Name: Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 마우스 모델에서 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 Th1 차별화를 측정하는 방법을. GM-CSF 골수 유래 수지상 세포를 이용한 이 기술은 면역학 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 영어 편집 닥터 사이먼 바 틀을 감사합니다. 이 연구는 Instituto de에서 교부 금에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), 미겔 세르 프로그램과 Fundación 라몬 Areces; 함께 Fondo Europeo 드 개발 지역 (페더)에서 공동 자금. CNIC 경제 산업성, 산업 및 경쟁력 (MEIC), 그리고 프로 CNIC 재단에서 지원 하 고는 세 베로 오 초아 센터의 우수 (SEV-2015-0505). RTF Fundación 라몬 Areces CNIC, VZG ISCIII, BHF Instituto de에 의해 의해 의해 설립 Investigación Sanitaria 병원 12 드 Octubre (imas12)와 ISCIII 미겔 세르 프로그램 및 imas12에 의해 JMG-G.

실험 절차 Fundación 센트 나시오날 드에 의해 승인 되었다 Investigaciones Cardiovasculares 카를로스 3 세 (CNIC)와 스페인과 유럽 지침에 따라 지방의 Autónoma 드 마드리드. 마우스는 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 자란 했다 그리고 이산화탄소 (CO2) 흡입에 의해 안락사 되었다.
1. 절연 Tibias 화관에서 마우스 골 수 세포의
참고: C57BL/6 congenic 마우스 스트레인 운반 차동 백혈구 마커는 Ptprc는는, 야생-타입 C57BL 긴장 Ptprcb 대립 유전자, CD45.2 또는 Ly5.2로 알려진, 수행 하는 반면에, CD45.1 또는 Ly5.1로 일반적으로 인식 합니다. CD45.1 및 CD45.2 변종 cytometry 항 체를 사용 하 여 구분할 수 있습니다. CD45.1, CD45.2, 및 CD45.1/CD45.2 쥐 입양 전송, cytometry에 의해 뚜렷한 세포 인구의 추적을 허용에 대 한 셀 소스 또는 받는 사람으로 사용할 수 있습니다. 나이 우선적으로 사용-및 나이의 12 주 아래 섹스 일치 하는 남성 또는 여성 쥐.
<ol><li>
화관과 Tibias의 준비
	<ol>
<li>제도 동물 보호 위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용 하 여 마우스를 안락사</li>
		<li>70% 에탄올과 동물 표면에 분사 하 여 뒷 다리 사지를 소독.</li>
		<li>살 균가 위, 집게와 scalpels 사용 합니다. 메스로 피부에 상처를 만들고 후부 사지를 포함 하는 피부를 포함 하 여 마우스의 원심 부분에서 피부를 제거. 낮은 종 아리 근육 주위 피부 껍질과 다리에서 피부를 완전히 제거 (그림 2A, 2B).</li>
		<li>메스를 사용 하 여 대 퇴 골에서 quadriceps 근육을 구분 합니다. 고관절 대 퇴 골 머리 깨지 않고 disarticulate. 메스 (그림 2C, 2D)를 사용 하 여 경골에서 근육을 제거 합니다. 뼈 끝을 깨지 않고 경골에서 대 퇴 골을 구분 합니다.</li>
		<li>10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스 얼음 1 x 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체에 포함 된 배양 접시에서 뼈를 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 격리 참고: 모든 후속 단계는 문화 후드와 오염을 피하기 위하여 살 균 물자로 수행 되어야 합니다.<ol>
<li>멸 균 페 트리 접시에 메스와 각 뼈의 인접 하 고 원심 끝을 잘라 신중 하 게.</li>
		<li>완전 따뜻한 RPMI 매체 (RPMI + 10 %FBS, 2 mM EDTA, 1% 페니실린/스, 20 mM HEPES, 55 μ M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate 및 2 m m L-글루타민)의 10 ml 전체 볼륨으로 반복적으로 뼈를 플러시. 1 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 사용 하 여 양쪽에서 뼈를 플러시.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브 70 µ m 나일론 웹 필터 장착 하는 effluate를 전송 합니다. 신중 하 게 부드러운 교 반 및 pipetting 파편 및 셀 대기업을 분리 하십시오.</li>
		<li>셀 서 스 펜 션 (RT) 실 온에서 10 분 동안 250 x g 에서 원심</li>
		<li>감기-적혈구 세포의 용 해 버퍼 (0.15 M NH4Cl + 1 m m KHCO3 + 0.1 m m EDTA, 1 N HCl, 0.4 µ m 살 균 필터링, 및 4 ° C에서 저장과 7.2에 조정된 산도)의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 떨고 수동 5 분 동안 얼음에 유지 합니다.</li>
		<li>비활성화 하 고 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 씻어 감기 버퍼 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) + 2 mM EDTA + 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) x 1) 10 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
		<li>완전 한 RPMI 매체 및 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 25 mL로 세포 세척</li>
		<li>완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀 resuspend 세포 현 탁 액 trypan 블루와 함께 1: 1의 혼합 50 µ L. 현미경으로 세 실에 휴대폰 번호를 확인 합니다. 수식을 사용 하 여 셀 수를 계산: 셀/mL = [(비-얼룩진 셀 수/4) 2 x 10000 x]12. 참고:이 방법은 수율 40 x 106 60 x 106 12 주 된 C57BL/6 마우스에 감염 되지 않은 8 당 골 수 세포 뼈.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DC 분화, 성숙 및 항 원 로드
<ol><li>
BM 셀 수확
	<ol>
<li>6 잘 초 저-첨부 매체, 일반적으로 잘 당 5 mL의 mL 당 106 세포 표면 접시에 완전 한 문화 씨앗 차별화 된 대 식 세포는 문화 판에 연결 됩니다. 후 12 h, 주로 포함 monocytes, 6 잘 플레이트, 준수 대 식 세포와 오래 된 6 잘 플레이트를 폐기 시키려면 상쾌한 전송.</li>
		<li>세포 분화를 촉진 하는 비 부착 한 세포 상업적으로 재조합 murine GM-CSF 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 얻은 20 ng/mL를 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 당 일반적으로 5 mL에 mL 당 5 x 105 셀에서 문화 및 매일 관찰 합니다.</li>
		<li>3 일 마다 중단된 셀 아래로 회전 5 mm EDTA PBS에 부착 세포를 수집 하 고 스핀 다운. 결합 하 고 5 × 105 셀/mL 신선한 매체 20 ng/mL rm-GM-CSF를 포함에서 resuspend.</li>
		<li>8 일에 위와 같이 부착 및 분리 된 세포를 수집 하 고 조직 문화 치료 비 멸 균 페 트리 접시, 유도 높은 MHC-II에에서 24 h에 대 한 중간 포함 20 ng/mL GM-CSF에서에서 5 x 105 셀/mL와 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) resuspend CD80 그리고 CD86 식.</li>
		<li>Cytometry 단계 2.2에에서 표시 된에 의해 확인 DC 차별화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry 분화 및 성숙 분석 흐름.
	<ol>
<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>마우스 Fc 수용 체 차단 (안티 마우스 CD16/CD32 IgG2b 항 체 순화) 제조업체의 지침에 따라 4 ° C에서 15 분에서 resuspended 셀 펠 릿을 배양 하 여 블록 Fc 수용 체.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
		<li>각 프로브에 대 한 흐름 cytometry 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 4 ° c.의 300 µ L 250000 셀 resuspend</li>
		<li>96 잘 접시에 잘 당 셀 솔루션의 30 µ L를 전송 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 포함 하는 항 체의 30 µ L 추가 버퍼를 각 제조업체의 표시를 따라 잘. 4 ° c.에 20 분에 대 한 항 체와 세포를 품 어 참고: 일반적으로 고용 마커 Dc, monocytes, 대 식 세포는 CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 그리고 CD86 (그림 3).</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 죽은 세포 (예를 들어, propidium 요오드 화물, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 아민 반응성 염료를 제외 마커를 포함 하는 흐름 cytometry 버퍼의 당 200 µ L에서 resuspend ) 제조 업체의 권장된 농도13에.</li>
		<li>교류 cytometry 튜브 샘플을 전송 하 고 죽은 세포를 제외 하 고 0, 3, 6, 9 일에 교류 cytometry 분석을 수행 하 여 세포 분화를 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DC 항 로드 합니다.
	<ol>
<li>8 일에 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 200 µ L 매체에 산 탄을 resuspend (RPMI + 10 %FBS 항생제 없이). 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>10 µ g/mL OVAp (323-339;와 Dc를 품 어 ISQAVHAAHAEINEAGR) 1 x 107 Dc에서에서 매체의 1 mL 당 (RMPI + 1 %FBS) 37 ° c.에 적어도 30 분 동안 플라스틱 튜브에 OVAp 로드 Dc를 사용 하 여 부정적인 제어 조건으로.</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 고 200 µ L 완전 한 RPMI 매체에 산 탄을 resuspend. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 200 µ L 매체에 산 탄을 resuspend (RPMI + 10 %FBS) 2 x 106 셀/mL에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. OTII 마우스에서 순진한 CD4 T 세포의 고립
참고:이 방법은 12 주 된 C57BL/6 마우스에 감염 되지 않은 8 당 약 100 x 106 spleenocytes를 생성합니다. 남성과 여성 모두 사용할 수 있습니다. CD4 T 세포는 비장 또는 림프절;에서 고립 될 수 있다 CD4 T 세포는 각각 대략 25% 및이 기관에 있는 세포의 50%를 위한 계정. 무 균 조건에서 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>사 타 구니, 겨드랑이, 상 완, 자 궁 경부, 그리고 mesenteric 림프절과 비장 OTII 유전자 변형 마우스 (그림 4)에서 분리 하 고 플라스틱 페 트리 접시 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 10 mL 그들을 전송.</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체의 2 mL와 함께 셀 여과기를 헹 구 고 50 mL 튜브에서 제거. 전송 림프절과 비장 70 µ m 셀 스 트레이너를 50ml 튜브에 배치. (그림 5) 주사기 플런저를 사용 하 여 균질 하 고 매체 추가 최대 15 mL.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 하 고 완전 한 RPMI 매체의 15 mL에 펠 릿을 resuspend. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>비장 세포 현 탁 액 셀 펠 릿 resuspend 및 단계 1.2.5에서 붉은 혈액 세포를 lyse.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체와 실시간에 5 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 25 mL로 세포 세척</li>
	<li>중간의 5 mL에 셀 resuspend Trypan 파랑 세포 현 탁 액 1: 1의 50 µ L를 혼합. 현미경 아래 세 챔버를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다. 수식을 사용 하 여 셀 수를 계산: 셀/mL = [(비-얼룩진 셀 수/4) 2 x 10000 x]12.</li>
	<li>2.2.2 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 셀 CD4 T 세포의 부정적인 선택 나중에 얼음에 30 분을 CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (난 Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25, DX5 biotinylated 항 체의 1:800 희석을 품 어.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라와 streptavidin 입히는 자기 microbeads의 필요한 금액을 계산 하 고 CD4 T 세포는 자기 세포 구분 및 적절 한 사용 하 여 격리 셀 수와 구슬의 용량에 따라, 분리의 열 있습니다.</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀 resuspend 고 단계 3.7에서에서 설명한 대로 라이브 셀을 계산 하는 동안 얼음에 그들을 유지.</li>
	<li>2 x 105 셀을 추출 하 고 수집 된 셀 사용 하 여 안티 CD4, CD3, B220, CD8 항 체 희석 제조 업체 추천을 사용 하 여 교류 cytometer에서 형광 항 체의 순도 확인 하십시오.</li>
	<li>격리 된 순진한 CD4/OTII T 세포 얼룩, 500 µ L 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 106 셀 resuspend. 준비 하는 500 µ L 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 포함 된 중요 한 셀 추적 염료의 최종 제조업체 권장 농도 더블. 천천히 세포 현 탁 액을 세포 추적 솔루션을 추가 하 여 두 솔루션을 혼합. 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체와 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리기의 5 mL로 세포 세척 이 단계를 두 번 반복 합니다. 1 x 107셀/mL에서 완전 한 RPMI 매체의 1 mL에 셀 resuspend</li>
</ol>4. Vivo에서 활성화, 확산 및 Th1 차별화 분석 결과
참고: 중요 한 셀 추적 염료 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 및 다른 succinimidyl 에스테 르 기반 염료, 기쁘게 생각 하 고 다른 파장에서 형광을 방출, 널리 이용 된다 림프 톨 확산을 평가 하기 위해 흐름에 의해 그들의 높은 형광 강도, 긴 수명, 낮은 다양성, 및 낮은 독성14cytometry.
<ol><li>Adoptively 정 맥 (i.v.) 1 x 106 라이브 중요 한 셀 추적 염료 얼룩이 순진한 CD4/OTII T 셀 마우스 당 PBS의 100 µ L에 전송 합니다. 레이블이 T 세포 adoptively 꼬리 정 맥 또는 복고풍 궤도 주입15;으로 옮겨질 수 있다 두 경우 모두에서 세포 림프 기관 (그림 6A)에 홈 것입니다.</li>
	<li>도전 받는 사람 마우스 1 일 후 adoptively 100000 LPS 성숙 OVAp 로드 Dc 올리십시오 (그림 6B)에 피하 주사 (s.i.)로 전송 하 여.</li>
	<li>받는 사람 마우스에서 오 금 림프절을 수확 하 고 이전 3.1 및 3.2에 설명 된 동일한 단계를 수행 하는 단일 셀 정지의 획득까지 그들을 처리 합니다. 이렇게 하루 2 사후 예방 접종 CD4/OTII T 세포 활성화를 측정 하 고 확산 플러스 Th1 차별화를 측정 하는 5 일에.</li>
	<li>하루에 2 T 세포 활성화를 분석 하려면 얼룩 CD4, CD69와 CD25 형광 항 체와 세포 (선택적으로 CD45.1와 CD45.2) C69의 비율을 결정 하 고+CD25+ T 세포 CD4 인구. Cytometry (그림 7)에 의해 분석.</li>
	<li>5 일에 T 세포 증식을 확인 하려면 셀 c d 4와 선택적으로 CD45.1와 CD45.2에 대 한 적절 한 형광 항 체를 사용 하 여 얼룩. CD4 인구에서 중요 한 셀 추적 염료 신호 감퇴 cytometry (그림 8) 분석. 중요 한 셀 추적 염료와 각 형광 피크에 나누어 세포의 비율, 총 셀에 나누어 세포의 백분율을 표시 하는 세포에 의해 받은 셀 분할 수 등이 연구에 여러 매개 변수를 확인할 수 있습니다. 인구입니다.</li>
	<li>하루 5, Th1 차별화 플레이트 1 µ M ionomycin과 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 아세테이트 (PMA) 인큐베이터에서 37 ° C에서 6 시간을 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 200 µ L에서 96 잘 접시의 당 400000 셀을 결정 합니다. 마지막 4 h 3-10 µ g/mL brefeldin 매체에 cytokine 분 비를 차단 하는 추가 합니다.</li>
	<li>250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 번호판을 원심 96 잘 접시의 급속 한 반전으로는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>2.2.2 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 포함 된 항 체의 CD4 하 고 CD45.1 및 CD45.2 제조 업체 권장 희석에서 30 µ L에 4 ° C에서 15 분 동안 배양 하 여 세포 막 얼룩. 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1)의 150 µ L을 추가 하 여 셀을 세척 하 고 250 x g 4 ° C에서 5 분에 대 한 번호판을 원심 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1000 x g 5 분 및 4 ° c.에 대 한 번호판 실시간 원심 분리기에서 20 분 동안 2 %paraformaldehyde/1% 자당의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>세포내 permeabilization 버퍼 (1 x PBS + 0.1 %BSA, 0.01 M HEPES, 0.3% 사포닌)의 50 µ L을 추가 하 여 세포를 permeabilize, 4 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>실시간 삭제는 상쾌한에서 1000 x g 에서 PBS와 5 분 동안 원심 분리기의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>버퍼 (PBS + 0.1% 사포닌)에서 IFNγ 항 체 안티 fluorophore 활용의 30 µ L을 추가 하 여 세포내 cytokines 얼룩이 실시간에서 30 분 동안 품 어</li>
	<li>버퍼 (PBS + 0.1% 사포닌)의 150 µ L을 추가 하 여 셀을 씻어. RT에서 1000 x g 에 5 분 동안 접시를 원심 및 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>Cytometry (그림 8)에 의해 세포 인구를 분석 합니다.</li>
</ol>

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저자 공개할 게 없다

이 프로토콜은 활성화, 확산, 그리고 순진한 CD4 T 세포의 분화를 조절 하는 BM 파생 된 Dc의 용량 특성에 대 한 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 변조 CD4 T 세포의 민감성을 평가 하기 위해 BM 파생 DCs에 의해. 이 프로토콜 측정 vivo에서이러한 이벤트에는 변경 될 수 있습니다.
조사 가설에 따라 T 세포와 Dc의 여러 가지 조합은 사용할 수 있습니다. 예를 들어 하나에 노크 또는 특정 유전자 또는 CD4 T 세포 활성화, 확산, 또는 Th1 차별화의 특정 자극의 효율을 떨어뜨리는 결과 분석할 수 있습니다. Dc 또는 CD4 T에이 절차를 수행할 수 있습니다 세포 또는 세포 유형 모두에. 따라서, 야생-타입 또는 유전자 변형 쥐에서 CD4 T 세포와 야생-타입 마우스를 파생 하는 Dc와 결합할 수 있습니다.
이 프로토콜은 cytometry 및 CD45.1 및 CD45.2에 대...

CD4 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) Dc 같은 미생물 병원 체1,2면제의 필요한 중재자는. 주변 림프 기관에 CD4 T 세포 APCs3,,45에 의해 제시 하는 특정 항 원 인식에 따라 활성화 됩니다. 활성화 된 CD4 T 세포 증식 하 고 올바른 적합 한 면역 반응6,7의 개발에 필요한 별개 특정 효과 기 Th 세포로 분화. 이러한 프로세스의 제어는 유해한 조직 손상8을 생산 하지 않고는 병원 체를 죽이 적절 한 적응형 방어를 생산을 위한 중요 한. Th 셀 식 또는 표면 분자, 녹음 방송 요인과 이펙터 cytokines의 생산에 따라 정의 되 고 병원 체1응답에 필수이 고 정확한 기능을 수행. Th1 세포 부분 집합의 세포 전사 인자 T 내기와 사이토카인 인터페론 γ (IFNγ) 표현 하 고 세포내 병원 체1에 대 한 호스트 방어에 참여. 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화의 정량화는 T 세포 재생의 역할 면역 반응을 평가 하는 유용한 수단입니다.
이 프로토콜 활성화에 비보 분석의 체 외-용량 생성 BM 파생 Dc 활성화, 확산, 및 Th1 순진한 CD4 T 세포의 분화를 조절 하. 프로토콜 또한 순진한 CD4 T 세포 활성화, 격 증, 유도의 용량을 평가 하 고 Th1 분화 (그림 1). 이 다양 한 프로토콜을 특별히 조작 하거나 순전히 프로토콜 vivo에서 공부 셀 채우기 선택 못하는 circumvents. 다양 한 분자와 Dc에 치료의 효과 BM 유전자 변형된 쥐5 에서 사용 하거나 치료 또는 격리 된 BM 셀9유전자 조작에 의해 공부 될 수 있다. 마찬가지로, T 세포 응답 서로 다른 소스에서 또는 여러 가지 조작을3,,810후 입양 전송에 대 한 T 세포를 획득 하 여 탐험 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 두 가지입니다. T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화 흐름 cytometry 접근;와 분석 그리고이 vivo에서 학문, 따라서 averting 체 외에서 발생할 수 있는 변경 및 세포 유형 및 기타 요인에만 그대로 장기11에서 발견을 포함 하 여 결합.
중요 한 염료의 사용 방사능의 사용을 피하고 있는 동안 세포의 확산을 추적 하는 널리 사용 되는 기술입니다. 이 시 약으로 확산의 측정 세포 분열 후 염료 희석을 기반으로 합니다. 또한, 이러한 염료 여러 파장에서 검출 될 수 있다 그리고 쉽게 여러 형광 항 체 또는 표식 함께 cytometry에 의해 분석 된다. 우리는 어떻게 T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화 cytometry에 의해 분석 될 수 있다 표시 하 여이 프로토콜의 유틸리티를 강조 표시 합니다.

<table><tbody><tr><td>에탄올</td><td>VWR 화학</td><td>물질 20,824,365</td><td>5 L</td></tr><tr><td>가위</td><td>미세 과학 도구 (FST)</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>파인 사이언스 도구(F.S.T.)</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>파인 펜치</td><td>파인 사이언스 도구(F.S.T.)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>정밀 과학 도구(F.S.T.)</td><td>10020-00</td><td>100 블레이드 상자</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SIGMA</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td> <td>GIBCO</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>25 게이지 바늘</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>Novico</td><td>N15663</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 나일론 웹 필터</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Red blood lysis buffer</td><td>SIGMA</td><td>R7757</td><td>100 Ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>ED2SS-250</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>SIGMA</td><td>302643-25G</td><td></td></tr><tr><td>배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)</td><td>캠브렉스</td><td>BE17-737E</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>머크</td><td>8-05740-0250</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>LONZA</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>LONZA</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)</td><td>Prepotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>지질다당류(LPS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L2018</td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>v450 anti-mouse CD11b 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>560455</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD64 항체</td><td>BioLegend</td><td>139303</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD115 항체</td><td>BioLegend</td><td>135505</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD11c 항체</td><td>BioLegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 MHCII 항체</td><td>BioLegend</td><td>125507</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD86 항체</td><td>BioLegend</td><td>105011</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD80 항체</td><td>BioLegend</td><td>104713</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 튜브</td><td>Zelian</td><td>300800-1</td><td>PS 12X75 5mL</td></tr><tr><td>OTII Ovoalbumine 펩타이드</td><td>InvivoGen</td><td>323-339</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 CD8&알파; 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U500</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 IgM 항체</td><td>BioLegend</td><td>406503</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 B220 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0452-U500</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 CD19 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0193-U500</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 MHCII (I-Ab) 항체</td><td>BioLegend</td><td>115302</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 CD11b 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0112-U500</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 CD11c 항체</td><td>BioLegend</td><td>117303</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 CD44 항체</td><td>BioLegend</td><td>103003</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 비오틴화 CD25 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 비오틴화 DX5 항체</td><td>BioLegend</td><td>108903</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 코팅 마그네틱 마이크로비드</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>자기 세포 분리기</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>QuadroMACS 분리기</td></tr><tr><td>분리 컬럼</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>PE 안티 마우스 CD4 항체</td><td>BioLegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD3 항체</td><td>BioLegend</td><td>100235</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD8 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>셀 바이올렛 트레이서</td><td>Thermofisher</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD25 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 안티 마우스 CD69 항체</td><td>BioLegend</td><td>104518</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCY5.5 안티 마우스 CD45.1 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>65-0453</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD45.1 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0453</td><td></td></tr><tr><td>PECY7 안티 마우스 CD45.1 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>60-0453</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD45.2 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0454</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA)</td><td>SIGMA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td><td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Millipore</td><td>8-18715-02100</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular permeabilization buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-8333</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 IFNg 항체</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-7311-U100</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (안티 마우스 CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-U100</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL CD45.1 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade; 세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 솔루션</td><td>Thermofisher</td><td>62248</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 cd4 t 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 th1 차별화

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산, 그리고 T 도우미 1 차별화의 정량화 (Th1) 세포 면역 반응에서 T 세포의 역할을 평가 하는 유용한 방법입니다. 이 프로토콜 granulocyte macrophage 식민지 자극 요소 (GM-CSF) 파생 된 모 수석 세포 (DCs)를 골 (BM) 창시자의 체 외에서 분화를 설명 합니다. Ovalbumin 펩 티 드 (OVAp)의 입양 전송 프로토콜에 대해서도 설명 합니다-로드 GM-CSF 파생 Dc 순진한 CD4 T 세포 OTII 유전자 변형 쥐에서 vivo에서 활성화, 확산, 및 Th1 분화를 분석 하기 위하여는 전송 된 CD4 T 세포입니다. 이 프로토콜 메서드의 순전히 vivo에서 특별히 조작 하거나 공부 셀 채우기를 선택 하는 무 능력에 의해 부과 된 제한 circumvents. 또한,이 프로토콜 변경 체 외에서 발생할 수 있는 기능적 요소와 세포 유형 및만 그대로 장기에 있는 다른 요인의 영향을 포함 하 여 피할 vivo에서 환경에서 연구를 수 있습니다. 프로토콜은 DCs에 변화를 생성 하기 위한 유용한 도구와 T 세포는 적응 면역 반응, 잠재적으로 제공 하는 원본 또는 수많은 면역 관련된 질병의 개발을 이해 하는 중요 한 결과 수정.

그림 1 에서는이 프로토콜에서 설명 하는 단계를 보여 줍니다. 그림 2 에서는 분리와 마우스 BM 세포의 문화를 보여 줍니다. 이러한 문화에 GM-CSF와 LPS의 추가 허용 한다 생체 외에서 생성 하 고 Dc. 그림 3 의 성숙 분화의 흐름 cytometry 분석과 취득된 Dc OVAp 로드 GM-CSF BM 파생 된 Dc의 성숙 보여 줍니다. 그리고 고립 된 중요 한 셀 추적 염료 얼룩이 CD4/OTII T 세포 adoptively 마우스에 게 전송 됩니다. 그림 4 는 CD4/OTII T 세포의 절연에 사용 되는 림프절의 위치를 보여줍니다. 그림 5 50 mL 튜브 70 µ m 나일론 ...

여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

이 방법은 T 세포 활성화, 증식 및 Th1 분화뿐만 아니라 적응 면역의 세포 자극을 제시하는 항원에 대한 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 환경을 연구하는 동시에 체외 세포 조작을 가능하게 한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 장기 및 뼈 분리 및 입양 이식 단계가 텍스트 지침만으로는 마스터하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.골수 세포 분리를 위해 성체 쥐의 뒷다리를 70% 에탄올로 소독하고 가위를 사용하여 뒷다리를 가로질러 측면 피부를 절개합니다. 다리의 내측 부분에 가위를 삽입하고 뒷다리가 시작될 때까지 가위로 피부를 자릅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 다리에서 피부를 분리합니다.가위를 사용하여 대퇴골과 경골에서 근육을 분리하고 가위를 사용하여 고관절을 분리하여 대퇴골두를 부러뜨립니다. 그런 다음 뼈 끝을 부러뜨리지 않고 대퇴골과 경골을 분리하고 뼈를 얼음 위에 올려 놓은 완전한 배지의 페트리 접시에 넣습니다. 모든 뼈를 채취한 후 메스로 각 뼈의 근위부와 말단부를 조심스럽게 잘라내고 25게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 총 10밀리리터의 따뜻하고 완전한 RPMI 배지로 뼈를 반복적으로 세척합니다.모든 뼈가 씻겨 나오면 접시의 전체 내용물을 70마이크로미터 공극 나일론 웹 필터가 장착된 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 부드러운 교반과 피펫팅으로 파편과 세포 덩어리를 조심스럽게 제거합니다. 원심분리로 골수 세포를 수집합니다. 피펫팅으로 펠릿을 섭씨 4도의 적혈구 용해 완충액 1밀리리터에 재현탁시키고 혼합물을 얼음에서 5분 동안 배양합니다.배양이 끝나면 10ml의 PVS로 용해를 중지하고 두 번째 원심분리를 위해 25ml의 완전한 배지로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 계수를 위해 5밀리리터의 새로운 완전 배지에 세포를 재현탁시키고 세포를 다시 원심분리합니다. 2차 림프 조직 세포 분리를 위해 OT-II 형질전환 마우스에서 서혜부, 겨드랑이, 상완, 경추 및 중막 림프절 및 비장을 수집하고 2차 림프 조직을 10밀리리터의 완전한 RPMI 배지가 들어 있는 플라스틱 페트리 접시로 이동합니다.모든 조직을 채취한 후 림프절과 비장을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 담긴 70마이크로미터 세포 여과기로 옮기고 주사기 플런저를 사용하여 조직을 균질화합니다. 최대 15ml의 배지로 스트레이너를 플러시하고 원심분리로 세포를 스핀다운합니다.

an-vivo-mouse-model-to-measure-nave-cd4-t-cell-activation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

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돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

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손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는...

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마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

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다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

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마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 in vitro에서 naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 분화하는 과정을 설명합니다. 특히, 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합하면 이 분화 방법을 사용하여 naïve CD4+ T 세포에서 병원성 Th17 세포의 90% 순도를 얻을 수 있습니다.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

배우세요 마우스 모델에서 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 Th1 차별화를 측정하는 방법을. GM-CSF 골수 유래 수지상 세포를 이용한 이 기술은 면역학 연구에 필수적인 도구입니다.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

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