 사무실, 십 센트의 3 월, 피터 Munk 심장 연구에 대 한 테드 로저스 센터에서 직원 수상에 의해 지원 되었다 심장 센터입니다. XCC는 CIHR 밴팅 화목을 보유 하고있다. 라 심 혼 & 치기/리처드 Lewar 재학 수상 보유 하고있다.

윤리 성명:이 프로토콜을 검토 하 고 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다)에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 동물 관리에 캐나다 위원회 준수 하 고.
1. 버퍼 준비
<ol><li>HBB 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS), 2% 열 비활성화 소 혈 청, 0.2% 소 혈 청 알 부 민)을 준비 합니다. 열 10 mL 비활성화 둔감 한 혈 청 및 HBSS의 500 ml 소 혈 청 알 부 민 1 g 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
	<li>FACS 버퍼를 준비 (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 2% 열 소 혈 청, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, pH 8.0) 비활성화). 10 mL 열 비활성화 둔감 한 혈 청 및 PBS의 500 mL에 0.5 M EDTA의 1 mL를 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장 참고: 솔루션을 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 개월.</li>
</ol>2. 순환 하는 백혈구의 라벨
<ol><li>Aseptically 200 µ L/마우스의 최종 주입 볼륨에 대 한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)에 희석 하는 항 체의 1 µ g와 반대로 마우스 CD45 주입을 준비 합니다. 28.5 G 인슐린 주사기에 볼륨을 로드 하 고 멀리 빛 유지. 참고: 사용 하 여 두 개의 서로 다른 형광 색소 표시 안티 CD45 항 체 intracardiac 얼룩에서 혈관 내 (i.v. 관리 통해 스테인드) 차별화 (소화 후 스테인드, 4 단계 참조).</li>
	<li>
전 5 분 동안 적 열 램프에 꼬리를 노출 하 여 쥐 (8-12 주 이전) 따뜻한. 주의: 동물을 과열 하지 마십시오. 안전한 거리에서 램프를 유지 (> 30 cm).<ol>
<li>적절 한 장치를 사용 하 여 sternal 위치에서 동물을 제 지. 색인과 중간 손가락으로 꼬리의 기지와 엄지 및 손가락으로 꼬리의 중반 원심 지역 immobilizing 함으로써 비 지배적인 손 가진 꼬리 안정 고. 주의: 피부를 뽑아 수로 꼬리의 끝에 너무 많은 힘을 적용 되지 않습니다. 정 맥으로 향하도록 경사와 바늘을 삽입 합니다. 그것은 정 맥을 펑크 쉽게 병렬 항상 정 맥 바늘을 유지. 참고: 피가 주사기를 입력 발생할 수 있습니다 및 좋은 주입의 표시 이다. 90도 각도로 바늘을 절곡 i.v. 관리 용이 하 게 수 있습니다. 안전 사무실 확인으로 벤딩 바늘 위험을 나타낼 수 있습니다.</li>
		<li>200 µ L을 꼬리 정 맥에 정 맥 주사. 유체 흐름을 쉽게 하 고 일시적으로 혈관을 선택을 취소 해야 합니다. 주의: 저항을 충족 하는 경우에 액체를 강요 하지 마십시오. 이 바늘의 방치의 표시 이다.</li>
		<li>고통 없이 마우스 euthanizing 전에 5 분 동안 순환 항 체를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 심장 분리 및 소화
<ol><li>
CO2 를 사용 하 여 마우스를 안락사 또는 다른 제도 허용된 안락사 절차.
	<ol>
<li>CO2 안락사에 대 한 CO2 챔버에 마우스 놓고 (즉, 챔버 10 L, 2 L/min에서 칠 경우) 분당 챔버 볼륨의 20%를 채우기 비율을 설정 합니다. 호흡이 정지 될 때까지 2 분 및 모니터 마우스에 대 한 실행 합니다.</li>
		<li>CO2 를 종료 하 고 추가 1-2 분 호흡 챔버를 열기 전에 정지 했습니다 확인에 대 한 마우스를 두고 고 마우스는 마우스 처리를 진행 하기 전에 죽은 것인지 발가락 핀치를 수행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>70% 에탄올과 마우스 스프레이입니다. 복 부에 피부를 들어올리고 흉 골까지 엉덩이의 수준에서 시작 하 여 복 부 정중 선 따라 절단 하 여 마우스를 해 부 합니다. 복 부를 열고 노출 막 간 이동 합니다.</li>
	<li>
폐와 심장 puncturing 되지 않도록 주의 하면서 중간의 양쪽에 횡 경 막, 다음 갈비뼈를 잘라.
	<ol>
<li>노출 마음 필 링으로 다시 갈비뼈, 다음 컷된 먼저 왼쪽된 심 방 뒤 오른쪽 심 방. 주의: 심 방,이 기관에 포함 된 혈액을 내 뿜 기의 효율성을 줄일 수로 동맥 또는 정 맥, 부상 보장을 자를 때 주의 사용 합니다.</li>
		<li>21g 바늘으로 장착 되어 60 mL 주사기를 사용 하 여 차가운 PBS와 차가운 PBS의 15-20 mL와 하트 perfuse 부드럽게 집게와 심장의 기본을 파악 하 고 꼭대기 근처 좌 심 실에 바늘을 삽입. 우 심 실에서 절차를 반복 합니다. 적절 한 주입 흰색 폐 창백한 간 결과. 참고: 관류 수행 되어야 한다 안락사 후 5 분 이내 순환 세포와 관심의 장기를 오염 시킬 수 있는 혈액 응고를 피하기 위하여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
심장의 기지 겸 자 잡고 부드럽게 올려 심장 다음 pericardial 자루, 대동맥 및 혈관, 주요 폐 동맥을 절단 하 여 마음을 분리 합니다.
	<ol>
<li>부드럽게 보풀 깨끗 한 종이 타월에 엄지와 집게 손가락 사이의 마음을 잡고 마음을 청소 하 고 겸 심 방 및 주요 동맥 및 정 맥 및 어떤 다른 오염 물질의 잔재 해 내. 참고:는 심 방 전체를 제거 하 고 전혀 다른 조직, 혈관, 폐 등이 조직 그들의 자신의 거주 면역 세포를가지고 있는지 확인 합니다. 폐 특히 인구가 큰 면역 세포는 그 심근의 작은 인구를 마스크할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차가운 PBS의 50 µ L 5 cm 플라스틱 접시에 마음을 놓습니다.
	<ol>
<li>보이는 아무 조각이 있다 그리고 그것이 부드러운 일관성 때까지 곡선된 해가 위를 사용 하 여 마음을 말하다. 참고: 조직 손실을 최소화 하기 위해 자르고 동안 접시의 포함 된 영역에서 마음을 유지 하려고 합니다.</li>
		<li>Thetrituratedheart 조직 2 mL microcentrifuge 튜브와 함께 800 µ L 찬 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)으로 곡선된 집게를 사용 하 여 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나, 60 U/mL hyaluronidase 유형 I-S의, 그리고 DNase의 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase 추가-각 샘플을.
	<ol>
<li>45-60 분 50 rpm에서 락 통에 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
소화, 짧게 소용돌이 샘플 후 (20 s) 즉시 샘플 4 ° c.에 계속 하 얼음에 장소
	<ol>
<li>1 mL pipettor를 사용 하 여 플라스틱 샘플 아래로 조직 샘플 균질 및 피 펫 팁을 방해할 하지 않습니다 때까지. 참고: 플라스틱을 특정 한 횟수를 정의 재현성을 증가할 수 있습니다. 마음은 최적의 소화 되지, 심근의 조각 피펫으로 방해 수 있습니다. 부드럽게 microcentrifuge 튜브에 대 한 피 펫 팁을 연 삭 균질 직물의 더 큰 조각을 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미리 젖은 차가운 HBB의 1 mL 50 mL 원뿔 튜브에 40 µ m 셀 스 트레이너.
	<ol>
<li>무 균된 샘플 필터에 추가 하 고 차가운 HBB의 12-14 mL를 천천히 붓는 의해 통해 세척.</li>
		<li>전송 필터링 이라는 15 mL 원뿔 튜브 샘플 및 4 ° c.에 계속</li>
	</ol>
</li>
	<li>
4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 샘플 상쾌한에서 발음.
	<ol>
<li>각 샘플에 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse. Vortexing에 의해 샘플을 resuspend 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>세포의 용 해 완료 되 면 추가 5-8 mL의 차가운 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 혈을 중지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 x gfor 4 ° c.에서 5 분에 샘플을 원심 상쾌한에서 발음.</li>
	<li>각 샘플을 microcentrifuge 이라는 1.5 mL 튜브에 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기까지 2 h 4 ° c.에 저장 된 샘플</li>
</ol>4. flow Cytometry 얼룩이 지 고 분석
<ol><li>
4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 샘플
	<ol>
<li>일반적인 항 체 바인딩을 줄이기 위해 희석 1: 100 안티-CD16/CD32 및 Monocyte 차단 (1:20) 샘플 당 50 µ L FACS에 대 한 회계 ( 재료의 표참조). 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>샘플 당 FACS의 50 µ L에 대 한 항 체 희석 (각 항 체에 대 한 1: 250) 회계를 준비 합니다. 참고: 생존 염료를 포함할 수 있습니다 항 체 칵테일에 죽은 세포를 제외 하기 위하여. 또는, 사용 (그림 1C 와 D) 흐름 분석에 의해 작은 크기 제외 될 수 있습니다.</li>
		<li>세척, 없이 항 체 각각 샘플링 하 고 믹스 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 하 고 샘플 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 각 샘플에 600 µ L FACS를 추가</li>
	<li>상쾌한 오프 aspirate와 300 µ L FACS에 펠 릿을 resuspend. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 유지. 참고: DAPI, 등 일부 생존 염료, cytometry를 실행 하기 전에 10 분 이내 얼룩이 필요 합니다.</li>
	<li>Cytometry 분석 ( 그림 1 및 2참조) 다음 3 h 이내. 더 이상 시간이 필요, 단기 고정 낮은 농도 paraformaldehyde를 사용 하 여 경우 (0.5-1 %PBS) 얼룩을 보존 하는 것이 좋습니다. 참고: 그것은 좋습니다 흐름 cytometer의 응용의 방해를 방지 하기 위해 시작 흐름 cytometry 분석 전에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플을 필터링 할.</li>
</ol>

<ol><li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+Immunopathology+Research%22%5BJournal%5D)">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814(2012).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25349429">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
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<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li>
<li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD103%28%2B%29+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li>
<li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+migration+of+effector+CD8%2B+T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li>
<li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+CD103%2B+dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha%2B+conventional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

심근 염증, 또는 심근 염, 가장 심혈 관 질환의 기능입니다. 그러나, 심근 질병이 아닌 상태에서 자체 면역 구성 요소 없는 아니다. 정상 상태 동안 많은 면역 세포에는 심근 있으며 유지 보수 및 보호의 필수적인 역할. 셀의 이러한 다양 한 인구 특성 것 없었을이 프로토콜에서 제시 하는 것과 같은 방법 없이 불가능 하다.
심근의 기계 및 효소 소화의 조합 분석, 흐름 cytometry 또는 immunomagnetic 구슬 격리 등의 다른 방법으로 조합에 사용할 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 격리를 허용 합니다. 현재 방법에 관한 몇 가지 고려 사항 계정으로 촬영 해야 합니다. 첫째, 모든 우리의 분석; 심근 내 인구를 참조 이들은 자신의 작업 전문된 조직으로는 심 방 우리의 분석에서 배제 합니다. 둘째, 효소 사용 양의 소화 효소를 사용 하 여 다른 소스에서 설정에 도움을 활동 단위로 표현 됩니다. 그러나, 효소의 최종 농도와 소화의 시간 경험 주의자 최적화가 좋습니다, 크게 ...

심근 긴장 또는 부상, 허 혈 성 등 (국 소 빈 혈 reperfusion 또는 심근 경색)의 다른 형태와 비-허 혈 성 고혈압 (심근 염), 아니라 회복 및 보호, 염증 세포의 모집 홍보 병원 성 속성입니다. 1891, 빠르면 Romberg 처음 발진 티 푸 스, 성 홍 열1감염 환자의 심근에 세포 침투의 존재를 설명. 그러나, 심장 면역 세포의 상세한 연구 고급 immunophenotyping 기술 개발이 필요합니다. 그 결과, 최근에 우리가 안정 상태 동안 필수적인 유지 관리 역할을 가진 면역 세포의 다양 한 인구는 심근 내에 있는 이해 하기 시작 했습니다.
조직학, 되었으며 여전히 염증 동안 심장 면역 세포의 특성을 가장 일반적인 방법입니다. 그러나, 조직학 나타내는 유용한 진단 도구, 심장 면역 세포의 연구에 사용 중요 한 제한이 있다. 심근에 있는 면역 세포 총 세포의 아주 작은 비율을 대표 하 고 비례적으로 엄청난 공간에 더 많거나 적은 고르게 배포 됩니다. 마찬가지로, 여러 형태의 심장 염증, 바이러스 성 심근 염 등 염증의 초점 패턴을 표시합니다. 이 의미는 심장의 면역 시스템의 정확한 분석 종종 조직학 샘플링, 바이어스를 줄이기 위해 비용을 증가 시키기의 더 높은 학위를 필요로 합니다. 또한, 조직학 매우 제한 된 양의 셀 식별 (예: 매개 변수 개수)에 유용한 정보를 제공합니다. 여러 식 마커 (를 포함 하 여 표면 마커, 녹음 방송 요인 또는 분 비 분자)의 사용을 필요로 하는 셀의 하위 집합의 증가 수, cytometry immunophenotyping를 위한 가장 강력한 도구 자체를 설립 했다 저가 및 높은 처리량
Immunophenotyping 기술의 사용은 세포의 많은 수의 단일 세포 분석에 대 한 허용 하는 효율적인 소화 프로토콜의 개발에 밀접 하 게 의존. 세포 추출의 철저 한 프로토콜의 개발 심장 면역학의 연구 기회의 새로운 창을 열었습니다. 소화, cytometry 및 transcriptomics의 조합을 통해 대 식 세포와 수지상 세포에에서의 주요 인구 특징된2,3되었습니다. 정상 상태 동안 심장 면역 세포의 가장 풍부한 인구는 CD64+MerTK+ 세포, 더 분할 될 수 있다는 CCR2 또는 CD11c2의 그들의 표정에 따라. CCR2+ 세포 성인 골 수 조에서 발생 한 반면 대부분 CCR2의 MHC-II에 대 한 높은 또는 낮은 수준의 표현할 수,- 대 식 세포는 태아 근원의 주로 이다. 대 식 세포 수리4 부상 또는 안정 상태에서 전기 연결6 을 지 원하는 동안 파편5 의 제거 등의 주요 기능을 수행 합니다. 다른 형태의 염증 동안 Ly6C안녕하세요 MHC-IIlo CD64int monocytes의 중요 한 유입 발생는 나중에 Ly6C안녕하세요 CCR2 차별화+ 세포2,7 . 현저 하 게 더 작고, 그러나 중요 한, 인구에서 건강 한 개인의 심근 세포의 수지상 세포8,9로 구성 된다. 심장 기존의 DCs (cDCs)의 두 가지 주요 하위 집합을 최근 특징 되었습니다: cDC1 (CD103+ Dc)와 cDC2 (CD11b+ Dc). DCs 감염8 에 대 한 방어에 중요 한 역할을 재생 하지만 또한 심근 경색9중 특히 염증, 동안 자기 부상을 홍보할 수 있습니다.
여기, 우리가 마우스 심근에서 가능한 심장 면역 세포의 분리에 대 한 간단한 방법을 설명합니다. 메서드를 사용 하면 단일 셀 서 스 분석, 또는 추가 정화, 교류 cytometry 정렬 또는 자석 구슬 농축 수를 얻기 위하여 셀 스 트레이너 여과와 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다. Extravascular 심근 세포의 정확한 측정 심장 microvasculature의 혈 류에서 가능한 오염 물질을 제거 하기 위해 심장 관류를 필요 합니다. 또한, 우리는 더 심근 세포 Galkina 외. 프로토콜10에 따라 혈관 내 오염 물질에서 차별화 하는 데 사용할 수 있는 면역 세포의 혈관 내 라벨의 단계는 선택 사항 제시. 마지막으로, 우리는 주요 대 식 세포 및 cDC 모집단을 식별 하는 기본적인 흐름 cytometry 분석을 제시.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s 균형 잡힌 소금 용액</td><td></td><td>Wisent 311-511-CL</td><td>1x HBSS</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청</td><td>시그마</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td></td></tr><tr><td>진공 필터, 0.2 &micro; m Filtropur V50</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.001</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 1cc 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>60mL 주사기</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td> from <td>Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>히알루로니다아제 I-S</td><td>시그마</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>시그마</td><td>D4513</td><td>소 췌장에서 추출한</td></tr><tr><td>세포 여과기, 40 &마이크로; m Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액</td><td>Lonza</td><td>10-546E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 안티-마우스/인간 CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>APC/Cy7 안티-마우스 Ly-6c</td><td>Biolegend</td><td>128025</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>APC 안티-마우스 CD103</td><td>Biolegend</td><td>121414</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>PE 안티 마우스 Ly-6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>퍼시픽 블루 안티 마우스 I-Ab</td><td>Biolegend</td><td>116422</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD64 (FcgRI)</td><td>Biolegend</td><td>139315</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>PE/Cy7 안티 마우스 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103113</td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 안티 마우스 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>1:40 희석</td></tr><tr><td>TruStain fcX (안티 마우스 CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>True-Stain Monocyte Blocker</td><td>Biolegend</td><td>426101</td><td>1:20 희석</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar Inc</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr><tr><td>마우스: BATF3-/-</td><td>잭슨 연구소</td><td>JAX: 013755</td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 심장의 extravascular 면역 세포의 식별

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

면역 체계가 건강 한 심장의 필수적인 구성 요소입니다. 심근은 정상 상태와 다른 형태의 염증 동안 기능 구획과 다른 면역 세포 하위 집합의 풍부한 인구에 게 가정. 최근까지 연구에서에서 면역 세포의 현미경의 사용을 요구 하거나 심한 염증 동안 충분 한 감도 제공 하지만 하지 못했습니다 자신 있게 제대로 개발된 소화 프로토콜 식별 작은-하지만 키-인구 정상 상태 동안 셀입니다. 여기, 우리는 간단한 방법 결합 효소 (콜라, hyaluronidase DNAse)와 기계적 소화 murine 마음 앞에 작은 차별화에 놓여있는지 분류 항 체의 혈관 내 관리의 논의 하지만 피할 수 없는 혈관 내 세포 오염 물질입니다. 이 방법은 생성 식별 형질, 정량화, cytometry에 의해 분석 하거나 더 형광 활성화 된 세포 분류와 마그네틱 비드 분리 정화 수 있는 분리 가능한 세포의 현 탁 액 transcriptional 분석 또는 생체 외에서 연구. 우리는 주요 대 식 세포와 수지상 세포 인구 중심의 차별화 하는 단계별 흐름 cytometric 분석의 예를 포함 합니다. 중간 크기의 실험 (10 마음)에 대 한 절차의 완료는 2-3 h를 요구 한다.

날짜 하려면, 좋은 방법 cardiomyocytes 같은 다른 심장 세포 구성 요소에서 면역 세포를 분리 설계 되었습니다. 따라서, cytometry에 의해 심장 단일 세포 현 탁 액의 분석 단일 세포 및 작은 크기 제외 제어그림 1(A) 면역 세포 인구를 식별 하는 CD45와 미리 게이팅 필요 합니다. 또는, 생존 얼룩이 죽은 세포를 제외 하려면 수행할 수 있습니다. 소형 제외 및 생존 염료 얼룩이 죽은 세포 (그림 1B 와 1 D) 제외 거의 동일한 방법을 나타냅니다. 그것은 좋습니다 소화 절차 후 곧 얼룩이 지는 항 체와 함께 진행 하 고 항상 4 ° C에 세포 현 탁 액을 유지 하는 세포의 생존 수 있습니다 부패로. 이 절차는 일반적으로 실행 가능한 면역 세포의 약 8...

이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

이 방법은 정상 상태와 질병 상태 모두에서 심장 내 면역 세포 하위 집합의 구성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 드문 하위 집합을 포함한 심장 면역 세포 집단의 정확한 면역 표현형 분석에 사용할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 비교적 간단합니다.그러나 꼬리 정맥 주사는 어려울 수 있으므로 실험 동물을 사용하기 전에 편안해질 때까지 이 기술을 연습하는 것이 중요합니다. 순환하는 백혈구를 라벨링하기 위해 PBS에 갓 준비한 마우스 형광단 접합 항-CD45 항체 200마이크로리터를 28.5게이지 인슐린 주사기에 로드하고 12주 된 마우스 8마리를 섭씨 35-41도로 설정된 순환 물 담요에 5-10분 동안 예열합니다. 꼬리 정맥이 확장되면 흉골 위치에 있는 첫 번째 동물을 적절한 억제 장치로 구속합니다.꼬리 정맥이 충분히 확장되지 않으면 꼬리를 섭씨 36-40도의 물에 1-2분 동안 담그십시오. 꼬리 정맥이 준비되면 에탄올을 70% 적신 거즈로 주입 부위를 면봉으로 닦고 검지와 중지로 꼬리 아랫부분을, 엄지와 약지로 꼬리의 중간 원위 부분을 고정합니다. 바늘 경사면이 위로 향하게 하고 정맥과 평행하게 잡고 바늘을 확장된 꼬리 정맥에 삽입하고 전체 항체를 정맥 주사합니다.그런 다음 인도적 안락사 전에 항체가 5분 동안 순환하도록 합니다. 심장을 적출하려면 마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 복부 피부를 들어 올려 엉덩이에서 흉골까지 복부 정중선을 따라 복부를 엽니다. 복막을 열고 간을 움직여 횡격막을 노출시킵니다.횡격막과 정중선 양쪽의 갈비뼈를 자르고 폐와 심장에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. 좌우 심방을 절개하기 전에 갈비뼈를 벗겨 심장을 노출시킵니다. 집게로 심장의 아랫부분을 부드럽게 잡고 60ml 주사기에 부착된 21게이지 바늘을 정점 근처의 좌심실에 삽입하고 15-20ml의 차가운 PBS를 심장에 관류시킵니다.심장의 적절한 관류는 혈관 내 오염 물질을 피하는 데 필수적입니다. 따라서 안락사 후 응고된 혈액으로 인한 오염을 피하기 위해 신속하게 심장을 해부하고 관류하도록 주의하십시오. 방금 보여준 대로 우심실을 관류한 후 하얀 폐와 창백한 간을 관찰해야 합니다.겸자로 심장의 기저부를 잡고 심장을 부드럽게 위로 당겨 주요 폐동맥과 정맥, 대동맥 및 심낭을 잘라 심장 조직을 분리합니다. 엄지와 검지 사이에 심장을 부드럽게 잡고 보푸라기가 없는 깨끗한 종이 타월로 심장을 조심스럽게 청소하고 집게를 사용하여 심방과 주요 동맥 및 정맥의 잔여물 또는 기타 오염 물질을 제거합니다. 세척된 심장을 5cm 플라스틱 접시에 넣고 차가운 PBS 50마이크로리터를 넣는다.구부러진 해부 가위를 사용하여 눈에 보이는 조각이 없고 조직이 매끄럽고 두꺼운 농도를 가질 때까지 심장을 다집니다. 구부러진 집게를 사용하여 800마이크로리터의 차가운 DMEM이 들어 있는 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 조직을 옮깁니다. 콜라겐 분해 효소, DNase 및 히알루로니다아제를 보충하고 섭씨 37도, 50rpm에서 45-60분 동안 배양합니다.소화 와류가 끝나면 20초 동안 샘플을 채취하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 샘플은 실온에 방치하면 일부 표면 항원이 내재화될 수 있으므로 달리 명시되지 않는 한 항상 섭씨 4도에서 보관해야 합니다. 그런 다음 140마이크로리터 세포 여과기를 샘플당 50ml 원뿔형 튜브에 1ml의 차가운 HBB와 함께 사전 적십니다.1ml 피펫을 사용하여 조직 현탁액이 균질하고 피펫 팁을 막지 않을 때까지 샘플을 피펫팅하고 균질화된 샘플을 필터에 추가합니다. 샘플당 12-14ml의 차가운 HBB로 필터를 통해 샘플을 천천히 세척하고 여과된 샘플을 얼음 위의 라벨이 붙은 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 좋은 소화는 필터에 심장 잔여물이 없다는 것으로 입증됩니다.원심분리로 샘플을 수집하고 상층액을 제거합니다. 각 샘플에 1ml의 염화암모늄 칼륨 용해 완충액을 추가합니다. 짧은 와류로 샘플을 재현탁시킨 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 5-8ml의 차가운 HBSS로 용혈을 멈춥니다. 원심분리를 통해 샘플을 수집하고 펠릿을 1ml의 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 완충액에 재현탁시킨 다음 다른 원심분리를 위해 개별 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석으로 샘플을 분석하기 위해 50마이크로리터의 항-CD16/CD32 항체와 단핵구 차단제에 펠릿을 재현탁시켜 실온에서 15분 배양 동안 비특이적 항체 결합을 줄입니다.세척하지 않고 50마이크로리터의 항체 마스터 믹스를 각 샘플에 첨가하고 혼합하여 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브당 600마이크로리터의 FACS 완충액으로 샘플을 세척하고 펠릿을 300마이크로리터의 새로운 FACS 완충액 또는 1%파라포름알데히드에 재현탁합니다. 그런 다음 표준 유동 분석 프로토콜에 따라 유세포 분석으로 심장 백혈구를 분석합니다.유세포 분석에 의한 심장 단세포 현탁액을 분석하려면 심장의 비면역 세포와 면역 세포를 구별하기 위해 CD45로 사전 게이팅한 다음 단일 세포 및 소형 배제 게이팅이 필요합니다. CD64 발현으로 확인되는 대식세포는 심장의 주요 면역 세포 집단으로, 모든 면역 세포의 60-70%를 차지합니다. 기존의 심장 수지상 세포는 높은 수준의 MHC class II 및 CD11c를 발현하는 CD64 음성 세포입니다.이러한 세포는 CD103 또는 CD11b의 발현에 따라 추가로 분할할 수 있으며 대식세포에 비해 훨씬 작은 심장 하위 집단을 나타냅니다. 심근의 단일 세포 현탁액에 대한 유세포 분석을 사용하면 심장 내의 작은 백혈구 하위 집단을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 유세포 분석 분석을 사용하여 야생형 심근과 Batf3가 결핍된 마우스의 면역 세포를 비교하면 녹아웃 동물 내에서 CD103 양성 수지상 세포의 결핍을 확인할 수 있습니다.또한, 이 분석은 Batf3가 결핍된 동물에서 다른 심장 집단의 구성에 대한 유의미한 변화가 없음을 밝혀냈으며, 이는 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 이러한 효소 및 기계적 소화의 결합된 방법을 사용하여 달성할 수 있는 민감도의 정도를 보여주었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 세포 분리의 생존 가능성을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 실험 조건에 따라 분해의 시간과 효소 농도를 최적화하는 것이 좋습니다.이 절차에 따라 단일 세포 RNA 염기서열분석, 기능 분석 및 자기 비드 분리와 같은 다른 방법을 수행하여 분리된 세포의 기능에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마음에서 기능적 면역 세포를 분리를위한이 방법은 이러한 세포의 감소 반응의 결과로, 원치 않는 면역 세포 활성화의 원인이 collagenase의 소화의 종래의 방법에 대한 대안을 제공합니다. 격리 우리의 방법은 효소 소화와 관련된 문제를 피함으로써 기능 심장병 면역 세포를 산출.

심장 기능 면역 세포의 분리

주요 조직 적합성 복합체 클래스 II dextramers 직접 염색으로 뇌와 심장 자기 반응성 CD4 T 세포를 감지하는 프로토콜은이 보고서에 설명되어 있습니다. 종합적인 분석을 위해, 시츄 항원 특이 CD4 + T 세포의 빈도를 열거하는 신뢰할 수있는 방법도 고안되어있다.

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

이 문서에서는, endomyocardial bioptic 샘플의 arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 mesenchymal stromal 세포를 분리 하는 방법을 제공 됩니다. 그들의 특성 및 그들의 adipogenic 차별화를 강화 하는 프로토콜을 설명 합니다.

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

여기서 제시된 프로토콜은 효소 소화를 통해 단일 세포 현탁액을 준비시킴으로써 인간 및 마우스 심근으로부터 대식세포 및 기타 비면역 세포의 다양한 서브세트를 분리하는 프로토콜이다. 유세포분석 기반 식별 및 절연 대식세포의 특성화를 위한 게이팅 방식도 제시된다.

인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

이 연구의 목표는 성인 심장에서 심근세포를 재현하고 DNA 함량 및 핵형성을 측정하는 방법을 개발하는 것입니다.

면역 세포 화학 및 Ploidy 분석을 위한 고정된 심혼에서 심근세포의 격리

우리는 소화 완충제에서 순차적 조직 소화를 통해 쥐 심혼에서 내심 과 관상 관상 내피 세포의 격리를 위한 프로토콜을 제시하고, 재발하는 원심분리기 주기에서 세포 수집 및 반대로 쥐 CD31 마이크로비드를 사용하여 세포 정화.

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 심장의 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN) 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 단계별 접근법을 제공한다.

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

이 프로토콜은 쥐 폐 정맥의 현미경 유도 분리 및 면역형광 염색을 보여줍니다. 좌심방, 폐정맥 및 해당 폐가 포함된 조직 샘플을 준비하고 심장 Troponin T 및 Connexin 43에 대해 염색합니다.

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

이 연구는 혈관벽 상주 CD34+ 줄기세포(CD34+ VW-SC)의 분리, 배양 및 기능적 결정을 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립했습니다. 이 따르기 쉽고 시간 효율적인 분리 방법은 다른 연구자가 심혈관 질환과 관련된 잠재적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

배우세요 심근 내 면역세포를 분리하고 정량화하는 방법을 마우스 모델에서. 흐름세포분석법으로 희귀 면역세포 아형을 정확히 식별하여 심장 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

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