Name: Paracrine 신호 세포 사이 공부 하는 인접 문화 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 학습하세요 난소암 세포와 HPMC를 이용한 인접 배양법으로 파라크린 신호를 연구하는 방법입니다. 이 기술은 종양 미세환경에서 세포 간 상호작용을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는이 실험에 대 한 조직 컬렉션에 그들의 참여에 대 한 환자에 게 빚을입니다. 국방부 OCRP 난소 암 아카데미 상 (W81XWH-15-0253) 및 Anirban K. 미트 라에 콜린의 꿈 재단에서 파일럿 수상이이 연구 지원.

프로토콜은 인디애나 대학의 제도적 규제 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 세포 준비
<ol><li>
절연 및 인간의 기본 mesothelial 세포의 문화
	<ol>
<li>격리 인간의 기본 mesothelial 세포 (HPMCs) 인간의 omentum17,18 위에서 설명한 고에 그들을 성장에서 성장 매체 [Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 포함 된 완료 페니실린-스, 1% 비 본질적인 아미노산, 및 1% 비타민] 37 ° C, 5% CO2. 참고:는 HPMCs는 100% 합류 (그림 1A)에 일반적으로 성장 된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
난소 암 세포의 성장 조건
	<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2에서 완전 한 성장 매체에 HeyA8 난소 암 세포 성장. 참고: 사용 HeyA8 세포 성장된 약 80% 합류 (그림 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 배양
<ol><li>
인접 문화 설정
	<ol>
<li>사용 Transwell 0.4 μ m (108 모/cm2) 공과 4.67 cm2 성장 지역으로 10 μ m 두께 조직 문화 처리 폴 리 카보 네이트 막으로 6 잘 플레이트에 대 한 삽입합니다. 필요한 경우, 성장 영역에 따라 시드 셀의 수를 확장 하 여 다른 삽입 크기에 대 한 최적화. 따뜻한 완벽 한 성장 매체, 트립 신, 그리고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° c 사용 하기 전에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
삽입을 준비 하 고
	<ol>
<li>삽입의 막의 낮은 표면에 HeyA8 셀 씨앗 소독 집게를 사용 하 여 포장에서 삽입을 제거 하 고 살 균 15 cm 문화 접시에 거꾸로 배치.</li>
		<li>그것이 거꾸로 삽입을 수용 하거나 어떤 적절 한 살 균 컨테이너와 대체 깊이 15 cm 접시를 사용 합니다. 실험에 따라 15cm 접시에 삽입의 필요한 수를 놓습니다.</li>
		<li>레이블 컨트롤 세 개 및 3 개의 실험 조건 따라 삽입의 가장자리에 표시와 함께.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
암 세포 준비
	<ol>
<li>25 c m2 플라스 크 (2 ~ 106 셀 x) 합류 점 80%에 성장 하는 HeyA8 세포 trypsinize, 40-60 s에 대 한 트립 신 (0.25%)의 1 mL를 추가 하 고 완전 한 성장 매체의 6 mL와 트립 신을 중화.</li>
		<li>실내 온도 (RT) 3 분 동안에 500 x g 에서 세포를 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 완전 한 성장 매체의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. Trypan blue 염료 제외 메서드를 사용 하 여 라이브 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
암 세포를 뿌리기
	<ol>
<li>완전 한 성장 매체에 라이브 HeyA8 셀의 100000 셀/mL를 일시 중단 합니다. 신중 하 게 (지금 직면 하 고, 반전은 이후) 삽입의 하단에 완전 한 성장 매체의 800 μ에 80000 HeyA8 셀 씨.</li>
		<li>셀 삽입 (그림 1C)에 남아 있도록 돔 모양 형성 세포 씨앗 막의 센터에서 시작 하 고 천천히 pipetting 동안 동심원에서 바깥쪽으로 이동. 매체의 어떤 유출 방지 하기 위해 가장자리에서 3 m m 이상가 하지 마십시오. 참고: 시드 셀의 수는 세포의 성장 속도 실험의 기간에 따라 달라 집니다. HeyA8 셀이 인접 문화에 대 한 시드 수 최적화 했다 고 셀 3 일간의 끝에 80-90% 합칠을 될 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
암 셀 첨부 파일
	<ol>
<li>15 cm 접시를 커버 하 고 신중 하 게 CO2 배양 기에 삽입을 포함 하는 접시를 이동 합니다. 그것은 매체 및이 단계에서 삽입에 셀의 드롭 방해 중요입니다. 암 세포는 삽입을 연결할 수 있도록 4 h 37 ° C에서 세포를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesothelial 세포 준비
	<ol>
<li>약 4 h 후 trypsinize HPMCs 1-2 분에 대 한 트립 신 (0.25%)의 2 개 mL와 75 c m2 플라스 크 (4 ~ 106 셀 x) 합류 점 100%에 성장 하 고 완전 한 성장 매체의 12 mL와 트립 신을 중화.</li>
		<li>500 x g RT에 3 분에 세포를 원심, 완전 한 성장 매체의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend 고 trypan blue 염료 제외 메서드를 사용 하 여 라이브 셀.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesothelial 세포 시드
	<ol>
<li>완전 한 성장 매체에 라이브 HPMCs의 300, 000 셀/mL를 일시 중단 합니다. 6 잘 플레이트의 각 음에 신선한 완전 한 성장 매체의 2.5 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 biosafety 후드에 밖으로 삽입을 포함 하는 15 cm 접시 가져. 소독 집게를 사용 하 여 삽입을 플립 하 고 완전 한 성장 매체 (그림 1C)에 낮은 표면에 부착 된 HeyA8 세포와 직 립, 그렇게 6 잘 플레이트의 우물에 두십시오.</li>
		<li>씨앗 450000 HPMCs HPMC 컨트롤에 대 한 HeyA8 셀 없이 삽입 (그림 1C) 우물의 아래 직면 하 고 표면에 연결 하는 HeyA8 세포와 삽입의 안쪽에 성장 매체의 1.5 mL 중에 일시 중지. HeyA8 컨트롤에 세포 없이 성장 매체의 1.5 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
성장 하는 인접 문화
	<ol>
<li>인접 문화 72 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 에서 CO2 인큐베이터에서 성장 하자. 필요한 경우, 매체를 다음과 같이 보충 수 있습니다.<ol>
<li>삽입의 내부에 대 한 750 µ L을 제거 하 고 신선한 완전 한 성장 매체의 750 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>삽입 (6 잘 플레이트)의 외부에 대 한 1 mL을 제거 하 고 신선한 완전 한 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다. 1 mL 변경 한 번에 매체의 편의 위해 선택 되었다. 원하는, 1.25 mL은 제거 하 고 대신 대체 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀을 수집
	<ol>
<li>인접 문화의 72 h 후 세포를 수집 합니다. HeyA8 셀과 HPMCs Trypsinize의 교차 오염을 방지 하기 위해이 단계에서 특별 한 주의 셀, 그들, 원심 고 교차 오염을 방지 하기 위해 멤브레인에 세포를 lysing 대신 펠 릿을 lyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trypsinizing 셀
	<ol>
<li>1 x PBS와 삽입의 양쪽 모두를 씻어.</li>
		<li>새로운 우물을 삽입 전송 하 고 트립 신을 추가 합니다. 삽입의 안쪽에 트립 신 0.5 mL을 추가 하 고 trypsinize는 삽입의 낮은 표면에 부착 된 암 세포를 6 잘 플레이트 trypsin의 2 개 mL를 추가. 37 ° c.에 2 분 동안 접시를 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
중화는 트립 신
	<ol>
<li>중화 하는 트립 신, 아래로, 플라스틱 그리고 다음 셀을 받아 고 레이블된 컬렉션 튜브에 그들을 전송 삽입의 내부에 완전 한 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다. 완전 한 무력화에 대 한 완전 한 성장 매체의 추가적인 2 mL를 추가 합니다. 하지 막 세포의 교차 오염을 방지 하기 위해 pipetting 동안 피어스를 주의 한다.</li>
		<li>삽입의 하단에 있는 세포를 수집, 그 2 mL trypsin 플라스틱 추가 단계 12.2 아래쪽 표면에서 2-3 배 셀 6-잘 접시의 바닥에가. 성장 매체의 6 mL 접시의 하단에 트립 신을 무력화 하 고 레이블된 컬렉션 튜브 플레이트의 내용을 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수집 하 고 세포를 lysing
	<ol>
<li>500 x g 3 분에 세포를 원심 하 고 미디어를 발음. Resuspend 및 RNA 추출에 대 한 페 놀 및 guanidine-안산-기반 세포 시 약의 0.7 mL와 함께 셀 펠 릿을 lyse. 어떤 적당 한 키트를 사용 하 여 RNA를 분리.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응
참고: 다음 단계 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 인접 문화 결과로 유전자 식 변화 연구를 설명 합니다.
<ol><li>정량에 대 한 RNA 샘플에서 cDNA를 준비 합니다. 해당 버퍼와 무작위 뇌관 어떤 적당 한 역전사를 사용 하 여 모든 mRNA의 반전 녹음 방송을 위해 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>Fibronectin (FN1) 및 E-cadherin (CDH1)의 mRNA 식 수준에 변화를 평가 하 고 변형 성장 인자 베타 1 (TGFβ1) glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH)는 내부 제어와 정량에 의해. 표준화 된 상용 유전자 표정 분석 실험 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 뇌관 디자인 가능 하다.</li>
	<li>HPMC 컨트롤과 인접 문화에서 성장 하는 HPMCs와 HPMCs HeyA8 컨트롤과 인접 문화에서 성장 하는 HeyA8 셀을 비교 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li>
<li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation%2C+Wound+Healing%2C+and+Tissue+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li>
<li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li>
<li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals%3A+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+niche%3A+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li>
<li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li>
<li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li>
<li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li>
<li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li>
<li>Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> 43-58 (2016).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li>
<li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Paracrine juxtacrine 세포 사이 신호의 메커니즘을 이해 하는 것은 정상 조직의 항상성 및 질병 조건7,8의 더 나은 지식을 개발 필수적입니다. 대부분 paracrine 신호를 수집 하 여 연구를 실시 한 셀에서 다른 셀 형식 치료를 사용 하 여 중간 조절. 이 메서드는 고유의 단순에는 이점이 있다. 그러나, 그것 않습니다 하지 정확 하 게 정리 휴대 전화 microenvironment에 secreted 요소의 지역화 된 농도 또는 생산의 속도 론과 관련 된 요인의 고갈. 전 어느 정도 해결 될 수 있다, 그러나 비록 하지 정확 하 게 조절된 매체를 집중 하 여 그것 매우 어렵습니다 다시 활동. 셀 삽입에서과 우물의 바닥에 성장 transwell 인서트를 사용 하 여, 어느 정도 다시 캡처할 수 생산 및 고갈의 활동의 효과. 그러나, 셀 삽입 및 우물의 아래쪽 사이의 거리를 구분 하며 따라서, paracrine...

암 세포와 종양 진행 성에 서 종양 microenvironment 간의 생산적인 상호 상호 작용의 역할을 잘 설립 되었습니다 그리고 암 생물학1연구의 주요 초점 되고있다. 상처 치유, 면역 반응, 신생, 줄기 세포 벽, 그리고 개발2,,34,,56 양방향 신호에의 유사한 인스턴스는 중요 한 , 7 , 8.이 모든 생물 학적 과정에 공통 주제는 셀 셀 운명, 조직 생리학, 및 질병의 진행을 결정 하는 그들의 microenvironment에서 extracellular 신호를 다양 한 방법으로 응답. 따라서, 초점 같은 셀 셀 통신에 관련 된 메커니즘의 더 나은 이해를 개발 하는 쪽으로 점점 돌았다. 이러한 상호 작용의 대부분 paracrine 또는 juxtacrine 세포 사이 신호를 포함 한다. Paracrine 신호 juxtacrine 반면9,10, 그것에 대 한 응답을 트리거하는 근처에 다른 셀에 해당 수용 체에 의해 인식 되는 한 특정 신호 요소의 분 비를 포함 한다 신호 두 셀 관련된11,12의 세포질 구성 요소 간의 직접 접촉을 해야합니다.
이러한 신호 종양 microenvironment에서 뿐만 아니라 조직 항상성에 중요 한 구성 요소입니다. 암 세포 종양 기질, 암 관련 된 섬유 아 세포 (CAFs), adipocytes13,,1415,16, 면역 세포 등의 세포에서 paracrine 및 juxtacrine 요인 으로부터 혜택을. Paracrine 신호 juxtacrine 신호 하는 것은 juxtaposed ligands 노치 신호, 또는 integrins 및 그들의 각각 사이 상호 작용 수용 체를 포함 하는 동안 성장 인자, cytokines, 발산, 등에 의해 중재 될 수 있습니다. 세포 외 기질 단백질입니다. 우리는 종양 진행 및 전이14난소 암 세포 및 CAFs 사이 상호 상호 작용의 중요성을 증명 하고있다. 마찬가지로, metastasizing 난소 암 세포 전이의 사이트 취재 mesothelial 세포와의 상호 작용을 규제 키 microRNAs 전이성 식민17, 를 승진 시키는 암 세포에 녹음 방송 요인 18.
Paracrine 신호에 대부분 연구 조건된 매체와 두 번째 셀 유형을 치료 하 한 셀 형식에서 수집 된의 사용을 포함 한다. 이 방법은 널리 이용 되는, 하는 동안 그것은 효과적으로 받는 셀의 microenvironment에 secreted 요소의 지역화 된 고 농도 레벨을 복제 하지 않습니다. 그것은 또한 재현 한 세포에 의해 생산 되는 secreted 요소의 연속 흐름의 활동에 실패 하 고 인접 셀을 받은. Paracrine 신호 secreted 요소 소스 셀 근처만 필요한 농도 고 무마 하 고 밖으로 희석 거리 증가 하는 경향이 짧은 거리에 효과적 이다. 이 지역화 된 높은 농도의 secreted 요소 수용 체 셀에 응답 필수적입니다. 또한, 응답 받는 사람 세포에 새로 분 비 요인과 저하, 바인딩, 및 받는 사람 세포와 소스 셀에서 확산에 국제화를 통해 그들의 지속적인 고갈의 균형에 의존 이기도합니다. 바른된 매체 높은 지역화 된 농도 microenvironment에 대 한 계정에 집중 될 수 있지만 그 정확 하 게 정확한 농도 복제할 수 없습니다. 또한, 그것은 생산의 자연 활동 및 관련된 요인의 고갈 모방 수 없습니다. 더 정확 하 게 복제 paracrine 신호 juxtacrine 신호 메커니즘에서에서 분리, 우리는 성장 하는 다공성 막의 어느 표면에 2 개의 세포 유형 포함 소설 인접 문화 방법의 고안 했다. 숨 구멍은 충분히 juxtacrine 상호 작용을 방지 하 고 아직 지역화 된 높은 농도에서 분 비 요인의 교류를 허용 하는 작은. 그런 식으로,이 시스템 생산의 활동 그리고 paracrine 요인의 소모를 유지합니다.

<table><tbody><tr><td>24mm 트랜스웰 투과성 지지대(0.4 &마이크로); m 기공 폴리 카보네이트 멤브레인 인서트</td><td>코닝 (Costar)</td> <td>3412</td><td>&bull; 10 &micro; M 두께의 반투명 폴리카보네이트 멤브레인 &BULL; 최적의 세포 부착을 위해 처리됨 &bull; 6 웰 플레이트에 6 인서트 패키지, 케이스 당 4 플레이트 &bull; 세포막은 세포 가시성을 위해 염색되어야 합니다 &bull; 감마선 살균</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>평평한 바닥, TC 처리, 멸균, 뚜껑 포함</td></tr><tr><td>15cm 배양 접시</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>멸균, TC 처리 세포 배양 접시</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 산</td><td>Corning (Cellgro)</td> <td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비타민</td><td>Corning (Cellgro)</td> <td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0.25 % 트립신, 2.21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td></td><td></td><td>모든 make</td></tr><tr><td>is fine CO2 Incubator</td><td></td><td></td><td>Any make is fine</td></tr><tr><td>생물 안전성 레벨 II 캐비닛</td><td></td><td></td><td>모든 제작이 정상입니다</td></tr><tr><td>FN1 TaqMan 유전자 발현 분석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 TaqMan 유전자 발현 분석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 TaqMan 유전자 발현 분석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan 유전자 발현 분석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy 미니 RNA 분리 키트</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>대용량 cDNA 역전사 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>HeyA8 난소암 세포</td><td>Ernst Lengyel Lab, University of Chicago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta에서 획득; 중화항체</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

paracrine 신호 세포 사이 공부 하는 인접 문화 방법

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

세포 상호 작용은 종양 진행, 면역 반응, 신생, 개발 등 많은 생물 학적 과정에 중요 한 역할을. Paracrine 또는 juxtacrine 신호 같은 상호 작용을 중재 한다. 바른된 매체 및 coculture 연구의 사용은 이러한 두 가지 유형의 상호 작용 사이 감 별 하는 가장 일반적인 방법입니다. 그러나, paracrine 상호 작용 동안에 microenvironment에 분 비 요인의 지역화 된 높은 농도의 효과 조절된 매체에 의해 정확 하 게 지 하지 고, 따라서, 부정확 한 결론으로 이어질 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 우리 paracrine 신호를 공부 하는 인접 문화 방법을 고안 했다. 두 셀 형식 0.4 µ m 모와 10 µ m 두께 폴 리카 보 네이트 막의 어느 표면에 성장 된다. 모 공 분 비 요인의 교환을 허용 하 고, 동시에 juxtacrine 신호 하는 것을 억제. 셀 수 수집 되며 paracrine 신호의 효과 결정 하기 위해 끝점에서 lysed. 분 비 요인의 지역화 된 농도 기울기에 대 한 수 있도록, 뿐만 아니라이 방법은 의무가 억제제의 사용 뿐만 아니라 문화의 연장된 기간을 포함 하는 실험 이다. 우리가 난소 암 세포와 전이의 사이트에서 발생 하더라도 mesothelial 세포 간의 상호 작용을 공부 하려면이 메서드를 사용 하 여, 하는 동안 그것은 연구자 paracrine 신호 다양 한 분야에서 연구에 대 한 어떤 두 부착 세포 유형 적응 시킬 수 있다 종양 microenvironment, 면역학, 및 개발을 포함 하 여.

Metastasizing 난소 암 세포 mesothelial 세포 전이 복 막 구멍19내 사이트에서 발생합니다. 생산적 paracrine juxtacrine 상호 작용 유도 성공적인 전이17,18,20,21 난소 암 세포의 적응 응답에 mesothelial 세포의 도움으로 . 인접 문화 방법의 효과 테스트 하려면 테스트 HeyA8 난소 암 세포와 HPMCs 사이 paracrine 상호 작용. 그것은 이전 HPMCs와 HeyA8 세포의 coculture HPMCs21fibronectin의 증가 식에 결과 보고 되었습니다. Fibronectin 식의이 유도 Hey...

Paracrine juxtacrine 세포 상호 작용 종양 진행, 면역 반응, 신생, 개발 등 많은 생물 학적 과정에 중요 한 역할을 한다. 여기, 인접 문화 메서드 secreted 요소의 지역화 된 농도 세포에 직접 접촉을 방지 하는 동안 유지 됩니다 paracrine 신호 연구에 사용 됩니다.

Paracrine 신호 세포 사이 공부 하는 인접 문화 방법

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

이 방법은 두 가지 유형의 세포 간의 상호 파라크린 대 병치타크린 상호 작용에 대한 세포 간 통신 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 일반적인 배양 조건에서 부분비 신호를 정확하게 포착하는 동시에 효과적인 병치극 신호전달을 방지하는 매우 간단하고 재현 가능한 기술이라는 것입니다. 이 기술의 의미는 암세포와 종양 미세환경 사이의 누화 메커니즘에 대한 더 나은 이해로 확장됩니다.이 방법은 암세포와 종양 기질 사이의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 상처 치유 및 혈관 신생과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 1밀리리터의 0.25% 트립신과 80% 융합 혼합물에서 난소암 세포를 40-60초 동안 분리한 다음 6밀리리터의 완전 성장 배지로 반응을 중화합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 5밀리리터의 신선한 완전 성장 배지에 재현탁합니다.계산 후, 세포를 완전한 성장 배지 농도의 밀리리터당 100, 000 난소암 세포로 희석하고 실험 조건당 3개의 반전된 0.4 마이크로미터 공극 조직 배양 처리된 폴리카보네이트 막 세포 배양 삽입물을 적절한 크기의 멸균 조직 배양 접시에 놓습니다. 실험 조건에 따라 삽입물에 라벨을 붙이고 암세포를 멤브레인 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 이동하여 800마이크로리터 돔을 형성하기 위해 동심원으로 각 삽입물의 바닥에 조심스럽게 피펫팅합니다. 세포를 삽입물의 바닥 표면에 파종할 때 배양 중에 세포를 포함하는 배지의 돔이 삽입물의 가장자리에서 흘러내리지 않도록 매우 주의하십시오.모든 삽입물이 파종되면 접시를 덮고 삽입물을 세포 배양 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 약 4시간 후, 2ml의 0.25%트립신으로 HPMC를 1-2분 동안 분리한 다음 12ml의 완전 성장 배지로 반응을 중화합니다. 원심분리로 HPMC를 수집하고 계수를 위해 10ml의 완전한 성장 배지에 펠릿을 재현탁합니다.세포를 300, 완전한 성장 배지의 밀리리터 당 000 HPMC로 묽게 하고 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에 2.5 밀리리터의 새로운 완전 성장 배지를 추가합니다. 멸균 겸자를 사용하여 각 삽입물의 오른쪽을 6웰 플레이트의 각 웰에 위로 향하게 배치하여 하부 난소암 세포 부착 표면이 매체에 잠기도록 합니다. 그런 다음 각 인서트의 웰에 1.5ml의 HPMC를 파종합니다.그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 72시간 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 각 웰에서 삽입물을 조심스럽게 제거하고 삽입물의 양쪽을 PBS로 헹굽니다. 각 인서트를 새로운 6웰 플레이트에 넣고 인서트 웰에 0.5ml의 트립신을 추가하고 하단 웰에 2ml의 트립신을 추가합니다.섭씨 37도에서 2분 후 각 삽입물에 1ml의 완전 성장 배지를 추가하고 멤브레인을 찢거나 세포 현탁액을 아래 웰로 흘리지 않도록 용액을 조심스럽게 몇 번 피펫팅합니다. 파이펫팅하는 동안에는 한 챔버의 세포가 다른 챔버와 교차 오염되지 않도록 주의해야 합니다. 재현탁 세포를 표지된 수집 튜브로 옮기고 추가로 2ml의 완전 성장 배지로 트립신을 추가로 중화합니다.삽입물 바닥에 있는 세포를 수집하려면 분리된 세포가 적절한 웰 바닥에 걸리도록 6웰 플레이트의 해당 웰에서 2밀리리터의 트립신으로 멤브레인 바닥을 2-3회 세척합니다. 모든 세포가 분리되면 6ml의 신선한 성장 배지로 각 웰의 트립신을 중화하고 세포 현탁액을 표지된 수집 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 원심분리를 통해 모든 세포를 수집하고 표준 프로토콜에 따라 RNA 추출 및 분리를 위해 튜브당 0.7밀리리터의 페놀 및 구아니딘 티오시아네이트 기반 용해 시약에 펠릿을 재현탁합니다.HPMC와 난소암 세포의 근위 배양은 암세포가 없는 상태에서 삽입물에 파종된 대조군 HPMC에 비해 피브로넥틴 및 형질전환 성장 인자(TGF beta one)의 발현을 증가시킵니다. 피브로넥틴과 TGF 베타 원의 발현은 HPMC가 없는 상태에서 배양된 대조군 난소 세포에 비해 HPMC를 사용한 근위 배양 시 난소암 세포에서 크게 증가합니다. 반대로, HPMC 컨디셔닝 배지로 처리된 난소암 세포는 TGF beta one 발현의 변화 없이 현저히 감소된 피브로넥틴 발현을 보여줍니다.그러나 TGF beta one을 중화 항체로 차단하면 HPMC를 사용한 근위 배양에서 난소암 세포에서 TGF beta one 발현이 크게 감소합니다.흥미롭게도, TGF beta one 발현의 약간의 증가는 대조군에서 관찰되며, 이는 보상 반응으로 추정되는 비근접 배양된 난소암 세포에서 관찰됩니다. 난소암세포를 이용한 근위배양은 대조군에 비해 HPMC에서 E-cadherin 발현을 약간 증가시키는 반면, HPMC와 근접하게 성장한 난소암세포에서는 E-cadherin의 현저한 감소가 관찰되어 전이 부위에서 난소암세포와 정상세포 사이의 부분비 신호전달을 연구하기 위한 근위배양 시스템의 효과를 더욱 입증합니다.이 절차를 시도하는 동안 파종된 세포의 수와 근위 배양 기간을 최적화하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 면역 블로팅과 같은 다른 방법을 수행하여 종양 세포 중피 세포 공동 배양 중 단백질 발현의 변화 및 다운스트림 처리 신호 경로의 활성화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 종양 미세환경, 면역학, 발생 생물학 분야의 연구자들이 분비 인자를 통한 세포 간의 상호 부분비 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 난소암 세포와 일차 인간 중피 세포의 근위 공동 배양 모델을 개발합니다. 이 생리학적으로 관련된 모델을 통해 분비 인자의 국부적인 농도가 유지되는 동시에 직접적인 세포 접촉을 방지하는 부분비 신호 전달에 대한 연구를 수행할 수 있습니다.

근위 배양 시스템: 세포 간의 부분비 신호 전달을 연구하기 위한 체외 배양 기술

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

저항 동맥의 세포 문화 모델, 신호 경로 내 피, 평활 근, 또는 피와 부드러운 근육 (myoendothelial 교차점) 사이 해 부에 대 한 수 있도록 설명 되어 있습니다. 이 셀 문화 모델을 사용 하 여 면역 형광 검사, 전자 현미경, 또는 단백질 격리, 촉진제의 선택적 응용 프로그램을 활용할 수 있습니다.

저항 동맥의 세포 문화 모델

우리는 X 레이 방사선 Caco-2와 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 사이 누화를 조사 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 Caco-2 조사와 PBMC; 공동 문화권의 시작 그 후, 트랜스 상피 전기 저항 48 h 및 서양 오 점 Caco-2에 PBMC 수행을 통해 정기적으로 측정 됩니다.

X-선 사이 누화를 조사 하는 공동 문화 방법을 반구 Caco-2 셀 및 PBMC

우리 치과 펄프에서 격리 된 중간 엽 줄기 세포와 공동 문화를 직접 및 간접 방법에 따라 전립선 암 세포 상호 작용의 평가 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 조건 매체 및 트랜스-잘 막 간접 paracrine 활동 분석에 적당 하다. 차동 시드 직접 셀 상호 작용에 대 한 적절 한 모델입니다 함께 셀 스테인드.

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

우리는 치과 펄프 (DP) 1 차 세포의 격리, 분산 및 도금이 지나치게 트랜스웰 필터 위에 배양된 삼차 (TG) 뉴런을 설명합니다. DP 세포의 세포 반응은 면역 형광 또는 RNA /단백질 분석으로 분석 될 수있다. 공초점 현미경검사법을 가진 신경 마커의 면역형광은 신경질성 파생 반응의 분석을 허용합니다.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

본 연구는 시험관 내에서  파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 사건을 연구하기 위한 매우 재현성 있고 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 쥐 신경 볏 세포 및 근모세포에서 파라크린 Wnt5a 신호 전달의 영향을 평가하기 위해 적용되었습니다.

체외에서 파라크린 비정규 Wnt 신호 전달 모델링

이 논문에서는 새로 설계된 3D 프린팅 인서트를 공동 배양 모델로 제시하고 내피 세포와 각질 세포 사이의 측분비 세포 간 통신 연구를 통해 검증합니다.

간단한 2D 및 3D 세포 배양이 가능하도록 설계된 혁신적인 3D 프린팅 인서트

임의의 점 kinematograms과 컴퓨터 - 생성 무척추 동물의 비디오 재생을 고용 op​​erant 조절 패러다임을 사용하는 도마뱀의 시각적 감도를 테스트.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

학습하세요 난소암 세포와 HPMC를 이용한 인접 배양법으로 파라크린 신호를 연구하는 방법입니다. 이 기술은 종양 미세환경에서 세포 간 상호작용을 이해하는 데 활용됩니다.

Paracrine 신호 세포 사이 공부 하는 인접 문화 방법

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