Paracrine 신호 세포 사이 공부 하는 인접 문화 방법

이 방법은 두 가지 유형의 세포 간의 상호 파라크린 대 병치타크린 상호 작용에 대한 세포 간 통신 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 일반적인 배양 조건에서 부분비 신호를 정확하게 포착하는 동시에 효과적인 병치극 신호전달을 방지하는 매우 간단하고 재현 가능한 기술이라는 것입니다. 이 기술의 의미는 암세포와 종양 미세환경 사이의 누화 메커니즘에 대한 더 나은 이해로 확장됩니다.

이 방법은 암세포와 종양 기질 사이의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 상처 치유 및 혈관 신생과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 1밀리리터의 0.25% 트립신과 80% 융합 혼합물에서 난소암 세포를 40-60초 동안 분리한 다음 6밀리리터의 완전 성장 배지로 반응을 중화합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 5밀리리터의 신선한 완전 성장 배지에 재현탁합니다.

계산 후, 세포를 완전한 성장 배지 농도의 밀리리터당 100, 000 난소암 세포로 희석하고 실험 조건당 3개의 반전된 0.4 마이크로미터 공극 조직 배양 처리된 폴리카보네이트 막 세포 배양 삽입물을 적절한 크기의 멸균 조직 배양 접시에 놓습니다. 실험 조건에 따라 삽입물에 라벨을 붙이고 암세포를 멤브레인 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 이동하여 800마이크로리터 돔을 형성하기 위해 동심원으로 각 삽입물의 바닥에 조심스럽게 피펫팅합니다. 세포를 삽입물의 바닥 표면에 파종할 때 배양 중에 세포를 포함하는 배지의 돔이 삽입물의 가장자리에서 흘러내리지 않도록 매우 주의하십시오.

모든 삽입물이 파종되면 접시를 덮고 삽입물을 세포 배양 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 약 4시간 후, 2ml의 0.25%트립신으로 HPMC를 1-2분 동안 분리한 다음 12ml의 완전 성장 배지로 반응을 중화합니다. 원심분리로 HPMC를 수집하고 계수를 위해 10ml의 완전한 성장 배지에 펠릿을 재현탁합니다.

세포를 300, 완전한 성장 배지의 밀리리터 당 000 HPMC로 묽게 하고 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에 2.5 밀리리터의 새로운 완전 성장 배지를 추가합니다. 멸균 겸자를 사용하여 각 삽입물의 오른쪽을 6웰 플레이트의 각 웰에 위로 향하게 배치하여 하부 난소암 세포 부착 표면이 매체에 잠기도록 합니다. 그런 다음 각 인서트의 웰에 1.5ml의 HPMC를 파종합니다.

그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 72시간 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 각 웰에서 삽입물을 조심스럽게 제거하고 삽입물의 양쪽을 PBS로 헹굽니다. 각 인서트를 새로운 6웰 플레이트에 넣고 인서트 웰에 0.5ml의 트립신을 추가하고 하단 웰에 2ml의 트립신을 추가합니다.

섭씨 37도에서 2분 후 각 삽입물에 1ml의 완전 성장 배지를 추가하고 멤브레인을 찢거나 세포 현탁액을 아래 웰로 흘리지 않도록 용액을 조심스럽게 몇 번 피펫팅합니다. 파이펫팅하는 동안에는 한 챔버의 세포가 다른 챔버와 교차 오염되지 않도록 주의해야 합니다. 재현탁 세포를 표지된 수집 튜브로 옮기고 추가로 2ml의 완전 성장 배지로 트립신을 추가로 중화합니다.

삽입물 바닥에 있는 세포를 수집하려면 분리된 세포가 적절한 웰 바닥에 걸리도록 6웰 플레이트의 해당 웰에서 2밀리리터의 트립신으로 멤브레인 바닥을 2-3회 세척합니다. 모든 세포가 분리되면 6ml의 신선한 성장 배지로 각 웰의 트립신을 중화하고 세포 현탁액을 표지된 수집 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 원심분리를 통해 모든 세포를 수집하고 표준 프로토콜에 따라 RNA 추출 및 분리를 위해 튜브당 0.7밀리리터의 페놀 및 구아니딘 티오시아네이트 기반 용해 시약에 펠릿을 재현탁합니다.

HPMC와 난소암 세포의 근위 배양은 암세포가 없는 상태에서 삽입물에 파종된 대조군 HPMC에 비해 피브로넥틴 및 형질전환 성장 인자(TGF beta one)의 발현을 증가시킵니다. 피브로넥틴과 TGF 베타 원의 발현은 HPMC가 없는 상태에서 배양된 대조군 난소 세포에 비해 HPMC를 사용한 근위 배양 시 난소암 세포에서 크게 증가합니다. 반대로, HPMC 컨디셔닝 배지로 처리된 난소암 세포는 TGF beta one 발현의 변화 없이 현저히 감소된 피브로넥틴 발현을 보여줍니다.

그러나 TGF beta one을 중화 항체로 차단하면 HPMC를 사용한 근위 배양에서 난소암 세포에서 TGF beta one 발현이 크게 감소합니다.흥미롭게도, TGF beta one 발현의 약간의 증가는 대조군에서 관찰되며, 이는 보상 반응으로 추정되는 비근접 배양된 난소암 세포에서 관찰됩니다. 난소암세포를 이용한 근위배양은 대조군에 비해 HPMC에서 E-cadherin 발현을 약간 증가시키는 반면, HPMC와 근접하게 성장한 난소암세포에서는 E-cadherin의 현저한 감소가 관찰되어 전이 부위에서 난소암세포와 정상세포 사이의 부분비 신호전달을 연구하기 위한 근위배양 시스템의 효과를 더욱 입증합니다.

이 절차를 시도하는 동안 파종된 세포의 수와 근위 배양 기간을 최적화하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 면역 블로팅과 같은 다른 방법을 수행하여 종양 세포 중피 세포 공동 배양 중 단백질 발현의 변화 및 다운스트림 처리 신호 경로의 활성화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 종양 미세환경, 면역학, 발생 생물학 분야의 연구자들이 분비 인자를 통한 세포 간의 상호 부분비 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.