Name: 조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 학습하세요 조혈 줄기 세포 이식을 통해 유전자 변형 조혈 세포의 악성 잠재력을 평가하는 방법을. 이 기술은 골수형성이상증후군의 질병 유발 세포를 식별하고 암 줄기 세포의 기능 분석 기반을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회 (ZIA SC 010378와 BC 010983 번호 부여).

이 문서에서 설명 하는 동물 절차 베 데스 다 동물 관리 및 사용 위원회, 국립 암 연구소에 의해 승인 했다 그리고 인간적 관심과 실험실 동물의 사용에는 공중 보건 서비스 정책에 포함 된 정책 준수는 동물 복지 행위, 그리고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드.
1. 세포 준비
<ol><li>수확 골 nucleated 세포 (BMNC)<ol>
<li>메 마른 재료만을 사용 합니다. 소독 증기 압력솥을 사용 하 여 다시 사용할 수 있는 악기. 바늘, 주사기, 그리고 단일 사용 무 균 용기에 플라스틱 도자기를 구입. 유형 a 2 생물 안전 캐비닛 클래스 II에서 모든 동물 및 세포 조작을 수행 합니다.</li>
		<li>HF2 3 mL를 포함 하는 하단 튜브 라운드 14 ml에서 BMNCs 준비 (행 크의 균형 소금 솔루션 2% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충).</li>
		<li>C57Bl6 기증자 쥐 (CD45 대립 유전자 CD45.2에 대 한 긍정적인), 일반적으로 2-6 개월, 나이 CO2 챔버를 사용 하 여 안락사</li>
		<li>스프레이 병으로 몸 전체에 70% 에탄올을 분사 하 여 마우스 시체를 소독. 발목 아래로 골반에서 다리에서 피부를 벗 겨.</li>
		<li>살 균 (직선, 샤 프/샤 프, 11.5 c m)가 위와 집게 (Graefe, 톱니, 0.8 m m 팁 폭)를 사용 하 여 시체에서 femora 및 경골을 제거 합니다. 명확 하 게 연결 된 근육을 잘라.</li>
		<li>경골의 근 위 및 원심 끝은가 위로 잘라. 집게와 경골을 잡고, 경골 (발목)의 원심 끝에 tibial 골 수 구멍으로 HF2의 2.5 mL를 포함 하는 27-게이지 3 mL 주사기를 삽입 합니다. 하단 튜브 라운드 14 mL에 부드러운 압력을 사용 하 여 경골에서 골 수 세포를 플러시.<ol>
<li>다른 경골에 대 한 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>가 위는 대 퇴 골의 근 위 및 원심 끝을 잘라. 플러시 20 게이지 바늘을 삽입 하 여 대 퇴 골 골 수 구멍에 대 퇴 골 골 수 구멍의 선단부 HF2의 2.5 mL를 포함 하 고 주사기에 부드러운 압력을 적용 3 mL 주사기에 부착.<ol>
<li>다른 대 퇴 골, 두 경골에서 모든 골을 수집에 대 한 반복 하 고 동일한 14 ml femora 원형 하단 튜브.</li>
		</ol>
</li>
		<li>위쪽 및 아래쪽 3 mL 주사기에 부착 된 동일한 20 게이지 바늘으로 여러 번 발음 하 여 골 수 질량을 분산.</li>
	</ol>
</li>
	<li>항 체 BMNC의 얼룩<ol>
<li>수 BMNC입니다. 1.1.8 단계에서 생성 된 BMNC 서 스 펜 션의 20 µ L를 3% 초 산 용액의 20 µ L를 추가 합니다. 그런 다음는 hemocytometer와는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 계산 합니다.</li>
		<li>BMNC에서 4 ° c.에서 5 분 동안 450 x g 부드러운 원심 분리 하 여 펠 렛 HF2와 펠 릿 107 셀 당 90 µ L를 사용 하 여 resuspend을 셀 서 스 펜 션에 biotinylated 반대로 혈통 항 체 칵테일의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 20 분 동안 잠복기 후 얼룩진된 셀 3 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)을 씻는 다.</li>
		<li>107 셀 당 HF2의 100 µ L 함께 BMNC resuspend 2 µ L allophycocyanin (APC)의 활용 방지 비오 틴 항 체는 세포 현 탁 액, 20 분 동안 4 ° C에 외피 다음에 추가 합니다.</li>
		<li>3 mL의 PBS로 얼룩진된 BMNC를 헹 구 고 HF2 0.2 µ g/mL 흐름 cytometry 셀 정렬 propidium 요오드 화물 (PI)의 보충과 BMNC resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow cytometry 세포 BMNC의 분류<ol>
<li>교류 cytometry 셀 정렬 보정. 모든 광 전 증폭 관 관 (Pmt), 분산형, 및 흠 없는 세포를 사용 하 여 형광 매개 변수를 최적화 하 고 각 검출기의 선형 범위 내에서 설정.</li>
		<li>흠 없는, PI-스테인드, 준비 하 고 APC 라는 혈통 단계 1.2에서에서 병렬로 칵테일 셀. 스펙트럼 보상에 대 한 분석.</li>
		<li>더블 릿 셀의 FSC-H 대 SSC-H, 640-SSC-H 640-SSC-A 대 대 640-SSC-S 640-SSC-W. 순차 게이팅 하 여 차별</li>
		<li>561 및 방출 614/20 밴드 패스 필터와 수집에 PI 흥분된을 사용 하 여 미달 셀을 제외 합니다. 자극 혈통 APC 671/30 밴드 패스 필터와 640 nm 및 수집 방출에서 셀을 표시 합니다.</li>
		<li>전압 높이 형광 값을 기록 하 고 목록 모드 데이터 파일을 정렬 인구 시각화에서 적어도 100000 이벤트를 수집 합니다.</li>
		<li>다음에 대 한 10000 셀의 3 개의 샘플을 얻은 후 스펙트럼 보상 계산: 셀, 셀을 표시 하는 PI 및 APC 세포 분류와 활용 된 반대로 혈통 항 체 칵테일 레이블 없음.</li>
		<li>10 %FBS 미디어의 0.5 mL를 포함 하는 5 mL 튜브에 밝은 형광 (LP2)와 계보 부정적인 (LN), 희미 한 형광 강도 (LP1)와 LP 인구 혈통 긍정적인 (LP)을 정렬 하려면 3 개의 영역을 설정 합니다.</li>
		<li>한 방울을 사용 하 여 정렬 셀 포함 하 고 중단 모드를 정화.</li>
		<li>순도 및 정렬된 셀의 정렬 된 각 샘플에 1000 총 셀 게시물 정렬 분석을 수행 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 450 x g에서 원심 분리에 의해 정렬 된 세포를 수집 하 고 HF2의 0.5 mL와 펠 릿 셀 resuspend.</li>
		<li>정렬된 셀 hemocytometer Trypan 블루와 번호를 확인 합니다. 이 식 위한 HF2와 휴대폰 번호를 조정 합니다. 참고: BMNC 인구의 넓은 스펙트럼 1.2.2 위의 단계에서 추가 조합의 형광 색소 활용 된 항 체를 사용 하 여 이식에 대 한 격리 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 받는 사람 마우스 준비 및 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)
<ol><li>이식 받는 사람의 준비<ol>
<li>동물 축산 congenic 받는 사람 마우스 (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 시설에서 들을 유지.</li>
		<li>위장 트랙의 예방 오염에 대 한 치명적인 복용량 (9 Gy) 방사선 조사, 이전 7 일 동안 100 mg/L ciprofloxacin 받는 사람에 게의 포함 하는 메 마른 물 제공 하 고 조사에 따라 14 일 동안 유지 합니다.</li>
		<li>Cs 소스에서 치명적인 복용량 (9 Gy) 방사선 조사를 다음과 같이 제공 합니다. 훈련, 인증 된 Cs 연산자를 사용 합니다. Cs 소스 악기 70 cGy/분 몸 전체 감마 방사선을 전달 하기 위해 설정 합니다. 맞춤형 홀더에서 10 마우스를 놓고 홀더 irradiator 챔버에 삽입 합니다. 13 분에 9 Gy 총 몸 방사선 조사를 제공 하 고 그들의 감 금 소에는 마우스를 반환 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조 혈 줄기 세포 이식<ol>
<li>혼합 야생 타입 (WT) congenic 받는 사람 마우스 (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) 마우스와 함께 2 ~ 5 x 10 당 2 × 105 셀의 셀 복용량에서 BMNC BMNC 준비 정화 테스트의4 셀 흐름 cytometry 위의 설명된에서 1.3으로 정렬. 셀 같은 주사기에 혼합. 참고: WT BMNC 받는 사람 마우스에 방사선을 살려주는 효과 제공 하 고 테스트 셀 조를 지원 하지 않는 경우 받는 사람 마우스의 생존에 대 한 허용. WT BMNC CD45.1 대립 유전자 표현 이런이 종류의 실험에 사용 하 고 따라서 구분할 수 있습니다 CD45.1과 CD45.2 사이 감 별 하는 항 체를 사용 하 여 테스트 셀에서. WT BM 셀 "도우미 셀", "방사선을 살려주는 세포", 또는 "경쟁 세포" 라고 하.</li>
		<li>주사를 촉진을 위한 살 균 HF2를 사용 하 여 받는 사람 당 200 µ L 셀 혼합 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>치명적 방사능된 받는 사람 마우스를 통해 정 맥 꼬리 정 맥 주입에 1 mL 주사기와 방사선의 24 시간 안에 28 게이지 바늘을 사용 하 여 셀 혼합물을 이식. 열 꼬리 정 맥 팽창 리드 열 램프 아래 마우스 꼬리를 놓습니다. 참고: 연구의 끝에 모든 받는 사람 마우스를 안락사 하 고 검 시, 조직학, cytometry에 의해 질병의 진행을 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. engraftment 분석 결과 Flow Cytometry 사용 하 여
<ol><li>기증자 세포 engraftment를 평가 하려면 6 주, 12 주, 그리고 이식 후 16 주 사용 받는 사람 마우스에서 말 초 혈액 (PB)을 수집 합니다.</li>
	<li>약 1 분 동안 열 램프와 새에서 받는 사람을 따뜻한 고 마우스는 restrainer 합니다.</li>
	<li>메스 (블레이드 10, #3 메스 핸들)와 꼬리 정 맥을 절단 하 고 EDTA 항 응고 제에로 포함 하는 microcapillary 튜브를 사용 하 여 받는 사람 마다 PB의 100 µ L를 수집 합니다.</li>
	<li>수집 된 PB을 살 균 microcentrifuge 튜브에서 50 µ L를 배치 하 여 두 개의 동일한 aliquots에 나눕니다. (NCI Histopathology 코어에서 수행) 자동화 완료 혈액 검사 (CBC)에 대 한 한 약 수를 사용 하 고 두 번째 약 수를 사용 하 여 항 체 얼룩이 지기에 대 한 cytometry 흐름.</li>
	<li>Cytometry에 의해 기증자 engraftment를 검색, 수집된 PB의 50 µ L을 소형 RBC 세포의 용 해 버퍼 (8.29 g/L NH4Cl, KHCO3, 나2EDTA, pH 7.2 0.037 g/L의 1 g/L)의 1 mL을 추가 하 여 적혈구 (RBC) lyse. 소용돌이 혼합 하 여 샘플을 실 온에서 10 분을 품 어.</li>
	<li>원심에서 4600 x g lysed PB 1.5 분 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 삭제.</li>
	<li>부분적으로 부드럽게 도청 또는 "터치" 튜브의 아래쪽 셀 펠 렛을 방해. 1.3 mL PBS의 펠 릿에 위치한 1.5 분에 4600 x g에서 원심 분리기와 신중 하 게 aspirate 삭제는 상쾌한 추가 합니다.</li>
	<li>감청 또는 flicking, 셀 펠 릿 고 HF2 5% 쥐 혈 청 셀 펠 릿 보충의 200 µ L을 추가 됩니다.</li>
	<li>추가 안티-CD45.2 항 체 (1 µ L) allophycocyanin (APC) 세포 현 탁 액을 함께 활용 합니다. 적어도 30 분, 그리고 짧게 소용돌이 혼합물에 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>얼룩, 후 위에서 설명한 대로 두 번 셀을 세척 하 고 HF2 PI의 1 µ g/mL와 보충의 400 µ L 함께 resuspend.</li>
	<li>사용 하 여 4 색 교류 cytometer engraftment를 감지 합니다. 추가 추가 항 체 특정 세포 유형, B 또는 T 세포 등을 감지 하 여 말 초 혈액 내의 셀 형식에 대 한 추가 정보를 가져올.</li>
	<li>데이터의 추가 분석에 대 한 있도록 스프레드 시트를 사용 하 여 직렬 engraftment 데이터를 기록 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
<li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+2015+Update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li>
<li>Heaney, M. L., Golde, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10341278">Myelodysplasia.</a> The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18467609">Myelodysplastic syndromes.</a> Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).</li>
<li>Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+features+of+myelodysplastic+syndromes%3A+results+from+regional+cancer+surveys+and+hospital-based+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics.</a> International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).</li>
<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
<li>Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98+gene+fusions+and+hematopoietic+malignancies%3A+common+themes+and+new+biologic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights.</a> Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXD13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. <a target="_blank" href="https://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/286455">Preleukemic acute human leukemia.</a> Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).</li>
<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

공개 하는 것이 없다.

MDS는 클론 조 혈 줄기 세포 장애, MDS "줄기", 또는 시작 셀 특징 되었습니다 아직 없습니다. 우리는 이전 MDS transplantable WT 쥐 HSCT, macrocytic 빈혈증, leukopenia, 호 중구 감소 증, 그리고 발육 이상15의 morphologic 증거 특징에 의해 NHD13 쥐에서 골 수를 사용 하 여 될 수 있는 시연 했다. 또한, 경쟁력 있는 repopulation 분석 NHD13 MDS 골 수에서 세포의 성장 우위를 확인. 함께 찍은, 이러한 결과 MDS 줄기 또는 시작 셀의 존재 의미. 추가 실험은 진행 중인 지금,는 immunophenotypic 정제 목적으로 시작 하는 MDS의 특성15 더 정의 된 줄기와 조상 세포 마커 (CD150, CD48, c-Kit 및 Sca 1)를 사용 하 여16 계보와 결합 마커 얼룩이 프로토콜에서 설명 하는 방법입니다.</p...

형성 증후군 (MDS) 대표 클론 혈액 장애 효과 조, 발육 이상의 morphologic 증거 및 급성 골수성 백혈병 (AML)1,2로 변환에 대 한 성향 특징의 다양 한 세트 ,,34. 효과 조 골 수에서 성숙 체포 및 hypercellular 골1,3에 불구 하 고 주변 혈액 cytopenias 결과 인식 됩니다. MDS의 발병 률 각종 2-12의 경우는 미국에서 매년 100, 000 명 당으로 추정 하 고 MDS의 발병 률 증가 나이, 노화 미국 인구3, 주어진 이해 하는 중요 한 조건 만들기 5. MDS의 대부분의 경우는 더 명확한 병 인, MDS의 경우 벤젠, 그리고 암 화학요법6같은 용 매를 포함 하 여 알려진된 차적인 에이전트에 노출 때문에 생각 된다.
MDS 환자 일반적으로 MDS 셀7에 돌연변이 인수 했습니다. 비록 상대적으로 드문, MDS 환자 수 유전자 NUP98, EVI1, RUNX1, MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) 등을 포함 하는 균형된 염색체 translocations를 인수 했습니다. 우리 연구소는 염색체 translocations, NUP98 유전자8을 포함에 대 한 오랜 관심 있습니다. 유전자 변형 마우스 NUP98-HOXD13 (NHD13) transgene Vav1 발기인에 의해 규제 및 증강 요소 표시의 모든 MDS, 주변 혈액 cytopenias, 발육 이상, 및 AML9 변환 형태 론 적 증거를 포함 하 여 주요 기능을 표현 .
MDS는 60 년10에 대 한 인정을 받고 있다 고 클론 줄기 세포 장애로 간주 됩니다, engraft 인적 MDS 셀 immunodeficient 마우스에 노력 하지 크게 성공 했습니다, MDS 셀 engraft 저조한11, 때문에 12,,1314 및 쥐 임상 질병을 개발 하지 않습니다. 조 혈 모 세포는 MDS를 전송할 수 있습니다 식별 하는 노력에서 우리 NHD13 모델 그리고 모든 주변 혈액 cytopenias를 포함 하 여 인적 MDS의 기본적인 기능을 보여준 질병 엔터티로 MDS를 engraft 수 있는 우리가 나타났다 발육 이상, 그리고 AML15변환입니다. 이 보고서에서 우리는 MDS 시작 셀을 식별 하기 위해에서 이러한 실험, 뿐만 아니라 조 혈 줄기와 선구자 세포 (HSPC), 더 이상 충분치 접근의 기술적인 세부 사항 제시.

<table><tbody><tr><td>14 mL 라운드 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 항체</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>3 mL 주사기</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>27-G 바늘</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>20-G 바늘</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>305176 Lineage Cocktail</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>Anti-Biotin 항체</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT#</td></tr><tr><td>5171109046 1 mL 주사기</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>인슐린 주사기</td></tr><tr><td>가열 램프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>FACS 기계</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 레이저, 5개의 색 검출기</td></tr><tr><td>FACS 선별 기기</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5개의 레이저, 23개의 매개변수, 6개의 집단 동시 분류</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>감마 조사기</td><td>최고의 테라트로닉스</td><td>감마셀 40</td><td></td></tr><tr><td>혈액 채취관</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>수상자 마우스</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 마우스</td><td>n/a</td><td>C57Bl/6, CD45.2</td><td>Colony maintained at NIH</td></tr><tr><td>5 mL round bottom tube</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

조 혈 줄기 세포 이식 myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

형성 증후군 (MDS) 효과 조, 말 초 혈액 cytopenias, 발육 이상, 급성 백혈병에 변환에 대 한 성향에 의해 정의 되는 조 혈 줄기 세포 장애의 다양 한 그룹입니다. NUP98-HOXD13 (NHD13) 유전자 변형 마우스 주변 혈액 cytopenias, 발육 이상, 및 급성 백혈병 변환 인적 MDS 정리. 우리는 이전는 MDS 옮겨질 수 있었다 MDS와 유전자 조작된 마우스에서 야생-타입 받는 사람에 게 이식 MDS 골 nucleated 세포 (BMNC)에 의해 설명 했다. 더 명확 하 게 근원의 MDS 셀 이해, 특정 이식 하는 방법을 개발 했습니다, 그리고 immunophenotypically 조 혈 하위 집합을 정의 합니다. 이 문서에서 우리는 분리 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 특정 인구를 이식 하는 과정을 설명 합니다. 따라 이식, 이식의 효율성 및 기증자 MDS 셀의 지 속성을 평가 하는 방법 설명 합니다.

우리는 몇 가지 실험의 결과 대 한 대표적인 수치를 보여줍니다. 그림 1 실험 정렬 대표 cytometry를 보여준다. 정상적인 조 혈 차별화, 동안 세포가 특정 조 혈 혈통에 최선을 다하고 그들은 혈통 정의 세포 표면 마커를 확보 고 자기 갱신에 대 한 가능성을 잃게. 따라서, 야생-타입 마우스, 줄기 세포 자체-갱신은 혈통 부정적인 BMNC에 국한. 이 실험에서 우리 혈통-부정, 낮은 혈통 긍정적인, 그리고 높은 혈통 양성 세포로 NHD13 골 수에서 BMNC 정렬. 이러한 정렬 셀 다음 자기 갱신 용량을 확인 받는 사람 WT에 이식 했다.
그림 2 는 별도 실험에서 결과 혈통에 부정적인 세포 또는 MDS와 NHD13 기증자에서 정렬 되지 않은 셀 치명적...

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

이 방법은 악성 종양을 시작하는 세포의 특성화에 대한 악성 필드의 방법에있는 몇 가지 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이러한 암 줄기 세포의 기능적 분석을 위한 기초를 제공한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 밀로이드 플라스틱 증후군 또는 MDS의 치료가 세포를 시행성화하는 질병의 식별에 도움이 될 수 있기 때문에 확장됩니다.입양 이송을 위해 수령인을 준비하기 위해 이식 1주일 전에 시프로플로사신 리터당 100밀리그램을 보충하여 특정 병원체 가없는 동물 시설에서 7일 동안 genic 받는 사람 동물을 속입니다. 일곱 째 날, 훈련된 공인 세슘 17 운영자가 분당 총 신체 감마 조사 70센티미터를 전달하기 위해 세슘 소스 장비를 설정했습니다. 사용자 정의 설계 홀더에 10 마우스를 배치합니다.홀더를 조사실에 삽입하고 13분 만에 9개의 회색 총 신체 조사를 제공합니다. 그런 다음 동물을 새장에 반환합니다. 다음 아침, 전체 2 ~ 6 나방 오래된 C57 검은 여섯 마우스에 70 %의 에탄올을 스프레이하고 발목에 골반에서 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다.가위와 함께 집게를 사용하여 페모라와 경골을 제거하십시오. 뼈에서 근육을 깨끗하게 다듬습니다. 경골에 대 한 근위 및 말단 끝을 잘라 하 고 집게와 하나의 경골을 선택.골수 구멍에 27 게이지 바늘을 장착 한 3 밀리리터 주사기를 삽입하고 2 %의 태아 소 혈청 또는 HF2로 보충 된 행크스의 2.5 밀리리터S를 포함하는 14 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 골수를 플러시하십시오. 모든 골수가 수집되면, 20 게이지 바늘 끝을 통해 조직을 여러 번 흡인하여 골수 질량을 하나의 현탁액으로 분산시다. 골수 핵세포 또는 BMNC를 유량 선별에 라벨을 부착하기 위해, 심방화에 의해 세포를 수집하고 HF2 농도의 90 마이크로리터 당 10~7번째 BMNC로 10회에서 펠릿을 다시 중단한다.다음으로, 생체 화, 안티 리니지 항체 칵테일의 10 마이크로 리터를 세포 현탁액에 섭씨 4도에서 20 분 동안 배양하십시오. 그 다음에 는 PBS의 3 밀리리터에서 원심분리기 세척이 진행됩니다. 7세포에 1회 1회 당 HF2의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다.이체는 APC의 2개의 마이크로리터로 세포를 라벨로 분류하여 항비오틴 항체를 공주한다. 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 20개의 미네에트 후, 신선한 PBS의 3밀리리터로 세포를 씻으십시오. 다시 HF2에서 펠릿을 일시 중단 하여 0.2 얼음에 프로피듐 요오드의 밀리 리터 당 마이크로 그램보충.이제 스테인드 된 세포를 사용하여 유동 세포 분석 셀 선별기를 보정하여 각 검출기의 선형 범위 내에서 모든 광증 증식 관, 산란 및 형광 파라미터를 모두 최적화합니다. 표지되지 않은 PI 표지및 안티 리니지 APC 표지셀에 대해 10, 000 셀의 3개의 샘플을 획득한다. 정렬의 끝에서, 정렬 된 세포의 순도 및 생존가능성을 확인하기 위해 각 샘플에서 1, 000 세포를 분석한다.원심분리기의 샘플을 회전시. 그런 다음 계산을 위해 HF2의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 선별된 세포의 양용 전달을 위해, 멸균 HF2에서 원조양동물로부터 제5 야생형 BMNC에 2배의 마이크로리터 100개를 혼합한다.100 마이크로리터를 10~5회 10회 10회 10회 까지, 수령인 동물당 마이크로 원심분리기 튜브에서 멸균 HF2에 대한 관심있는 선별된 기증자 BMNC. 200 마이크로리터의 셀을 받는 사람당 28개의 게이지를 장착한 밀리리터 주사기 1개를 적재합니다. 이어서, 수신자 마우스를 열램프 아래에 놓으면 꼬리 정맥 팽창을 유도한다.꼬리 정맥을 통해 각 치명적으로 조사 받는 사람 동물에 세포 혼합물을 전달합니다. 줄기세포자가재생은 계보 음성야생형 BMNC에 국한됨에 따라, 리니지 네거티브, 낮은 계보 양성, 및 고계 양성 세포는 각 세포 집단의 자기 재생 능력을 결정하기 위해 야생형 수령인으로 분류및 이식된다. MDS 모델 동물로부터 의학적으로 이식된 기증자 트랜스 유전 BMNC는 CD45.2 세포 표면 마커 발현에 의해 전 생체를 구별할 수 있다.혈통 의 이식 후 16 주 부정적인 BNMC, 또는 형질형 MDS 기증자 동물에서 분류되지 않은 BMNC, 트랜스 제닉 세포 밖으로 CD45.2 양성 기증자 세포의 증가 비율에 의해 입증된 바와 같이 야생 형 세포경쟁, 치명적인 조사 받는 동물의 말초 혈액에서 관찰. 여기서 형질전환 MDS 세포로 이식된 마우스로부터의 백혈병 변환으로부터의 세포가 나타난다. 수많은 폭발과 미숙한 형태의 존재를 유의하십시오.절차를 시도하는 동안, 세포에 과도한 스트레스를 배치 할 수 있기 때문에 전 생체 조작의 시간을 제한하는 것이 중요합니다, 세포 죽음 또는 기능적 손실의 결과로. 개발 후이 기술은 유전 으로 조작 된 마우스에서 질병의 근원을 탐구하기 위해 악성 종양에 넣어 현장 프로그램에 있는 연구원을 위한 길을 포장합니다.

use-hematopoietic-stem-cell-transplantation-to-assess-origin

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 프로토콜은 세포 분류에 의한 줄기세포의 사전 정제 없이 조혈 줄기세포/전구 세포 기능을 연구하기 위해 경쟁력 있는 마우스 골수 이식 실험을 설정하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

MDS 진단 기준 형태학 또는 비 유익한 세포 유전학의 부재에 어렵습니다. MFC는 MDS 진단 과정을 구체화 도움이 될. 임상 연습에 유용 될, MFC 분석 기반으로 해야 합니다 매개 변수 충분 한 특이성 및 감도, 그리고 데이터 다른 연산자 사이 재현 되어야 합니다.

데이터베이스 가이드-cytometry 골 골수성 세포 성숙의 평가 위한

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

대퇴골 내 주사는 세포를 골수강에 직접 배치하여 소수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 생착할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골 내 주사하는 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

면역저하 마우스에 인간 조혈모세포와 전구세포의 대퇴골내 주입 

학습하세요 조혈 줄기 세포 이식을 통해 유전자 변형 조혈 세포의 악성 잠재력을 평가하는 방법을. 이 기술은 골수형성이상증후군의 질병 유발 세포를 식별하고 암 줄기 세포의 기능 분석 기반을 제공합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

더 많은 동영상 탐색