Kynurenine 및 Kynurenic 산의 고성능 액체 크로마토그래피 측정: 생화학 인식 및 쥐에 수 면에 관한

이 방법은 생화학적, 행동적 접근 방식을 결합하여 쥐에서 급성 키누레닌 챌린지의 영향에 대한 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 쥐의 뇌와 혈장에서 키누레닌 경로 대사 산물을 측정하기 위한 신뢰할 수 있고 일관된 방법을 제공한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학생 연구 조교인 Carly Fabian

복강내 키누레닌 투여 후 적절한 실험 종료 시점에서, 냉동 수확된 혈장을 젖은 얼음에서 해동하고 해동된 샘플을 초순수로 희석합니다. 100마이크로리터의 희석된 샘플을 6% 과염소산 25마이크로리터의 개별 용기에 넣고 샘플을 원심분리하여 소용돌이칩니다. 그런 다음 키누레닌 및 키누렌산 측정을 위해 각 튜브에서 100마이크로리터의 상등액을 개별 250마이크로리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

뇌 샘플에서 키누렌산을 측정하려면 냉동 수확된 뇌 샘플을 드라이아이스에서 해동하고 정확한 분석 저울에서 각 샘플의 무게를 개별적으로 측정합니다. 모든 샘플의 무게를 측정한 후 튜브를 젖은 얼음 위로 옮기고 각 조직 샘플을 초순수로 1:10 중량비로 희석한 다음 초음파 처리기로 균질화합니다. 각 샘플 슬러리의 100마이크로리터를 새 튜브에 부분 표본으로 추출한 다음 볼텍싱 및 원심분리를 위해 25마이크로리터의 25% 과염소산을 추가합니다.

그런 다음 키누렌산 측정을 위해 100마이크로리터의 상등액을 개별 250마이크로리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 키누레닌 분석을 위한 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC를 준비하려면 먼저 개별 HPLC 흡입 튜브를 이동상, 초순수 및 100% 아세토니트릴 용기에 넣습니다. 그런 다음 분당 0.5ml의 속도로 5%아세토니트릴과 95%초순수를 실행하도록 기기를 프로그래밍하고 HPLC 기계가 20-30분 동안 작동하도록 합니다.

안정적인 압력과 기준선에 도달하면 용액 조성을 5% 아세토니트릴 및 95% 아세트산 나트륨 이동상으로 변경하고 기기를 다시 30분 동안 평형화합니다. 기기가 평형을 이루는 동안 l을 켭니다.amp 형광 검출기에서. 유도체화에 앞서, 이동상 포스트 컬럼과 결합된 연동 펌프를 통해 아연 아세테이트 용액을 별도로 펌핑하고 포스트 컬럼 펌프를 약 500psi의 안정적인 압력에 도달할 때까지 약 20분 동안 분당 0.1밀리리터의 유속으로 켭니다.

기기가 분석을 수행할 준비가 되면 시스템 소프트웨어를 설정하여 샘플 염기서열 파라미터를 제어하고 여러 샘플의 자동 주입을 허용합니다. Run Sample(샘플 실행) 화면에서 File(파일)을 클릭하고 새 창에서 Create New Sample Set(빈 영역 선택)으로 드래그합니다. 모든 표준물질과 샘플을 실행해야 하는 순서대로 개별적으로 나열하고, 표준물질은 시퀀스의 시작과 끝에서 분석됩니다.

기능 열에서 표준물질과 샘플을 지정하고 5개의 샘플마다 물을 주입하도록 프로그램을 설정합니다. 각 샘플의 실행 시간을 15분으로 설정하고 표준물질에서 20마이크로리터의 샘플을 주입한 다음 실험적으로 적합한 20마이크로리터의 혈장 샘플과 30마이크로리터의 뇌 균질화 샘플을 주입합니다. 그런 다음 측정되는 화합물에 따라 excitation 및 emission 파장을 설정하고 시퀀스를 실행합니다.

데이터를 정량화하려면 Browse Project(프로젝트 찾아보기) 화면을 열고 Sample Sets(Sample Sets) 탭에서 정량화할 Sample Set를 두 번 클릭합니다. 주입 목록에서 모든 표준을 강조 표시하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 새 창에서 Process'를 선택합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴를 사용하여 Calibrate and Quantitate(보정 및 정량화)를 선택하고 모든 표준물질을 다시 강조 표시한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Review(검토)를 선택합니다.크로마토그램이 열리면 각 표준물질을 적분 및 보정하여 표준 곡선을 생성합니다.

그런 다음 Sample Sets' 탭으로 돌아가서 Sample Set을 두 번 클릭하여 정량 분석 및 검토하고, 각 샘플을 통합 및 정량화하여 이전에 생성된 표준 곡선을 기반으로 각 샘플의 농도를 출력합니다. 키누레닌을 투여한 동물에서 채취한 조직 샘플의 HPLC 분석은 키누레닌 머무름 시간이 약 6분이고 키누렌산 머무름 시간이 약 11분임을 밝혔습니다. 혈장 키누레닌과 해마 키누렌산의 정량화는 급성 키누레닌 주사가 뇌 키누렌산 수치를 증가시키며, 주사 후 2시간에 최고치에 도달하고 주사 후 4시간에 기준선으로 복귀하는 것을 보여줍니다.

수동적 회피 패러다임 훈련 시험에서는 집단 차이가 관찰되지 않았지만, 대조군 동물은 시험 시험 중 어두운 면으로 들어가기 위한 잠복기가 크게 증가하여 맥락 학습을 나타내는 반면, 24시간 전에 키누레닌을 주입한 동물은 동일한 잠복기 증가를 보이지 않아 학습의 결핍을 보여줍니다. 또한, 가벼운 단계 동안 급성 키누레닌 상승이 수면-각성 구조에 미치는 영향에 대한 평가는 키누레닌 주사 후 첫 2시간 동안 총 빠른 안구 운동 수면 시간이 감소하는 것을 나타냅니다. 이러한 데이터는 이 기간 동안 깨어 있는 시간이 증가하고 급속하지 않은 안구 운동 수면이 약간 감소하는 것으로 반영되며, 급성 키누레닌 상승이 수면-각성 역학에도 장애를 일으킨다는 것을 보여줍니다.

이 절차에 따라 인지 및 수면을 조절하는 데 있어 상승된 키누렌산 형성의 역할에 대한 추가 질문에 답하기 위해 행동 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.