Name: Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 학습하세요 ex vivo 폐암 모델을 통해 종양 진행 과정을 연구하는 방법을. 이 기술은 원발성 종양과 순환 종양 세포 형성을 가능하게 하며 환자 유래 세포를 이용한 맞춤형 치료법 평가에 활용됩니다.

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P. 김 민 두 번째 존 W. Kirklin 연구 장학금, 흉부 수술, 그레이엄 연구 재단, 휴스턴 감 리 전문 의사 그룹 그랜트, 및 마이클 M. Joann H. 콘 연구 수상 미국 협회에서에서 보조금 지원을 받았다. 우리는 언어의 원고 편집에 대 한 앤 Saikin 감사 합니다.

동물 실험에 대 한 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 휴스턴 감리교 연구소에 의해 승인 하 고 모든 규정, 법령, 지침 및 정책에 따라 수행 했다.
1. 쥐 폐 수확
<ol><li>케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 측면에서의 복 (IP) 주입에 의해 4에 6-1 주일-오래 된 남성 Sprague-Dawley 쥐를 anesthetize. 뒷 다리 발가락 집게로 슬쩍 때 움직임의 부재를 확인 하 여 마 취를 확인 합니다.</li>
	<li>10 분 후 가슴 및 복 부를 면도 하 고 액체 면봉으로 피부를 닦아냅니다.</li>
	<li>집게와을 따기로 일회용 메스와 incising에 의해 피부를 제거 합니다. 메스와 incising에 의해 흉 강을 연 후가 위로 왼쪽 흉 곽의 앞쪽 측 및 횡 경 막의 오른쪽을 절단 하 여 양자 thoracotomy를 수행 합니다. 참고: 이것은 비 생존 수술입니다.</li>
	<li>흉 곽을 잡고 고 27 G 바늘을 사용 하 여 뛰는 심장의 우 심 실에 헤 파 린 (1000 단위/mL)의 2 개 mL를 주입. 참고:이 폐에 혈전의 어떤 형성이 되지 것입니다.</li>
	<li>완전히가 위 흉 곽을 제거 하 고 혈액이 밖으로 나오는 때까지 환기, 좌 심 실에서 18 G 바늘 장소. 그런 다음, 25g 바늘을 사용 하 여 우 심 실에 heparinized 인산 염 버퍼 염 분 (12.5 단위/mL; heparinized PBS)의 15 mL를 주사.</li>
	<li>열 등 하 고 우량한 베 나 카바, 심장의 오른쪽에 두 개의 큰 혈관 고 heparinized PBS 27g 바늘을 사용 하 여 우 심 실에서의 추가 10 mL와 폐를 플러시. 참고: 열 등 한 베 나 정 맥의 큰 그릇으로 마음의 바닥에서 시각 이다 붉은 혈액으로 가득. 마찬가지로, 뛰어난 베 나 정 맥은 큰 그릇으로 심장의 위쪽 부분에 시각.</li>
	<li>갑 상선에 기도 잘라. 조심 스럽게 제거 hemiazygos 정 맥 및 아치에 대동맥의 분 지의 수준에서 하강 대동맥.</li>
	<li>흉 강 쥐 시체의 나머지 부분에서 심장-폐 블록을 가져가 라.</li>
	<li>오른쪽과 왼쪽 심의 절반 절단 하 여 수행 하는 ventriculotomy 고 주문 품 prefilled 18 G-스테인리스 바늘 정 우 심 실을 통해 주요 폐 동맥 (PA) 합니다.</li>
	<li>2-0 실크 넥타이 정을 보호 하 고 신중 하 게 노출 우 심 실 및 심 방.</li>
	<li>좌 심 실에 여성 Luer 칸막이 배치 하 고 2-0 실크 넥타이와 그것을 확보.</li>
	<li>PA 정 통해 heparinized PBS의 20 mL와 심장-폐 블록을 플러시 하 고 문화 미디어 또는 heparinized PBS 포함 50 mL 튜브에. 참고: 휴대 전화 모델에 대 한 단계는 생물 반응 기를 설정 하는 3.1로 이동 합니다. Acellular 모델는 decellularization에 대 한 2.1 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>2. 폐 Decellularization
<ol><li>
Decellularization 단위의 준비
	<ol>
<li>병 뚜껑에 두 개의 구멍을 관통 하 고 여성 루어 (그림 1A 및 1B) 구멍에 스냅 하 여 각 decellularization 챔버/병을 준비 합니다. 다른 쪽에 검은 나일론 반지와 보안. 마찬가지로, 정 맥 설정된 첨부 파일 (그림 1C)에 대 한 또 다른 병 뚜껑에 단일 구멍을 드릴 합니다. 참고: 그림 1A 및 1B 의 두 가지 측면에서 동일한 병 뚜껑 있습니다. 그림 1C 단계 2.1.1에서에서 위에서 말한 바와 같이 단일 구멍 다른 모자입니다.</li>
		<li>(그림 1A 및 1B) 병 뚜껑 내부에서 여성 루어를 0.5 인치 튜브 (에 폐 동맥 또는 PA 끝) 및 6 인치 튜브 (그림 1J)를 연결 하 고 연결 끝에 남성 Luer 잠금. Decellularization 챔버/병 500 mL 병으로 잠금을 설정 합니다.</li>
		<li>여성 루어와 카트리지 (그림 1G)에 의해 펌프 헤드 (그림 1E , 1F)에 붙어 있는 펌프 튜브 (그림 1 H)의 어느 끝에 (남성 Luer 잠금 연결 되)는 두 개의 2 피트 튜브의 한쪽 끝을 연결 잠금 (그림 1I) 합니다.</li>
		<li>2 피트 튜브 (2.1.3 단계)에서 각 decellularization 챔버/병 뚜껑 (그림 1 L)에 여성 Luer 자물쇠 머리의 다른 끝을 연결 합니다.</li>
		<li>250 mL 설정 heparinized PBS (PBS의 200 mL)와 함께 병 병 뚜껑 및 decellularization c에 연결 된 2 피트 튜브 교체 선단부에 삽입 정 맥 세트 (그림 1D)의 근 위 끝으로 스탠드에 거꾸로 병 거 여 hamber/병 PA 끝 (그림 1B). 난 병이 2 피트 튜브를 연결 합니다. 참고: 병 설정 됩니다 마분지에 그림 1과 같이. 정 맥 관 폐 비 계에 시 약을 분배 하 거 병 온다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
폐 decellularization 프로세스
	<ol>
<li>Decellularization 챔버/병에서 자유롭게 흐름 때까지 30 mm Hg (그림 1 K)의 생리 관류 압력 heparinized PBS를 실행 하 고, 다음, 파 정을 통해 PA 끝에 심장-폐 블록을 연결.</li>
		<li>Decellularization 챔버/병 안에 어떤 초과 버퍼/솔루션 삭제 되 면 펌프를 지속적으로, 실행을 유지.</li>
		<li>통해 초기 세척 (그림 1 K)에 대 한 30 mm Hg의 관류 압력에 15 분 동안 PA heparinized PBS를 실행 합니다.</li>
		<li>0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)에 이온된 수와 heparinized PBS 병을 장착 하 고 perfuse는 decellularization에 대 한 2 시간에 대 한 폐.</li>
		<li>Decellularization, 후 15 분 동안 폐 비 계를 통해 이온된 압력가 수 perfuse.</li>
		<li>그런 다음, perfuse 이온된 수 10 분에 1% 비 이온 세제.</li>
		<li>Decellularization 챔버/병 걸려 폐 병 내부 캡으로 그대로 유지 압력가 PBS 1 x 항생제 (페니실린 스 암포), 보충의 500 mL 바꿉니다.</li>
		<li>정 맥, decellularization 챔버의 폐 동맥 끝에 다시 버린 컨테이너에 연결 된 2 피트 튜브를 넣어 놓고 6 mL/min (그림 1 L)에서 펌프를 실행을 삭제 합니다.</li>
		<li>72 h에 대 한 폐를 perfuse 하 고 항생제 마다 12 h와 PBS를 변경 유지. 참고: acellular 폐는 즉시 사용할 준비가. 그것은 필요할 때까지-80 ˚C에 저장할 수 있습니다. 분홍색 반점 또는 혈액 혈전 폐 엽에 명확 하 게 구상 될 수 있다, 만약 폐기 폐. 그것은 무작위로 DNA 또는 histopathology 테스트 수 있습니다. 완전 한 acellular 폐 세포와 DNA의 99.9%는 떨어져 세척 될 것입니다 표시 되지 않습니다. 참고: 세포 폐 모델로 작업 하는 경우는 decellularization를 건너뜁니다. 수확된 폐 (1 단계)는 생물 반응 기에서 직접 설정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 생물 설정
<ol><li>생물 병 및 설정에 필요한 항목을 준비 합니다.<ol>
<li>동등한 거리에 한 500 mL 병 뚜껑에 3 개의 구멍을 드릴 및 검은 나일론 고리 (그림 2A 와 2B)를 사용 하 여 모든 3 개의 구멍에서 여성 루어를 수정. 참고: 두 개의 구멍에 Luer 잠금 종료 얼굴 외부, 한쪽 병의 내부를 직면 하는 동안.</li>
		<li>생물 당 펌프 튜브에 6, 관에서 2, 6, 1.5 피트 튜브, 2 피트 튜브와 10 피트 oxygenator 튜브를 잘라.</li>
		<li>18 G-스테인리스 바늘 잘라내어, 다시, tracheal 정에 대 한 생체 튜브 끝 연결.</li>
		<li>오토 클레이 브 테이프 (그림 2C)를 사용 하 여 솔레노이드 철 망에 끝에 Luer 잠금 커넥터 oxygenator 튜브를 바꿈.</li>
		<li>위에서 언급 한 오토 클레이 브 및 계속 그들에 UV 빛 10 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 mL 병에 쉽게 맞게 트레이 사이의 적절 한 간격이 일반 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2) 내부 펌프를 설정 합니다.</li>
	<li>펌프 카트리지에 70% 에탄올을 스프레이 하 고 펌프 튜브 펌프에 양쪽 끝에 여성 Luer 잠금 커넥터와 연결.</li>
	<li>펌프 튜브와는 생물에서 1.5 피트 튜브와 다른 쪽 끝에는 oxygenator의 한쪽 (유출)를 연결 하 여 솔레노이드 와이어 메쉬 셀 문화 인큐베이터 안에 감싸 oxygenator를 설정 합니다.</li>
	<li>무 균 조건 캐비닛에 biosafety 생물 병을 설정 합니다.<ol>
<li>하나는 아빠를 통해 흐름을 제어 하 여 손잡이의 머리에 3 방향 자 지 (노란색)를 첨부</li>
		<li>기도 (그림 2F) 통해 시드 셀에 대 한 또 다른 여성 Luer 잠금 칸막이를 단방향 자 지 (파란색)를 연결 합니다.</li>
		<li>2 외부에 튜브에서를 연결 (흰색)와 6 개 미디어 순환 병의 내부에 튜브. 2 피트 튜브를 남성 Luer 잠금 적합 하 고 여성 Luer 러 그 스타일을 추가 하거나 아무것도 제거 액세스를 제공 하는 티를 연결 합니다.</li>
		<li>3 방향 커넥터 (여성 Luer 러 그 스타일 티)의 구멍 중 하나를 단방향 자 지를 연결 합니다.</li>
		<li>남성 Luer 잠금 및 여성 Luer 잠금 2 피트 튜브에 연결 합니다.</li>
		<li>10 %FBS 1% 항생제 세포 배양 매체 (셀 요구 사항에 따라 다름)와 RPMI1640의 200 mL를 추가 하 고 인큐베이터에는 생물을 전송. (단방향 자 지와 티 커넥터) 폐쇄 루프 생물 수 있도록 두 개의 열린 끝에 oxygenator 튜브를 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사전 실행 펌프 oxygenator와 튜브를 채우기 셀 문화 미디어와 셀 문화 인큐베이터 안에 6 mL/min에서 아무 공기 방울 튜브에 존재.</li>
	<li>튜브 미디어 채워진다, 일단은 자 지 닫고는 oxygenators 생물 병의 양쪽 끝에서 분리 하 여 인큐베이터에서 생물 병을 제거 합니다.</li>
	<li>biosafety 캐비닛 생물 병을 넣어, 자 지를 통해 문화 미디어를 통과 하 고 남성 Luer 커넥터를 통해 자 지를 폐 비 계 (acellular 또는 세포)의 PA 정을 연결. 참고: 여기 그것은 (decellularization 과정 다음) acellular 모델 또는 갓 수확된 심장-폐 블록을 사용 하 여 (즉, 휴대 전화 모델, 그것은 네이티브 쥐 세포 유지).</li>
	<li>어떤 공기를 제거 하 여 기도에 실크 스레드 tracheal 정 넥타이 단방향 자 지 통해 문화 미디어를 전달 합니다.</li>
	<li>PA와 기관지의 모든 왜곡을 피하기 위해 있는지 확인 합니다. 가까운 폐와 생물 병 뚜껑 내부 발판, 다시, aseptically 인큐베이터에는 생물 반응 기를 전송 하 고 6 mL/min 속도로 펌프를 시작.</li>
	<li>실행 되도록 10-15 분에 대 한 문화 미디어 모든 돌출부 비정상적 얻을 하 고 폐 (그림 2G) 좋은 형태로 보인다.</li>
</ol>4. 전이 모델 및 셀 시드
참고: 기본 종양 성장 연구에 대 한 위의 폐 모델 시드 셀로 이동 합니다. 다음과 같이 전이성 모델에 대 한 폐 비 계 (acellular 또는 세포)를 수정 합니다.
<ol><li>인큐베이터에서 폐 비와 함께 생물을 꺼내와 캐비닛는 biosafety에 넣어.</li>
	<li>기도 통해 문화 미디어의 5 mL을 통과 하 고 교수형으로 생물 뚜껑을 열고를 Luer 잠금 주사기를 사용 하 여 폐 비 계 (그림 2F).</li>
	<li>이 단계에서 더 많은 사람이 폐의 전이성 모델 수정에 도움이 필요 합니다.</li>
	<li>실크 2-0 준비 하 고 각도 집게 분기 지점에서 기도 통해 패스를 사용 하 여 얻을.</li>
	<li>분기 지점에서 오른쪽 폐에가 하는 기도 고 문화 미디어를 전달 하 여 왼쪽된 폐에 기관지를 통해 미디어의 자유로운 흐름을 확인 하십시오. 참고: 기관 분기 지점에 연결 되 면 기도 통해 시드 셀 자동으로 이동 됩니다 왼쪽된 돌출부에 씨. 그것은 기도 통해 추진 문화 미디어에 의해 셀을 뿌리기 전에 테스트할 수 있습니다. 전이성 모델에서 미디어는 팽창 것입니다 왼쪽된 엽만, 및 오른쪽 엽10을 이동 합니다.</li>
	<li>20 mL Luer 잠금 주사기 tracheal 정 위에 설정 하 고 RPMI1640 완전 한 문화 미디어 (그림 2F) 50 mL에 ATCC 폐암 세포 (A549, H1299)를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 biosafety 캐비닛에 시드를 수행 합니다. 셀의 15 mL 주사기에 추가 하 고 중력에 의해 폐 엽을 통과 하자. 어떤 기포를 통과 하기 전에 셀의 나머지를 추가 합니다.</li>
	<li>Acellular 폐 시드에서 생물 병에 떨어지는 perfused 미디어를 수집 하 고 다시 3 배는 기관지를 통과 하자. 참고: perfused 미디어는 때로는 시드 암 세포는. 따라서, 효율적인 시드에 넣어 다시 미디어 다시 기도에 주사기를 통해.</li>
	<li>일단 시드, 주사기를 제거, 15 분 동안 기다려, 신선한 미디어, 추가 그리고는 생물 인큐베이터 다시 돌아갑니다. 튜브에서 모든 기포를 제거 합니다.</li>
	<li>펌프 6 mL/min에서 미디어 perfuse를 시작 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Ex vivo 4 차원 폐 종양 성장 및 전이 실험실 설정에서 공부 하는 기회를 제공 한다. 네이티브 폐 매트릭스는 복잡 한 시스템 정상 조직에 지원을 제공 하 고 유지 하는 세포 세포 상호 작용, 세포-매트릭스 상호 작용, 세포 분화, 그리고 조직 조직입니다. 그것은 종양의 성장에 미치는 영향 및 다른 세포와의 상호 작용 연구를 어떤 종양 microenvironment 구성 요소를 추가 하는 기회를 제공 한다.
폐 수확 비보 전 4 차원 폐 모델에 대 한 중요 한 단계입니다. decellularization 동안는 시 약의 자유로운 흐름에 영향을 미칠 수 있습니다 폐에 혈액 응고 흉부 개통 후 헤 파 린 주입 관리에 지연 될 수 있습니다. 적절 한 홍 조 heparinized PBS를 가진 무색 액체 환기에서 올 때까지 하는 것이 세포 모델과 특히 중요 합니다. 뛰어난 베 나 정 맥의 주의 절단은는 실바에 게 어떤 해 든 지 방지 하는 것이 중요...

암 전이 대부분 암 관련 된 죽음 뒤에 범인 하 고 암을 싸우는 노력에 궁극적인 도전 포즈. 이 방법의 전반적인 목표는 3 차원 (3 차원) 세포 성장 뿐만 아니라 흐름의 차원 4 차원 (4d) 세포 문화 프로토콜을 디자인 하는 것입니다. 그것은 전이 과정 [즉, 주 종양, 순환 종양 세포 (CTCs), 및 전이성 병 변]의 세 가지 단계를 나타냅니다.
지난 3 년간 전세계의 과학자 들은 다른 암 치료 또는 진행 없는 생존의 가능성을 향상에 전이성 진행을 기본 메커니즘을 이해 하는 정보 비교할 수 없는 풍부한 나왔고. 일부 암, 유방암, 등의 임상 관리 개선 크게1; 그러나, 폐 암 등 일부 암에는 여전히 가난한 생존2있다. 생체 외에서 그리고 vivo에서 동물 모델에 새로운 통찰력을 질병의 발전을 지탱 하는 메커니즘을 생성 되었습니다. 지난 몇 년 동안, 셀 라인 파생 xenografts (CDX) 및 환자 파생 xenografts (PDX)의 더 많은 관심으로 그들이 조직학 특징, 행동 기본 인간 종양3, 성장 속도 등 많은 관련 기능을 유지 되었습니다. 특성, 그리고 치료에 대 한 응답입니다. 그러나, 각 모델에는 CTC 형성 및 전이를 먼 기관4,,56의 메커니즘을 이해 하는 제한이 있습니다.
최근, 우리 기관 재설계 및 관류 기반 세포 배양의 개념을 이용 하 여 4 차원 비보 전 폐 암 모델 개발. 비슷한 인간 암 분 비와 함께 시간이 지남에 성장 perfusable 종양 작은 혹을 형성 하 여 인간의 폐 암 성장을 모방 단백질 생산7. 그것은 암 환자에서 가난한 생존 예측 나타나고 또한 치료 응답 cisplatin 치료8,9시 종양 회귀에 의해 유전자 표현 서명을 나타냅니다. 그것은 전이성 병 변 형성할 수 있도록 폐 모델 수정 추가 했습니다. CTCs는 맥 관 구조에 기본 종양과 intravasate에서 개발 하 고 전이성 병 변10를 contralateral 폐로 extravasate. 유전자 표현 연구 기본 종양, CTCs, 전이성 병 변의 독특한 식 프로필 형10에 필요한 유전자의 부분 집합의 upregulation를 하시기 바랍니다. 이 전이 과정 생물 학적 조건 암 환자에서의 존재로 인해 발생 합니다. 이 모델의 장점은 자연 매트릭스 및 건축의 존재와 종양 작은 혹의 형성에 이르게 하는 양분의 살포. 또한, 그것은 또한 시간이 지남에 종양 진행에 종양 microenvironment 또는 약의 다른 성분의 효과 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 모델은 실험실 설정에서 암 세포 (폐암, 유방암, 육 종 등)의 범위를 성장 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>남성</td></tr><tr><td>클로르헥시딘 면봉</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18게이지 바늘</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 실크 넥타이</td><td>Ethicon, 샌 앤젤로, TX, 미국</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 펌프</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 펌프 헤드</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 펌프 카트리지</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL,</td> US <td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex 펌프 튜브</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>암 루어 잠금 커넥터</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>수 루어 잠금 커넥터</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>블랙 나일론 링</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>정맥 주사 세트</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>황산나트륨(SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>항생제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 산소공급기</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-Wire</td></tr> <tr><td>mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York 와이어</td></tr><tr><td>여성 루어 러그 스타일 TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>200 시리즈 Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>암 루어 스레드 스타일 커플러</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave 커넥터</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>안녕-플로 &무역; 4방향 스톱콕 w/스위블 남성 루어 잠금</td><td>스미스 의료</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex 펌프 튜브</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>캐뉼라용</td></tr></tbody></table>

acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

종양 진행의 다른 지점에서 종양 세포를 분리 하는 것이 어렵습니다. 우리는 비보 전 폐 모델 자연 매트릭스와 종양 세포의 상호 작용 및 영양분의 지속적인 흐름이 보여줄 수 있는 뿐만 아니라 정상적인 세포 구성 성분으로 종양 세포의 상호 작용 및 자연 매트릭스 모델을 만들었습니다. Acellular 비보 전 폐 모델 쥐 심장-폐 블록 분리 및 decellularization 프로세스를 사용 하 여 모든 셀을 제거 하 여 만들어집니다. 오른쪽 주 기관지에서 연결 하 고 종양 세포를 주사기에 의해 기관에 배치 됩니다. 셀을 이동 하 고 왼쪽된 폐. 폐 폐 동맥 폐쇄 회로에 미디어의 지속적인 흐름을 받는 생물에 배치 됩니다. 왼쪽된 폐에 성장 하는 종양은 1 차 종양. 순환 미디어에 격리 되어 종양 세포는 종양 세포를 순환 하 고 오른쪽 폐에 종양 세포는 전이성 병 변. 세포질 비보 전 폐 모델 decellularization 과정을 건너뛰는 의해 만들어집니다. 각 모델은 다른 연구 질문에 대답을 사용할 수 있습니다.

폐 쥐에서 수확 그대로 맥 관 구조 및 포11 (그림 3A 와 3B)를 유지 합니다. Decellularization, 시 등의 콜라겐, fibronectin, 엘라 스 틴, acellular 폐의 세포 외 기질 구성 요소11 (그림 3C, 3D, 3E및 3F) 유지 됩니다. decellularization 연결 되며 고 오신 (H &amp; E)에 의해 관찰 될 수 있는 폐에 네이티브 쥐 세포의 완전 한 제거 및 DNA 분석11 DNA 양을 ( 에 있는 감소를 보여주는 셀의 부재를...

여기, 선물이 비보 전 폐 암 모델을 모방한 종양 진행의 단계 및 기본 종양을 격리 하는 데 도움이 프로토콜 순환 종양 세포, 및 전이성 병 변.

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

이 방법은 종양 진행과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생체 외 무세포 및 세포 폐 모델은 시간이 지남에 따라 성장하고 순환 종양 세포와 전이성 병변을 형성하는 원발성 종양의 형성을 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 단축 된 시간의 암 진행과 다양한 유형의 암 세포의 성장을 연구 할 수 있다는 것입니다.면역 세포를 포함한 치료 약물의 효능을 평가하기 위해 환자의 종양 세포를 모델에 사용할 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 개인 맞춤형 치료로 확장됩니다. 심하게 마취된 쥐부터 시작한다. 가슴과 복부를 면도하고 클로르헥시딘 면봉으로 피부를 닦습니다.흉강을 연 후 횡격막의 오른쪽에서 왼쪽에 있는 흉곽의 앞쪽을 절단하여 양측 개흉술을 시행합니다. 흉곽을 위로 잡고 폐에서 혈전 형성을 방지하기 위해 27 게이지 바늘을 사용하여 박동하는 심장의 우심실에 1000 밀리리터의 헤파린 2 밀리리터를 주입합니다. 흉곽을 제거한 후 18 게이지 바늘을 좌심실에 삽입하여 혈액이 배출될 수 있도록 한 다음 25 게이지 바늘을 사용하여 15밀리리터당 12.5 단위의 헤파린 화 PBS를 우심실에 주입합니다.다음으로, 갑상선 기저부의 기관을 절제하고 하행 대동맥을 반접합 정맥 수준과 대동맥 아치에서 가지로 조심스럽게 제거합니다. 흉강에서 심폐 차단을 제거한 후 좌심실의 절반을 잘라낸 다음 우심실을 통해 주폐동맥에 맞춤 제작된 18게이지 스테인리스 스틸 바늘 캐뉼라를 삽입합니다. 2-0 실크 넥타이로 캐뉼라를 고정하고 우심실과 심방을 조심스럽게 노출시킵니다.먼저 수은 30mm의 생리학적 관류 압력에서 헤파린화된 PBS가 탈세포화 장치의 병 안으로 자유롭게 흐를 때까지 실행한 다음 폐동맥 캐뉼라를 통해 폐동맥 말단의 탈세포화 장치에 심장-폐 블록을 부착합니다. 헤파린 처리된 PBS로 15분 세척한 후 헤파린 처리된 PBS 병을 0.15% 황산나트륨과 탈이온수가 함유된 병으로 교체하고 폐를 2시간 동안 관류하여 탈세포화합니다. 탈세포화 후 폐 골격을 통해 탈이온화된 오토클레이브수를 15분 동안 관류한 후 10분 동안 탈이온수에 1%비이온성 세제를 투입합니다.마지막으로, 항생제가 보충된 500ml의 오토클레이브 PBS로 병을 교체합니다. 분당 6밀리리터로 펌프를 가동하고 72시간 동안 폐를 관류하면 무세포 폐를 즉시 사용할 수 있습니다. 펌프 카트리지에 70% 에탄올을 분사하고 산소공급기의 유출 끝을 펌프 튜브에 연결하고 다른 쪽 끝을 생물 반응기의 1.5피트 튜브에 연결하여 산소공급기를 설정합니다.무균 상태에서 생물 안전 캐비닛에 생물 반응기 병을 설정합니다. 폐동맥을 통한 흐름을 제어하기 위해 여성 Luer lock의 머리에 3방향 스톱콕을 부착한 다음 기관을 통한 세포 파종을 위해 다른 여성 Luer lock 격벽에 단방향 스톱콕을 연결합니다. 병 바깥쪽에 2인치 튜브를 연결하고 병 안쪽에 6인치 튜브를 연결하여 매체를 순환시킵니다.바이오리액터 병을 산소공급기에 연결하기 위해 튜브를 준비합니다. 수컷 루어 락을 2피트 튜브에 장착하고 암컷 루어 러그 스타일 T를 부착하여 접근성을 제공하고 수컷 루어 락과 암컷 루어 락을 두 개의 풋 튜브에 부착합니다. 세포 배양 배지를 추가하고 생물반응기를 인큐베이터로 옮깁니다.산소공급기 튜브를 열린 두 끝에 연결하여 폐쇄 루프 바이오리액터로 만듭니다. 분당 6ml로 펌프를 사전 실행하여 산소공급기와 튜브에 배양 배지를 채워 튜브에 기포가 발생하지 않도록 합니다. 튜브에 매체가 채워지면 마개를 닫고 생물반응기 병의 양쪽 끝에서 산소공급기를 분리합니다.생물 반응기 병을 생물 안전 캐비닛에 넣고 배양 배지를 마개에 통과시키고 폐 골격의 폐 캐뉼러를 부착합니다. 세포 폐 모델로 작업하는 경우 탈세포화를 건너뜁니다. 수확된 폐는 생물반응기에 다이어던트로 설정할 수 있습니다.배양 배지를 다시 편도 마개를 통과시켜 공기를 제거하고 실크 실로 기관 캐뉼라를 기관에 묶은 다음 생물 반응기 병 뚜껑을 닫습니다. 생물 반응기를 인큐베이터로 옮기고 펌프를 시동하십시오. 배양 배지를 10-15분 동안 실행하여 모든 엽이 팽창하고 폐가 양호한 모양으로 보이는지 확인합니다.전이성 모델에 대해 다음과 같이 무세포 또는 세포 폐 골격을 수정합니다. 매달린 폐 골격이 있는 생물반응기 캡을 열고 Luer 잠금 주사기를 사용하여 5ml의 배양 배지를 기관을 통과시킵니다. 각도 집게를 사용하여 분기점에서 기관을 통해 2-0 실크를 통과시킵니다.분기점에서 오른쪽 폐로 가는 기관을 묶고 배양 배지를 통과시켜 기관을 통해 왼쪽 폐로 매체가 자유롭게 흐르는 것을 확인합니다. RPMI 1640 완전 배양 배지에서 A549 또는 H1299와 같은 폐암 세포를 50ml 부피의 세포를 밀리리터당 2-300만 개의 세포 농도로 준비합니다. 기관 캐뉼라 위에 20ml Luer lock 주사기를 놓고 주사기에 15ml의 세포를 추가합니다.세포 현탁액이 중력에 의해 폐엽을 통과하도록 합니다. 기포가 통과하기 전에 나머지 셀을 추가합니다. 파종이 완료되면 주사기를 제거하고 15분 동안 기다린 다음 생물 반응기에 새 배지를 추가합니다.인큐베이터에 다시 넣고 기포를 제거한 후 분당 6밀리리터로 폐 골격을 관류합니다. 온전한 폐의 조직병리학은 폐포와 폐렴을 보여줍니다. 여기에서 볼 수 있듯이 탈세포화는 폐 세포의 완전한 제거로 이어지며 무세포 폐의 조직 병리학은 손상되지 않은 기저막을 나타냅니다.탈세포화된 폐의 Movat's pentachrome 및 elastin stain은 온전한 혈관 구조와 기관지와 함께 콜라겐, 피브린 및 엘라스틴의 존재를 나타냅니다. 탈세포화된 폐의 DNA 분석은 DNA 함량이 99% 이상 감소한 것으로 나타났습니다.무세포 폐는 세포 배양을 위해 생물반응기에 직접 사용할 수 있습니다. 조직학적 분석은 종양 성장의 존재를 보여줍니다.이 절차를 시도하는 동안 심장의 우심실에 헤파린을 주입하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 개발 이후, 이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 폐암에서 종양 세포의 전이로 이어지는 유전적 및 후성유전학적 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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연구

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Cancer Research

암 연구

이 문서는 인간의 암 세포 라인의 전이성 잠재력을 결정하는 데 사용되는 실험적인 전이 분석의 절차를 설명합니다.

실험 전이 분석

종양 세포 - T 세포 상호 작용의 분석을 위해 실험적인 폐 전이와 CTL immunotherapy 마우스...

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우리는 쥐에 형광 기자를 활용, 폐 전이에서 종양 세포 기질 상호 작용의 생체 라이브 영상에 대한 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여,이 기술은 최소 4 시간 동안 생균의 시각화를 가능하게하고 다른 염증성 폐 상태를 학습하도록 구성 될 수있다.

예는 폐 전이 및 그들의 미세 환경의 라이브 영상을 생체 내

전이성 클론이 먼 곳에 군체를 형성할 수 있는 능력은 증식 능력 및/또는 숙주 미세환경에서 상당한 증식 없이 생존할 수 있는 능력에 달려 있습니다. 여기에서는 전이성 클론에 의한 두 가지 유형의 간 집락화를 정량적으로 시각화할 수 있는 동물 모델을 제시합니다.

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

학습하세요 ex vivo 폐암 모델을 통해 종양 진행 과정을 연구하는 방법을. 이 기술은 원발성 종양과 순환 종양 세포 형성을 가능하게 하며 환자 유래 세포를 이용한 맞춤형 치료법 평가에 활용됩니다.

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

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