Name: 인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9를 이용한 인간 유도만능줄기세포 내원성 단백질 형광 태깅 방법을. 전기천공과 FACS를 통해 편집 세포를 농축하고 단일세포계를 생성하여 정확한 유전자 편집 결과를 분석할 수 있습니다.

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우리는 많은 통찰력이 토론 및 편집, 그림, 원고의 중요 한 독서에 대 한 안 젤리 크 넬슨과 앤드류 mEGFP 태그 Lamin B1 셀 라인을 생성 하기 위한 터 커에 대 한 타오 할 유전자에 대 한 조언을 위해 다프네 Dambournet 감사 합니다. 유전자 편집 및 품질 관리 과정에 그들의 공헌에 대 한 세포 과학에 대 한 줄기 세포와 유전자 편집 및 알 렌 연구소에서 분석 결과 개발 팀을 인정 하 길. 우리가 만드는 우리의 유전자 편집 셀 라인 데 911 무역 라인 스톤 학회와 UCSF에서 브루스 R. 컨 클린이 실험실에 의해 제공 되었다. 우리 알 렌 연구소 세포 과학 설립자, 폴 G. 알 렌, 그의 비전, 격려, 감사 하 고 지원 합니다.

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저자는 공개 없다.

HiPSCs에 형광 성 단백질 융해 규제 endogenously 생성에 대 한 여기에 제시 된 방법은 응용 프로그램 라이브 셀 이미징에서 다양 한 기능성 연구에 이르기까지 유전자 편집 셀 라인을 생성 하기 위한 다양 하 고 강력한 접근 및 " 접시에 질병"모델 환자 파생 hiPSC 라인13,,1415를 사용 하 여. 소개 큰 FP 태그에는 N-또는 C-말단 생 단백질의이 메서드를 사용 하는 동안 잠재적으로 사용 될 수 모델 또는 정확한 질병 유발 돌연변이22,23 다른 태그 또는 작은 유전자 변화를 소개 하 . 작은 삽입, 상 동 팔의 크기를 줄일 수 있습니다, 하지만이 방법에 제시 편집에 일반적인 접근24,25적용 수 있습니다. HiPSCs의 사용은 주의 최적화, 그들의 광대 한 유틸리티에 대 한 것이 좋습니다 다른 포유류 세포 라인의 유전자를 편집 하려면이 프로토콜을 적응 수 있습니다.
식별 FP 태그에 대 한 관심사의 유전자 사본 풍부 (microarray 또는 RNA-Seq 데이터)에서 추정은 좋은 출발점 사본 레벨을 항상 연관 하지 않습니다 비록 유전자 또는 isoform 관심의 표현 여부를 평가 하기 위한 단백질 수준입니다. 여기에 설명 된 FACS 농축 전략 관심의 셀 유형을 적어도 온건 하 게 잘 표현 된 유전자에 대 한 최고의 작동 합니다. 이 전략은 신호 대 배경 비는 매우 낮은12,19centrin, desmoplakin, paxillin 등 punctate 및/또는 개별 지역화 패턴을 보여 주는 융해에 대 한 선택에 성공 했다. 유전자는 매우 표현 되지 않는다 또는 파생 셀 형식에만 표시 됩니다 추가 선택 전략 필요할 수 있습니다.
디자인에 대 한 기증자와 crRNA 템플릿 플라스 미드 인간의 세포 라인에 사용 시작 지점 인간의 참조 게놈 (GRCh38) 이어야 한다. 다른 세포의 유전자는 같은 종 내에서 다를 수 있기 때문에 CRISPR/Cas9는 시퀀스 관련 때문에, 그것은 매우 도움이 셀 라인 전용 변종 (단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 또는 삽입/삭제 (indels))를 식별 하 그는 디자인에 이러한 통합 참조 게놈에서 다. 이렇게 하면 crRNAs 호스트 게놈와 호환 된다는 것 그리고 기증자 템플릿 플라스 미드 homology 팔 어떤 셀 라인의 특정 이체를 유지 합니다. 제안된 전략 디자인 과정에서 homozygous 이체 crRNAs 및 기증자 템플릿 플라스 미드 homology 팔으로 통합 하는 것입니다. Heterozygous 이체를 통합 하는 것은 선택적입니다. 특정 시 약 큰 노크에서 실험을 위해 사용 하 고이 프로토콜에 대 한 다른 주요 고려 사항은 아래에서 토론 된다.
Cas9 단백질
Cas9 단백질을 사용 하 여의 주요 장점은 소개 하는 Cas9와 gRNA는 RNP 복잡 한으로 플라스 미드-기반 접근 Cas9와 gRNA의 식 수 일 동안 계속 하 고 리드에 비해 nuclease 활동의 제한 된 기간에 결과 표시 되었습니다. 큰에-및 오프-대상 활동26,의27. Cas9 단백질을 사용 하 여의 또 다른 이점은 그것 쉽게 셀 안에 한 번 쪼개 다 수입니다. 이 전사, 번역 및 처리26,28단백질을 필요로 하는 Cas9 mRNA 또는 Cas9/gRNA 플라스 미드를 사용 하 여 더 많은 기존의 방법과 대조 됩니다. Wildtype S. pyogenes Cas9 단백질은 지금 많은 상업적인 근원에서 있다.
가이드 RNA
또는 몇 가지 예측된에서-대상 호스트 게놈29,30,,3132에 있는 원하는 FP 삽입 사이트 근처 crRNA 목표를 찾아내기를 위한 많은 공개적으로 사용 가능한 도구가 있다. HDR에 HDR 결과의 정밀도 효율성 주어진된 로커 스12에서 사용 하는 crRNA 목표 사이 넓게 변화 한다. 이러한 이유로, 몇몇 crRNAs 테스트 (2-4와 선호 50 내 원하는 삽입 사이트의 bp) 로커 스 당 것이 좋습니다이 성공적인 편집 실험의 확률을 증가 시킬 수 있습니다. 합성 2 부분 crRNA 및 tracrRNA, 합성 한 gRNAs (sgRNAs) 생체 외에서 gRNA를 제공 하기 위한 현재 가능성 포함 복사할 sgRNAs, 또는 U6 발기인에서 sgRNA을 표현 하는 세포는 플라스 미드를 제공. 이 프로토콜은 높은 분열 활동 하지 적합 합니다. 수정 되지 않은 2 부분 crRNA와 tracrRNA ( 재료의 표참조) 셀에 최소한 잠재적인 섭 동을 일으키는 동안 모노 유전자 f P 태그 세포 생성의 목표와 함께 사용 되었다.
기증자 템플릿 플라스 미드
기증자에서 템플릿 플라스 미드에 통합 됩니다 호스트 게놈 HDR 이벤트 기간 동안 제공 되는 상 동 중 일부 시퀀스 팔, 때문에 점 돌연변이 crRNA 인식 사이트에 HDR 다음과 같은 Cas9에 의해 분열을 더 방지 하기 위하여 소개 되어야 한다. 종종 간단한 파괴적인 변화 팸 시퀀스를 변경할 것입니다. 일부 비 정식 팸 시퀀스는 여전히 야생 타입 S. pyogenes Cas9에 의해 인식 될 수 있다, 왜냐하면 NGG, 자성 또는 나라33를 사용 하지 않도록 최상 이다. 상 동 팔 돌연변이, 동의어 비 돌연변이 희귀 codons의 소개 하지 않도록 합니다. PAM 시퀀스에 동의어 변경 불가능, 씨앗 지역에 3 개의 동의어 포인트 돌연변이 만드는 것이 좋습니다 (10 bp 팸 하 근) crRNA 바인딩 사이트의. 주의 이러한 변경 시 (UTR) 5ʹ 번역 되지 않은 지역에이 지역의 중요 한 규제 시퀀스를 포함할 수 있기 때문에 취해야 한다. 으로 비 보존 기초 변경 높은 보존된 기초17변경 보다 더 용납 수 있습니다 UCSC 게놈 브라우저의 비교 유전체학 트랙 이러한 경우에 지침을 제공할 수 있습니다와 같은 유전자 보존 데이터베이스 컨설팅. 때로는 FP 시퀀스의 단순한 삽입은 ( 그림 1);에서 crRNA 바인딩 사이트를 방해 하기에 충분 한 그러나, 새로 추가 된 시퀀스 crRNA 바인딩 및 팸 시퀀스의 지 속성에 대 한 확인 되어야 한다.
FP와 네이티브 단백질 아미노산 링커는34의 융합 단백질 기능을 보존 하기 위해 권장 됩니다. 종종 아미노산 링커는 특정 요금 또는 크기에 대 한 선택할 수 있습니다. 경우는 cDNA 퓨전 디자인 타겟 비슷한 생 융해 단백질 되었습니다 잘 공부 하고있다, 같은 링커 순서 CRISPR/Cas9 노크 실험12,19에 사용할 수 있습니다. 이러한 정보를 사용할 수 없는 경우 GTSGGS 등 짧은 링커 되었습니다12성공적으로 사용. 다른 연구 대상35의 다양 한 일반적인 작은 3-아미노 산 성 링커 순서와 성공을 설명 했다.
Transfection 및 FACS 농축
많은 상용 transfection 시 약 electroporation 시스템 크기, 비용, 및 구성의 다양 한 시 약을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다 반면 세포, 분자의 특정 종류의 배달에 대 한 공식화 된다. HiPSCs 같은 하드 transfect 세포에 대 한 일반적인 transfection 방법 이외에, electroporation 또한이 방법에 설명 된 대로 CRISPR/Cas9-중재 FP 노크에 대 한 모든 세 가지 구성 요소를 제공 하는 혜택을 운반 합니다. 다른 상용 시 약이이 방법 (데이터 표시 되지 않음), 개발 하 고도 사용 하 고 다른 사람에 의해 RNP 배달26,28,36 때에 비교 될 때 최상의 결과 생산 하기 위해 Electroporation 발견 .
HiPSCs를 편집 하기 위해이 프로토콜을 사용할 때 특별 한 주의 전후에 최적의 세포 생존 및 최소한의 자발적인 차별화에 대 한 프로세스를 편집 하는 유전자는 세포의 부드러운 처리 되도록 취해야 한다. 특히, FACS 농축 방법 가능한 가장 큰 노즐 (130 µ m), 낮은 유량 (≤24 µ L/min), 방부 제-무료 칼 집 액체를 사용 하 여 줄기 세포를 정렬에 대 한 적응 해야 (염 분, 같은 재료의 표참조), 그리고 낮은 샘플 (10 psi) 압력입니다. 줄기 세포에 차선 생존 귀착되는 단일 셀 정렬, FACS 농축 hiPSCs 대량에서 정렬 하 고 셀 생존 및 줄기 세포 무결성을 최적화 하는 인구로 확장. 그러나, 단일 셀 정렬 덜 민감한 세포 유형에 대 한 적절 한 있을 수 있습니다. 세포 생존 촉진, 세포 FACS 농축에 대 한 수확 후에 1 시간 보다 더 이상 문화에 반환 하 고 정렬 과정을 통해 실 온에서 보관. 일부 세포 유형에 대 한 세포 생존 또한 잠복기 셀 정렬 과정 전반에 걸쳐 얼음 (4 ° C)에 의해 향상 될 수 있습니다.
FP-긍정적인 세포의 대량 확장 클론 라인을 생성 하기 전에 융해 단백질 지 방화에 대 한 이미징 분석 하 여 인구를 평가 하는 기회를 제공 한다. 셀의 결과 풍부한 인구 수도 있지만 일부 연구에 대 한 충분 한,이 인구는 자주 다양 한 강도의 FP 신호를 표시 합니다. 격리 된 클론 라인 단일 신호 (그림 3) 기능 실험12에 대 한 더 적절 한 그들을 만드는 있다.
클론 셀 라인 생성
편집 및 클론 선 생성 프로세스에 걸쳐 세포 형태학을 모니터링 하는 데 중요 하다. 부드러운 가장자리와도, 잘 포장 센터12,,1819hiPSC 식민지 급지대 무료 조건에서 재배 전시 한다. 차별화 된 세포는 문화의 5% 미만에서 관찰 해야. 개별 식민지 때, 그는 전시 좋은 형태를 선택 합니다. 이벤트를 뿌리고 96 잘 접시 중 형태에 대 한 복제를 확인 하 고이 분화로 이어질 수 있습니다 또는 유전자 불안정성의 표시로 자란가 그를 중단할.
클론 세포의 정확한 편집의 유전자 확인에 대 한 허용 Cas9 유도 이중 가닥 게놈에서 휴식 하기 때문에 중요 하다는 종종 수리 부정확 하 게 원하는 장소에 태그의 설립에도 불구 하 고. 앞에서 설명한 PCR 기반 분석 실험 보여주었다 누적 10 독특한 게놈 loci에 걸쳐 많은 (45%) FP 표현 클론의 게놈12기증자 플라스 미드 백본 통합 대상된 현장에서 또는 무작위로 (거의)에서 고통. 또한, GFP-긍정적인의 23%를 복제 (n = 177) 10 독특한 loci에 걸쳐 돌연변이에서 또는 태그 없는 대립 유전자, 대부분 NHEJ12때문에 예상된 crRNA 절단 사이트 근처 항구를 발견 했다. 많은 클론 라인 (~ 100 클론/편집)의이 유전자 분석 불가능 한 세포 인구에서 FP 표현과 예상된 퓨전 단백질 지 방화 혼자 보장 하지 않습니다 정확한 편집12 이후 유전 유효성 검사의 중요성 강조 . 또한, 이러한 PCR 기반 분석 클론 선 세대 전에 의미 있는 분석을 완료할 수 있습니다에 대 한 필요성을 보증 하는 어떤 확신을가지고 셀의 인구 농축된에 수행할 수 없습니다. 삽입 된 FP 태그의 유전자 확인 및 검증 (모노 유전자 편집된 클론)에서 편집 되지 않은 대립 유전자의 유전 무결성의 둘 다 정확한 편집 태그 식 넘어 대상된 현장에서 확인 하는 데 필요한 있습니다.
Bi-유전자 편집의 낮은 속도 (Sanger와 exome 시퀀싱 분석)으로 대상에서 돌연변이의 부족이 방법 (되지 않은 데이터)12를 사용 하 여 날짜를 관찰 되었습니다. 이것은 CRISPR/Cas9 실험26,27에 대 한 짧은 지속 RNP의 사용을 설명 하는 이전 연구 결과와 일치. Bi-유전자 수정 클론 셀 라인의 부족 특정 장소에는 영향을 수도 있습니다 또는 두 용납 하는 셀의 무 능력 때문 태그 제안 이전에 게시 실험에서 필수적인 단백질의 복사본 상 상속 유전자 양방향 편집된 셀 했다 또 다른 (TUBA1B)12만 한 로커 스 (LMNB1)에 대 한 관찰. 완벽 하 게 검증 된 Bi 유전자 클론 셀 라인 mEGFP19이 방법 태그 ST6 베타-galactoside 알파-2, 6-1 sialyltransferase (ST6GAL1), 및 RAB5A 구성원 RAS oncogene 가족 (RAB5A)를 사용 하 여 생성 된.
게놈에서 편집의 정밀도 확인, 넘어 더 클론 라인의 특성 충족 모든 줄기 세포, 게놈, 클론을 식별 하는 데 사용할 수 있는 품질 관리 분석 실험의 다양 한 있다 그리고 세포 생물학 기준 연구 미래에 사용 . 세포 생물학과 기능 분석 실험 지역화, 적절 한 표현과 융합 단백질12의 기능 확인을 사용할 수 있습니다. 편집 되지 않은 자녀를 비교 현지화, 역학, 및 기능에는 편집 과정의 영향을 평가 하는 데 도움이 됩니다. 다른 분석 실험과 같은 성장 분석 및 게놈 안정성에 대 한 테스트 또한 도울 수 있다 태그 단백질 셀 perturbing 인지 확인 합니다. 이 프로토콜에서 hiPSC를 사용 하 여, pluripotency 마커 및 감 별 법 잠재력의 평가 다운스트림에 대 한 귀중 한은 복제 연구12결정에 중요 한 될 수 있습니다. 문화를 확장 하기 때문에 hiPSC는 성장 율 모니터링 유전 불안정성으로 이어질 보였다 고 클론 셀 라인의 karyotype는 또한 중요 한12,37. 그러나, 마지막 것 편집된 된 셀의 사용 수준 및 품질 관리 분석의 폭 궁극적으로 결정 하 고 응용 프로그램에 따라 달라 집니다.

게놈 편집 전략, 특히 CRISPR/Cas9, 세포질 과정을 공부 하는 사용 되 고 점점 접근 가능 하 고 귀중 한1,2,3,,45, 6 , 7. CRISPR/Cas9의 많은 응용 프로그램 중 하나는 유전자 또는 단백질 제품8의 활동에 대 한 기자 역할을 다음 특정 게놈 loci GFP 등 대형 세 시퀀스의 (감독 homology 수리 (HDR))를 통해 소개 . 이 기술은 결과 endogenously 규제 융해 단백질 subcellular 지 방화 및5 관심사의 단백질의 역학 관계를 시각화 하기 위해 사용 될 수 있는 생 열려있는 독서 프레임 형광 단백질 시퀀스에 참여를 사용할 수 있습니다. ,,69,,1011. Endogenously 태그 단백질 overexpression 시스템에 비해 많은 혜택을 제공, 큰 시퀀스 인간 게놈으로 삽입은 일반적으로 요구 하는 선택 또는 농축 할 수 있는 세포의 인구를 전략 하는 비효율적인 프로세스 수 쉽게 공부5,12.
이 프로토콜 원하는 genomic 소재 시에 형광 성 단백질 (FP) 인코딩 DNA 순서의 삽입을 설명 합니다. 프로토콜 설계 및 기증자 템플릿 플라스 미드 및 ribonucleoprotein (RNP) 복잡 한 (야생 타입 S. pyogenes Cas9 단백질 합성 CRISPR RNA (crRNA)와 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA)와 함께) 전달 포함 됩니다. 또한 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)와 클론 셀 라인 생성 프로세스를 통해 상 편집 된 셀의 농축이입니다. 날짜 하려면,이 메서드 hiPSC 라인 monoallelic 또는 25 단백질 주요 세포질 구조를 나타내는 라벨 (거의) bi 유전자 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그를 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 노력에서 결과 편집된 셀으로 예상된 유전자 삽입을가지고, 제대로 로컬라이제이션 융해 단백질 pluripotency 및 안정적인 karyotype12 (및 되지 않은 데이터) 확인 되었습니다 했다. 이 방법은 또한 여러 다른 생성 하 사용 된 단일 및 듀얼 (2 개의 다른 단백질 같은 셀 태그) 편집 hiPSCs (되지 않은 데이터)의 인구.
많은 기존의 셀 라인와 달리 그들은 2 중, karyotypically 안정, 비 변형, 증식 하기 때문에 건강 한 기증자에 게 서 파생 된 인간의 Ipsc 이러한 게놈 편집 노력에 대 한 선정 됐다. 이러한 속성은 근본적인 세포 생물학 및 질병 모델링을 공부에 대 한 매력적인 모델을 제공 합니다. 또한, hiPSCs의 감 별 법 잠재력 다양 한 계보와 세포 유형 organoids, 조직 및 "접시에 질병" 모델13 포함 하 여 isogenic 셀을 사용 하 여 동시에 여러 발달 단계를 공부 하는 기회 제공 ,,1415. 이 프로토콜은 hiPSCs (911 무역 선)를 위해 개발 되었다, 그러나 그것 수 있습니다 다른 포유류 세포 선을 사용 하 여 프로토콜의 개발에 대 한 유익.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters 또는</td><td></td><td> in silico donor plasmid design</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8.0</td><td>IDT 또는 이와 유사한</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubator 또는 유사한</td><td>ThermoFisher Scientific 또는 이와 유사한</td><td>51030408</td><td></td></tr><tr><td>피펫(1000 &마이크로; L, 200 &마이크로; L, 20 &마이크로; L, 10 &마이크로; L, 2 &마이크로; L)</td><td>Rainin 또는 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁(1000 &micro; L, 200 &마이크로; L, 20 &마이크로; L)</td><td>Rainin 또는 유사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫(200 &마이크로; L)</td><td>Rainin 또는 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫(25 mL, 10 mL, 5 mL)</td><td>Costar 또는</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quiksip, 오토클레이브 가능한</td><td>Millipore Sigma 또는</td><td>Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10과 같은 비여과 피펫 팁과 함께 유사한 BR704526-1EA용 BRAND 8-Channel Manifold, Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher 이하 또는 유사한</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 피펫 컨트롤러</td><td>Drummond 또는 유사한</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>일회용 파스퇴르 피펫</td><td>VWR 또는 유사한</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td><td>CELLGARD 또는 유사한</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 매트릭스, 성장 인자 감소</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>로트는 hiPSC와 함께 사용하기 전에 테스트했습니다</td></tr>.<tr><td>DMEM/F12 (-페놀 레드)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>콜드, Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 희석용 완전한 배지 StemCell</td><td>Technologies</td><td>85850</td><td>WTC hiPSC 라인에 권장되는 성장 배지</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC hiPSC 라인</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>이 프로토콜에 사용된 hiPSC 라인은 Coriell</td></tr><tr><td>을 통해 사용할 수 있습니다.조직 배양 접시 100mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15mL 폴리스티렌 원추형</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ( ROCK 억제제)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 &micro; M</td><td>University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 기증자 플라스미드(PriorityGENE)</td><td>Genewiz</td><td></td> 공여체 삽입 설계를 합성하여 Genewiz DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Clontech</td><td>740424.50</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>ThermoFisher에 의해 pUC57 백본으로 복제 Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System, 100 &micro; L 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함</td>) <td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15mL 고선명도 폴리프로필렌 원추형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 버전 10.2</td><td>무</td>방부제 FACS로 사용되는 TreeStar <td></td><td></td></tr><tr><td>NERL 혈액 은행 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX7 실체 현미경 또는 유사한</td><td>Olympus 또는 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트, 96-well</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 형식의 세포용 동결 보존 버퍼로 사용되는</td> <td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 crispr/cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

프로토콜은 프레임 N 또는 C 터미널 형광 태그를 융합 하는 익스프레스 생 단백질 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)을 생성 하는 데 제공 됩니다. 간결한 CRISPR/Cas9 시스템 (클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 9) 감독 homology 수리 (HDR)를 통해 게놈 loci 큰 exogenous 시퀀스를 사용할 수 있습니다. 원하는 노크에 달성,이 프로토콜 사용 하 여 ribonucleoprotein (RNP)-기반 접근 야생 타입 연쇄 상 구 균 pyogenes Cas9 단백질, 합성 2 부 가이드 RNA (gRNA), 및 기증자 템플릿 플라스 미드를 통해 세포에 전달 됩니다 electroporation입니다. 붙일 태그가 단백질을 표현 하기 편집된 셀 정렬 (FACS) 형광 활성화 된 세포에 의해 농축 됩니다. 클론 라인 다음 생성 하 고 정확한 편집 결과 대 한 분석 될 수 있다. 관심사의 유전자의 genomic 소재 시에 형광 태그를 도입 하 여 결과 subcellular 지 방화 및 융해 단백질의 역학 공부 될 수 있다 통제 생 규정, 재래식 overexpression에 핵심 개선 시스템입니다. 유전자 태그를 위한 모델 시스템으로 hiPSCs의 사용 2 중, nontransformed 셀에 태그 단백질을 공부 하는 기회를 제공 합니다. 때문에 hiPSCs는 여러 세포 유형으로 분화 될 수 있다,이 이렇게 생성 하 고 다양 한 isogenic 셀룰러 컨텍스트 태그 단백질 연구 기회를 제공 한다.

이 실험의 목표 LMNB1 유전자 (단백질의 N-말단)의 5ʹ 끝을 mEGFP 시퀀스를 도입 하 여 핵 lamin B1 단백질 mEGFP (단위체 향상 된 GFP)를 융합 했다. 마이클 데이비슨 형광 단백질 컬렉션21에서 링커 (아미노산 시퀀스 SGLRSRAQAS)을 이전 cDNA 구문에 따라 선택 되었다. CrRNA 바인딩 지역 각 후보 crRNA에 대 한 기증자 템플릿 플라스 미드에는 mEGFP 및 링커 시퀀스의 실리콘에 삽입 후 중단 되었다, 때문에 아무 지점 돌연변이 잠재적인 crRNA 인식 및 분열에 의해 방해를 만들 필요가 기증자 시퀀스 (그림 1)의 Cas9. 기증자 시퀀스 1 kb homology 팔 mEGFP 링커 시퀀스의 양쪽 측면을 포함. 결과 2,734 bp DNA의 pUC57 등뼈에 복제 했다 시퀀스 확인 하 고 결과 기증자 템플릿 플라스 미드도 없는 맥시 준비를 사용 하 여 순화 되었다. 기증자 템플릿 플라스 미드 및 복잡 한 RNP 페 했다, 상 편집된 셀 풍성 하 게 했다와 mEGFP 핵 lamin B1 융해 단백질의 지 방화는 형광 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 확인 되었다. 비록 두 crRNA 시퀀스 생성 하기 편집된 인구12만 crRNA1 transfection 결과 여기, 설명 합니다.
0.95 %mEGFP-긍정적인 세포 상 편집 대표 셀에 포함 된 페 LMNB1 crRNA1 gRNA, Cas9 단백질, 또는 기증자 템플릿 플라스 미드 electroporation 반응 (버퍼만)에 포함 된, 부정적인 컨트롤에 비해 mEGFP-핵 lamin B1 인구 (그림 3a). 이 결과 효율성 노크에서 이전에 보고 된12이 메서드를 사용 하 여 많은 게놈 loci 관측의 범위 안에 이었다.
MEGFP-긍정적인 세포 FACS에 의해 분리 되었고 라이브 현미경 핵 봉투에 mEGFP 핵 lamin B1 융해 단백질의 예상된 지역화를 확인 하 여 몇 군데. FACS 농축 후 LMNB1 crRNA1 인구에서 정렬된 셀의 약 90% (로 현미경 검사 법에 의해 결정), mEGFP-긍정적인 일부 mEGFP 부정적인 셀 정렬 절차 동안 GFP-긍정적인 세포와 공동 정화를 제안 했다. 이것은 성공적인 편집을 위한 유전자 검사 다음 수 96 클론의 수확에 대 한 허용 농축의 수락 가능한 수준 이었다. 일반적으로, 성공적인 농축 컷오프 50%는 GFP 긍정.
정렬된 셀 인구의 nondividing 세포에 있는 핵 봉투 (핵 주변)에 형광을 표시 하 고 유사 분열 제공 자신감 올바른 게놈 중 세포질 내에서 확장된 핵 lamina에는 LMNB1에서 편집 로커 스입니다. 밝은 또는 희미 한 신호를 포함 하는 풍부한 인구 셀. 신호 강도이 차이 정확 하 고 잘못 된 결과 및 추가 대 한 유전자 검증된 클론 라인 생성 유틸리티 (토론 참조) 연구 하이라이트 편집의 조합을 반영 될 수 있습니다 (그림 3b)12. 클론 라인 생성 후 유전자 세포 현미경 실험 (그림 3c)에서 균일 한 GFP 강도 보여준 검증.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> 그림 1 . LMNB1 유전자의 N-말단 GFP 태그에 대 한 전략을 디자인. GFP 태그 염색체 5에 있는 LMNB1의 첫 번째 엑손의 N 맨끝 삽입 5ʹ 위해 설계 되었습니다. 5ʹ와 3ʹ 모두 homology 무기는 1 kb와 시작 codon (ATG)와 두 번째 코 돈 (상 동 팔만 부분적으로 그림에 표시). 두 후보 crRNAs Cas9 하면서 독특한 게놈에서 가능한 의도 삽입 사이트 가까이로 쪼개를 안내 하도록 설계 되었습니다. MEGFP 및 아미노산 링커 순서 시작 codon (하지를 mEGFP 및 링커 순서)의 단지 3ʹ를 삽입된 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> 그림 2 . Endogenously 생산에 대 한 워크플로 태그 hiPSC 클론 라인. Transfection 구성 요소, 포함 (골드 crRNA와 보라색 tracrRNA 붉은 Cas9 단백질 표시), Cas9/crRNA/tracrRNA RNP 복잡 한 상 동 팔 (가, 금에 표시), 포함 된 기증자 템플릿 플라스 미드 및 FP + 링커 순서 (에 표시 된 녹색), 했다 electroporated입니다. 4 일 후, FP 양성 상 편집 셀 FACS에 의해 농축 (~ 1000 셀), 96-잘 접시의 단일 잘으로 정렬 된 셀의 모든 시드를 모집단으로 확장 그리고 문화에 몇 백만의 노동 인구까지 확장 세포 "풍부한 인구"로 분석 될 수 (프로토콜 단계 3.8 참조). FP-긍정적인 세포의 수익률 차이가 HDR12;의 가변 속도로 인해 실험 성공적인 농축 수 있습니다 일반적으로 300 ~ 5000 포함6 엉덩이 세포 transfection 약 1.6 x 10의 후 세포. 예비 이미징 연구 확인 신호 및 풍부한 인구에 융해 단백질의 지 방화. 식민지는 확장 및 cryopreservation 96 잘 접시에 수동으로 선택 했다. 게놈 품질 관리 심사를 더 물방울 디지털을 사용 하 여 PCR (ddPCR) 및 다른 PCR 기반 분석 실험은 다음 식별 하는 데 제대로 편집된 클론, 앞에서 설명한12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> 그림 3 . 상 편집된 셀 인구의 농축. (A) 는 LMNB1의 흐름 cytometry 플롯 편집 셀 4 일 후 transfection. Y GFP 강도 표시 하 고 x 축 앞으로 분산형 표시 됩니다. 정렬 게이츠 버퍼 전용 제어 기반으로 설정 했다. HiPSCs 섭 동에 민감한 때문에, 생략 되었다 라이브/죽은 얼룩 그리고 매우 보수적인 FSC/SSC 게이트 대신 사용 되었다. 농축 한 후 (B) , LMNB1 Cr1의 인구 편집 셀 셀 GFP 핵 봉투 (예상된 LMNB1 지역화) 지역화의 ~ 90%를 보였다. 인구는 몇몇 GFP 부정적인 세포 뿐 아니라 다양 한 GFP 강도의 셀 포함. 스케일 바는 10 미크론. (C) 클론 라인 생성 후 셀 일부 세포 주기 의존 차이와 유니폼 GFP 강도를 보였다. 눈금 막대 20 미크론 이다입니다.

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

이 프로토콜의 목표는 말단 프레임 N 또는 C 말단 형광 태그에 융합된 내인성 융합 단백질을 발현하는 인간 유도 만능 줄기세포를 생성하는 것입니다. 원하는 knock-in을 달성하기 위해 CRISPR-Cas9 시스템과 야생형 S.pyogenes Cas9 단백질과 합성 2액형 CRSPR RNA 및 tracrRNA를 사용하는 리보핵단백질 기반 접근법을 사용합니다. 이 RNP는 전기천공법을 통해 원하는 형광 태그 염기서열과 함께 donor plasmid로 전달됩니다.형광 표지 단백질을 발현하는 것으로 추정되는 편집된 세포는 FACS에 의해 농축됩니다. 그런 다음 정확한 편집 결과를 분석하기 위해 클론 라인이 생성됩니다. 이 유전자 편집 프로토콜은 기존의 과발현 구조체에 비해 많은 장점이 있습니다.형광 태그가 게놈에 도입되기 때문에 생성된 융합 단백질의 세포 내 국소화 및 역학을 내인성 조절 제어 하에 연구할 수 있습니다. 여기에서는 유도만능 줄기세포를 모델 시스템으로 사용하는데, 이는 이배체(diploid)가 형질전환되지 않은 세포에서 태그가 지정된 단백질을 연구할 수 있기 때문입니다. 또한 세포는 여기에 표시된 심근세포 세포와 같은 여러 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 접근 방식은 다양한 동종 세포 맥락에서 태그가 지정된 단백질을 생성하고 연구할 수 있는 기회를 제공합니다.그러나 신중한 최적화를 통해 이 프로토콜은 다른 포유류 세포 유형의 게놈을 편집하는 데 적용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Allen Institute for Cell Science의 줄기세포 및 유전자 편집 팀의 일원인 Amanda Haupt입니다. 오늘날 우리는 이 접근법을 사용하여 내인성 융합 단백질을 발현하는 35개 이상의 서로 다른 세포주를 생성했습니다.우리는 이를 사용하여 다양하고 독특한 세포 구조와 과정을 연구합니다. 이 접근법은 우리 그룹과 데이트를 시도한 유전자좌의 최대 95%에 대해 성공적이었습니다. 이 방법은 살아있는 세포에서 단백질의 역학을 더 잘 이해하는 데 관심이 있는 세포 생물학자에게 특히 유용할 것입니다.그러나 일단 편집된 클론 라인이 생성되면 연구 가능성은 무한합니다. 이 방법을 사용하면 게놈 염기서열에서 다른 중단 없이 단일대립유전자 형광 단백질 태그가 있는 클론을 일관되게 식별할 수 있습니다. 또한 때때로 이중 대립유전자로 편집된 클론을 얻을 수 있습니다.이 비디오에서는 내인성으로 조절되는 형광 융합 단백질을 발현하는 클론 세포주를 transfection, FACS 농축 및 분리하는 주요 단계 중 일부를 보여줍니다. transfection하기 2-3시간 전에 성장 배지에 보충된 10개의 마이크로몰 ROCK 억제제로 hiPSC를 치료합니다. 이것은 electroporation 후에 생존을 승진시킬 것입니다.이 치료 후에는 세포가 뾰족한 모양을 갖게 됩니다. transfection 전에 단일 세포 해리 영역과 세포 현탁액을 원뿔형 튜브에 모아 조직 폐쇄 플레이트에서 세포를 제거해야 합니다. transfection할 각 실험 조건에 대해 6개의 세포에 대해 1.84 곱하기 10의 부분 표본을 준비합니다.1.5 mil 튜브에 2.88 마이크로리터의 10 마이크로몰 가이드 RNA와 2.88 마이크로리터의 10 마이크로몰 Cas9를 첨가하여 각 트랜스펙션에 대한 리보핵단백질 복합 튜브를 준비합니다. 실온에서 최소 10분, 최대 1시간 동안 배양합니다. 이전 단계에서 제조한 세포 분취액을 실온에서 3분 동안 211배 G로 펠렛화합니다.그런 다음 상등액을 흡인하고 220마이크로리터의 전기천공법 완충액에서 세포 펠릿을 회전시키기 위해 경쟁합니다. 220마이크로리터의 재현탁 세포를 이전에 준비한 1.5mil RNP 복합 튜브에 추가합니다. 마이크로리터 공여체 플라스미드당 1마이크로그램의 4.6마이크로리터를 추가합니다.nucleofection 팁과 피펫을 사용하여 두 내용물을 2-3회 혼합한 다음 100마이크로리터의 현탁액을 준비된 electroporation 장치에 옮깁니다. 팁에 거품이 생기지 않도록 합니다. 30밀리초의 한 펄스에 대해 1,300볼트를 적용합니다.현탁액을 소용돌이치는 동작으로 준비 6웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다. 플레이트를 좌우로, 앞에서 뒤로 부드럽게 움직여 세포를 분산시킵니다. 모든 실험 조건 및 대조군에 대해 반복한 후 형질 주입된 세포를 섭씨 37도, 5%CO2에서 24시간 동안 배양하고 배지를 24시간에 ROCK 억제제가 없는 일반 성장 배지로 변경합니다.그런 다음 72-96시간 동안 24시간마다 hiPSC를 계속 공급하여 포화도를 모니터링합니다. hiPSC가 68-80% 포화도에 도달하면 FACS 농축으로 진행합니다. 형질주입 2-3시간 전에 FACS 농축 후 생존을 촉진하기 위해 성장 배지에 보충된 10마이크로몰 ROCK 억제제로 hiPSC를 치료합니다.세포를 분류하려면 단일 세포 해리 시약을 사용하여 플레이트에서 세포를 제거한 다음 35미크론 메쉬 필터를 통해 hiPSC 현탁액을 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 여과합니다. forward scatter 및 side scatter를 사용하여 셀을 정렬합니다(높이 대 너비, triplets debris 및 doublets). 라이브 버퍼 전용 제어 셀을 사용하여 버퍼 전용 셀의 1.1% 미만이 게이트 내에 속하도록 FP 포지티브 게이트를 설정합니다.줄기세포를 분류할 때 논의 섹션에서 제안한 대로 세포 생존을 촉진하기 위해 기기 설정을 조정합니다. FACS에 의해 FP 양성 세포의 퍼센트에 의해 결정되는 일반적인 효율 저하 범위는 0.1%에서 5%까지 다양할 수 있습니다.10 마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 0.5 - 2mils의 실온 성장 매체를 포함하는 1.5 - 15mil 폴리프로필렌 튜브로 세포를 분류합니다. 수집된 세포를 실온에서 3분간 211배 G로 원심분리한다.상층액을 조심스럽게 흡인하고 10 마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 200마이크로리터의 성장 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 최대 3,000개의 다양한 세포를 새로운 마트리겔로 코팅된 96 웰 플레이트의 단일 웰로 이동시킵니다. 분류된 세포를 섭씨 37도에서 5%CO2로 24시간 동안 배양하고 배지를 24시간에 5마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 성장 배지로 변경합니다.그런 다음 48 시간에, 72-96 시간 동안 24 시간마다 ROCK 억제제없이 규칙적인 성장 배지를 세포에 계속 공급하여 포화를 모니터링합니다. 세포가 96 웰 플레이트에서 배양될 수 있을 만큼 충분히 성숙하면 점차적으로 더 큰 플레이트로 통과시키는 것이 좋습니다. 예를 들어 96웰 플레이트의 한 웰에서 24웰 플레이트의 1-2웰로 이동합니다.그런 다음 거기에서 6웰 플레이트 등으로 다운스트림 목적을 위한 충분한 세포가 생길 때까지 넣습니다. 일반적으로 최소 3-400만 개의 셀이 있습니다. FACS가 풍부하게 농축된 징벌적으로 편집된 세포 집단에서 클론 세포주를 생성하기 위해 단일 세포 현탁액으로 통과시키고 10,000개의 세포를 10cm 플레이트에 플레이트화하고 콜로니가 5-7일 동안 성장할 수 있도록 합니다.군체가 거시적으로 보이면 격리할 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 해부 현미경에서 P200 피펫을 사용하여 플레이트 표면의 개별 콜로니를 부드럽게 긁어내고 흡인합니다. 콜로니를 포함하는 부피를 96웰 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다.모든 콜로니가 이식된 후 24시간 동안 섭씨 37도, 5%CO2의 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 24시간에 ROCK 억제제가 없는 일반 성장 배지로 배지를 변경합니다. 그런 다음 군집의 크기가 약 3배가 될 때까지 72-96시간 동안 24시간마다 세포에 계속 공급합니다.세포는 게놈 DNA 추출을 위해 안탈라이징을 동결 보존할 수 있는 충분한 세포를 갖기 위해 96개의 웰 플레이트에서 성장하고 계대화되어야 합니다. 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 96웰 플레이트를 통과하려면 8채널 흡인기(aspirator)를 사용하여 첫 번째 컬럼에서 매체를 제거하고 폐기합니다.P200 멀티채널 피펫을 사용하여 약 200마이크로리터의 DPBS를 플레이트의 첫 번째 컬럼에 추가하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 8채널 흡인기를 사용하여 첫 번째 컬럼에서 DPBS 세척을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 첫 번째 열에 40마이크로리터의 해리 시약을 추가합니다.96웰 플레이트의 최대 총 6개 컬럼에 대해 한 번에 한 컬럼씩 작업하면서 이 단계를 반복합니다. 오염된 우물을 교차하지 않도록 팁을 변경하십시오. 해리 시약이 첫 번째 컬럼에 추가된 시점부터 3-5분 동안 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다.플레이트의 첫 번째 열에 있는 세포가 바닥에서 들어 올려지기 시작하면 P200 멀티채널 피펫을 사용하여 첫 번째 열에 160마이크로리터의 DPBS를 추가하고 각 웰의 12시, 3시, 6시 및 9시 위치에 있는 세포를 부드럽게 분쇄합니다. cell suspension이 있는 전체 부피를 V-bottom 96 well plate로 옮깁니다. 해리 시약이 있는 나머지 열에 대해 이 단계를 반복하여 우물을 교차 오염시키지 않도록 팁을 변경합니다.원심분리기의 V 바닥 플레이트를 실온에서 3분 동안 385회 G로 돌립니다. 96 웰 패시징에 대해 이 시점까지 나타난 sub는 세포가 이 플레이트 형태로 계대될 때마다 동일한 방식으로 수행된다. 다음으로 세포를 96웰 형식으로 동결 보존할 준비가 된 경우 진행 방법을 보여 드리겠습니다.자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 이전 섹션에 표시된 원심분리 단계 후 P200 멀티채널 피펫을 사용하여 상층액을 흡입한 다음 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 60마이크로리터의 성장 배지에 다시 현탁합니다. 모든 우물에 대해 반복하고 교차 오염되지 않도록 팁을 변경합니다.30마이크로리터의 세포 현탁액을 비마트리겔 코팅된 96웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 나머지 30마이크로리터의 현탁액을 자매 플레이트로 옮긴 다음 혼합하지 않고 각 웰에 170마이크로리터의 동결 버퍼를 빠르게 추가합니다. 이 프로세스는 중복 자매 플레이트에서 수행되므로 개별 플레이트 중 하나가 해동된 후 백업 세포 집단이 존재합니다.동결 보존된 세포를 96웰 플레이트의 다른 모든 컬럼에만 넣으면 더 빠른 해동이 가능합니다. 접시를 파라필름으로 감싸고 뚜껑이 있는 실온 스티로폼 상자에 넣습니다. 상자 전체를 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다.24시간 후 플레이트를 스티로폼 상자 밖으로 옮겨 최대 4주 동안 섭씨 영하 86도에서 분류할 수 있습니다. 96웰 형식의 인간 유도 만능 줄기 세포의 동결 보존은 세포 배양에서 일시적인 중단을 허용합니다. 연구원은 클론 광산에서 게놈 검증 분석을 수행하여 향후 연구를 위해 해동할 유전적으로 바람직한 클론을 식별할 수 있습니다.WTC hiPSC 라인에 타겟 특이적 가이드 RNA Cas9 단백질과 세심하게 설계된 donor template plasmid를 transfection한 지 4일 후, 세포의 0.95%가 GFP를 발현하는 것이 관찰되었습니다. FACS는 모든 GFP 양성 세포를 농축된 모집단으로 분류하는 데 사용되었습니다. 예비 현미경 검사에서는 mEGFP 핵 lamin B1 융합 단백질이 핵막에 국소화될 것으로 예상되는 것으로 밝혀졌습니다.형광 표지된 단백질은 다양한 강도를 가진 세포의 약 95%에서 관찰되었습니다. 클론 라인 생성 후, 균일한 mEGFP 강도를 가진 클론을 얻고 정확한 편집을 위해 추가 분석했습니다. 결론적으로, 우리는 내인성으로 조절되는 형광 융합 단백질의 발현을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 유전자 편집하기 위한 transfection 방법을 보여주었습니다.일반적인 knock 비효율성이 낮기 때문에 여기에 표시된 FACS 방법과 같은 일부 농축 전략은 융합 단백질을 발현하는 것으로 추정되는 편집된 세포 집단을 생성합니다. 농축된 모집단은 생물학적 연구에 사용될 수 있으며, 또는 이 방법에 설명된 대로 클론 세포주를 생성할 수 있으며, 이를 통해 정확하게 유전자 편집된 세포주를 식별할 수 있습니다. 게놈에서 Cas9 유도 이중 가닥 절단은 의도된 유전자 자리에 태그가 통합되었음에도 불구하고 종종 부정확하게 복구된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.또한 단대립유전자로 편집된 클론에서 태그가 지정되지 않은 대립유전자에는 비상동 말단 결합 복구로 인해 발생할 가능성이 가장 높은 indel이 포함되어 있는 경우가 많습니다. 이러한 발견은 클론 세포주의 게놈 분석을 통해서만 밝혀진 CRISPR Cas9 knock in 이후 유전자 검증의 중요성을 강조합니다. 예상되는 융합 단백질의 발현만으로는 정확한 편집을 보장할 수 없습니다.인간 유도 만능 줄기 세포를 편집하기 위해 이 프로토콜을 사용할 때, 최적의 세포 생존과 최소한의 자발적 분화를 위해 세포를 부드럽게 취급할 수 있도록 서면 프로토콜에 자세히 설명된 권장 사항을 따라야 합니다. 이 비디오와 관련 프로토콜 및 재료 목록이 귀하의 실험실에서 좋아하는 단백질에 대해 유사한 실험을 수행하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

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