인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

이 프로토콜의 목표는 말단 프레임 N 또는 C 말단 형광 태그에 융합된 내인성 융합 단백질을 발현하는 인간 유도 만능 줄기세포를 생성하는 것입니다. 원하는 knock-in을 달성하기 위해 CRISPR-Cas9 시스템과 야생형 S.pyogenes Cas9 단백질과 합성 2액형 CRSPR RNA 및 tracrRNA를 사용하는 리보핵단백질 기반 접근법을 사용합니다. 이 RNP는 전기천공법을 통해 원하는 형광 태그 염기서열과 함께 donor plasmid로 전달됩니다.

형광 표지 단백질을 발현하는 것으로 추정되는 편집된 세포는 FACS에 의해 농축됩니다. 그런 다음 정확한 편집 결과를 분석하기 위해 클론 라인이 생성됩니다. 이 유전자 편집 프로토콜은 기존의 과발현 구조체에 비해 많은 장점이 있습니다.

형광 태그가 게놈에 도입되기 때문에 생성된 융합 단백질의 세포 내 국소화 및 역학을 내인성 조절 제어 하에 연구할 수 있습니다. 여기에서는 유도만능 줄기세포를 모델 시스템으로 사용하는데, 이는 이배체(diploid)가 형질전환되지 않은 세포에서 태그가 지정된 단백질을 연구할 수 있기 때문입니다. 또한 세포는 여기에 표시된 심근세포 세포와 같은 여러 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 접근 방식은 다양한 동종 세포 맥락에서 태그가 지정된 단백질을 생성하고 연구할 수 있는 기회를 제공합니다.

그러나 신중한 최적화를 통해 이 프로토콜은 다른 포유류 세포 유형의 게놈을 편집하는 데 적용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Allen Institute for Cell Science의 줄기세포 및 유전자 편집 팀의 일원인 Amanda Haupt입니다. 오늘날 우리는 이 접근법을 사용하여 내인성 융합 단백질을 발현하는 35개 이상의 서로 다른 세포주를 생성했습니다.

우리는 이를 사용하여 다양하고 독특한 세포 구조와 과정을 연구합니다. 이 접근법은 우리 그룹과 데이트를 시도한 유전자좌의 최대 95%에 대해 성공적이었습니다. 이 방법은 살아있는 세포에서 단백질의 역학을 더 잘 이해하는 데 관심이 있는 세포 생물학자에게 특히 유용할 것입니다.

그러나 일단 편집된 클론 라인이 생성되면 연구 가능성은 무한합니다. 이 방법을 사용하면 게놈 염기서열에서 다른 중단 없이 단일대립유전자 형광 단백질 태그가 있는 클론을 일관되게 식별할 수 있습니다. 또한 때때로 이중 대립유전자로 편집된 클론을 얻을 수 있습니다.

이 비디오에서는 내인성으로 조절되는 형광 융합 단백질을 발현하는 클론 세포주를 transfection, FACS 농축 및 분리하는 주요 단계 중 일부를 보여줍니다. transfection하기 2-3시간 전에 성장 배지에 보충된 10개의 마이크로몰 ROCK 억제제로 hiPSC를 치료합니다. 이것은 electroporation 후에 생존을 승진시킬 것입니다.

이 치료 후에는 세포가 뾰족한 모양을 갖게 됩니다. transfection 전에 단일 세포 해리 영역과 세포 현탁액을 원뿔형 튜브에 모아 조직 폐쇄 플레이트에서 세포를 제거해야 합니다. transfection할 각 실험 조건에 대해 6개의 세포에 대해 1.84 곱하기 10의 부분 표본을 준비합니다.

1.5 mil 튜브에 2.88 마이크로리터의 10 마이크로몰 가이드 RNA와 2.88 마이크로리터의 10 마이크로몰 Cas9를 첨가하여 각 트랜스펙션에 대한 리보핵단백질 복합 튜브를 준비합니다. 실온에서 최소 10분, 최대 1시간 동안 배양합니다. 이전 단계에서 제조한 세포 분취액을 실온에서 3분 동안 211배 G로 펠렛화합니다.

그런 다음 상등액을 흡인하고 220마이크로리터의 전기천공법 완충액에서 세포 펠릿을 회전시키기 위해 경쟁합니다. 220마이크로리터의 재현탁 세포를 이전에 준비한 1.5mil RNP 복합 튜브에 추가합니다. 마이크로리터 공여체 플라스미드당 1마이크로그램의 4.6마이크로리터를 추가합니다.

nucleofection 팁과 피펫을 사용하여 두 내용물을 2-3회 혼합한 다음 100마이크로리터의 현탁액을 준비된 electroporation 장치에 옮깁니다. 팁에 거품이 생기지 않도록 합니다. 30밀리초의 한 펄스에 대해 1,300볼트를 적용합니다.

현탁액을 소용돌이치는 동작으로 준비 6웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다. 플레이트를 좌우로, 앞에서 뒤로 부드럽게 움직여 세포를 분산시킵니다. 모든 실험 조건 및 대조군에 대해 반복한 후 형질 주입된 세포를 섭씨 37도, 5%CO2에서 24시간 동안 배양하고 배지를 24시간에 ROCK 억제제가 없는 일반 성장 배지로 변경합니다.

그런 다음 72-96시간 동안 24시간마다 hiPSC를 계속 공급하여 포화도를 모니터링합니다. hiPSC가 68-80% 포화도에 도달하면 FACS 농축으로 진행합니다. 형질주입 2-3시간 전에 FACS 농축 후 생존을 촉진하기 위해 성장 배지에 보충된 10마이크로몰 ROCK 억제제로 hiPSC를 치료합니다.

세포를 분류하려면 단일 세포 해리 시약을 사용하여 플레이트에서 세포를 제거한 다음 35미크론 메쉬 필터를 통해 hiPSC 현탁액을 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 여과합니다. forward scatter 및 side scatter를 사용하여 셀을 정렬합니다(높이 대 너비, triplets debris 및 doublets). 라이브 버퍼 전용 제어 셀을 사용하여 버퍼 전용 셀의 1.1% 미만이 게이트 내에 속하도록 FP 포지티브 게이트를 설정합니다.

줄기세포를 분류할 때 논의 섹션에서 제안한 대로 세포 생존을 촉진하기 위해 기기 설정을 조정합니다. FACS에 의해 FP 양성 세포의 퍼센트에 의해 결정되는 일반적인 효율 저하 범위는 0.1%에서 5%까지 다양할 수 있습니다.10 마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 0.5 - 2mils의 실온 성장 매체를 포함하는 1.5 - 15mil 폴리프로필렌 튜브로 세포를 분류합니다. 수집된 세포를 실온에서 3분간 211배 G로 원심분리한다.

상층액을 조심스럽게 흡인하고 10 마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 200마이크로리터의 성장 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 최대 3,000개의 다양한 세포를 새로운 마트리겔로 코팅된 96 웰 플레이트의 단일 웰로 이동시킵니다. 분류된 세포를 섭씨 37도에서 5%CO2로 24시간 동안 배양하고 배지를 24시간에 5마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 성장 배지로 변경합니다.

그런 다음 48 시간에, 72-96 시간 동안 24 시간마다 ROCK 억제제없이 규칙적인 성장 배지를 세포에 계속 공급하여 포화를 모니터링합니다. 세포가 96 웰 플레이트에서 배양될 수 있을 만큼 충분히 성숙하면 점차적으로 더 큰 플레이트로 통과시키는 것이 좋습니다. 예를 들어 96웰 플레이트의 한 웰에서 24웰 플레이트의 1-2웰로 이동합니다.

그런 다음 거기에서 6웰 플레이트 등으로 다운스트림 목적을 위한 충분한 세포가 생길 때까지 넣습니다. 일반적으로 최소 3-400만 개의 셀이 있습니다. FACS가 풍부하게 농축된 징벌적으로 편집된 세포 집단에서 클론 세포주를 생성하기 위해 단일 세포 현탁액으로 통과시키고 10,000개의 세포를 10cm 플레이트에 플레이트화하고 콜로니가 5-7일 동안 성장할 수 있도록 합니다.

군체가 거시적으로 보이면 격리할 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 해부 현미경에서 P200 피펫을 사용하여 플레이트 표면의 개별 콜로니를 부드럽게 긁어내고 흡인합니다. 콜로니를 포함하는 부피를 96웰 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다.

모든 콜로니가 이식된 후 24시간 동안 섭씨 37도, 5%CO2의 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 24시간에 ROCK 억제제가 없는 일반 성장 배지로 배지를 변경합니다. 그런 다음 군집의 크기가 약 3배가 될 때까지 72-96시간 동안 24시간마다 세포에 계속 공급합니다.

세포는 게놈 DNA 추출을 위해 안탈라이징을 동결 보존할 수 있는 충분한 세포를 갖기 위해 96개의 웰 플레이트에서 성장하고 계대화되어야 합니다. 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 96웰 플레이트를 통과하려면 8채널 흡인기(aspirator)를 사용하여 첫 번째 컬럼에서 매체를 제거하고 폐기합니다.

P200 멀티채널 피펫을 사용하여 약 200마이크로리터의 DPBS를 플레이트의 첫 번째 컬럼에 추가하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 8채널 흡인기를 사용하여 첫 번째 컬럼에서 DPBS 세척을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 첫 번째 열에 40마이크로리터의 해리 시약을 추가합니다.

96웰 플레이트의 최대 총 6개 컬럼에 대해 한 번에 한 컬럼씩 작업하면서 이 단계를 반복합니다. 오염된 우물을 교차하지 않도록 팁을 변경하십시오. 해리 시약이 첫 번째 컬럼에 추가된 시점부터 3-5분 동안 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다.

플레이트의 첫 번째 열에 있는 세포가 바닥에서 들어 올려지기 시작하면 P200 멀티채널 피펫을 사용하여 첫 번째 열에 160마이크로리터의 DPBS를 추가하고 각 웰의 12시, 3시, 6시 및 9시 위치에 있는 세포를 부드럽게 분쇄합니다. cell suspension이 있는 전체 부피를 V-bottom 96 well plate로 옮깁니다. 해리 시약이 있는 나머지 열에 대해 이 단계를 반복하여 우물을 교차 오염시키지 않도록 팁을 변경합니다.

원심분리기의 V 바닥 플레이트를 실온에서 3분 동안 385회 G로 돌립니다. 96 웰 패시징에 대해 이 시점까지 나타난 sub는 세포가 이 플레이트 형태로 계대될 때마다 동일한 방식으로 수행된다. 다음으로 세포를 96웰 형식으로 동결 보존할 준비가 된 경우 진행 방법을 보여 드리겠습니다.

자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 이전 섹션에 표시된 원심분리 단계 후 P200 멀티채널 피펫을 사용하여 상층액을 흡입한 다음 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 60마이크로리터의 성장 배지에 다시 현탁합니다. 모든 우물에 대해 반복하고 교차 오염되지 않도록 팁을 변경합니다.

30마이크로리터의 세포 현탁액을 비마트리겔 코팅된 96웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 나머지 30마이크로리터의 현탁액을 자매 플레이트로 옮긴 다음 혼합하지 않고 각 웰에 170마이크로리터의 동결 버퍼를 빠르게 추가합니다. 이 프로세스는 중복 자매 플레이트에서 수행되므로 개별 플레이트 중 하나가 해동된 후 백업 세포 집단이 존재합니다.

동결 보존된 세포를 96웰 플레이트의 다른 모든 컬럼에만 넣으면 더 빠른 해동이 가능합니다. 접시를 파라필름으로 감싸고 뚜껑이 있는 실온 스티로폼 상자에 넣습니다. 상자 전체를 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다.

24시간 후 플레이트를 스티로폼 상자 밖으로 옮겨 최대 4주 동안 섭씨 영하 86도에서 분류할 수 있습니다. 96웰 형식의 인간 유도 만능 줄기 세포의 동결 보존은 세포 배양에서 일시적인 중단을 허용합니다. 연구원은 클론 광산에서 게놈 검증 분석을 수행하여 향후 연구를 위해 해동할 유전적으로 바람직한 클론을 식별할 수 있습니다.

WTC hiPSC 라인에 타겟 특이적 가이드 RNA Cas9 단백질과 세심하게 설계된 donor template plasmid를 transfection한 지 4일 후, 세포의 0.95%가 GFP를 발현하는 것이 관찰되었습니다. FACS는 모든 GFP 양성 세포를 농축된 모집단으로 분류하는 데 사용되었습니다. 예비 현미경 검사에서는 mEGFP 핵 lamin B1 융합 단백질이 핵막에 국소화될 것으로 예상되는 것으로 밝혀졌습니다.

형광 표지된 단백질은 다양한 강도를 가진 세포의 약 95%에서 관찰되었습니다. 클론 라인 생성 후, 균일한 mEGFP 강도를 가진 클론을 얻고 정확한 편집을 위해 추가 분석했습니다. 결론적으로, 우리는 내인성으로 조절되는 형광 융합 단백질의 발현을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 유전자 편집하기 위한 transfection 방법을 보여주었습니다.

일반적인 knock 비효율성이 낮기 때문에 여기에 표시된 FACS 방법과 같은 일부 농축 전략은 융합 단백질을 발현하는 것으로 추정되는 편집된 세포 집단을 생성합니다. 농축된 모집단은 생물학적 연구에 사용될 수 있으며, 또는 이 방법에 설명된 대로 클론 세포주를 생성할 수 있으며, 이를 통해 정확하게 유전자 편집된 세포주를 식별할 수 있습니다. 게놈에서 Cas9 유도 이중 가닥 절단은 의도된 유전자 자리에 태그가 통합되었음에도 불구하고 종종 부정확하게 복구된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

또한 단대립유전자로 편집된 클론에서 태그가 지정되지 않은 대립유전자에는 비상동 말단 결합 복구로 인해 발생할 가능성이 가장 높은 indel이 포함되어 있는 경우가 많습니다. 이러한 발견은 클론 세포주의 게놈 분석을 통해서만 밝혀진 CRISPR Cas9 knock in 이후 유전자 검증의 중요성을 강조합니다. 예상되는 융합 단백질의 발현만으로는 정확한 편집을 보장할 수 없습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 편집하기 위해 이 프로토콜을 사용할 때, 최적의 세포 생존과 최소한의 자발적 분화를 위해 세포를 부드럽게 취급할 수 있도록 서면 프로토콜에 자세히 설명된 권장 사항을 따라야 합니다. 이 비디오와 관련 프로토콜 및 재료 목록이 귀하의 실험실에서 좋아하는 단백질에 대해 유사한 실험을 수행하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.