Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

이 방법은 종양 진행과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생체 외 무세포 및 세포 폐 모델은 시간이 지남에 따라 성장하고 순환 종양 세포와 전이성 병변을 형성하는 원발성 종양의 형성을 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 단축 된 시간의 암 진행과 다양한 유형의 암 세포의 성장을 연구 할 수 있다는 것입니다.

면역 세포를 포함한 치료 약물의 효능을 평가하기 위해 환자의 종양 세포를 모델에 사용할 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 개인 맞춤형 치료로 확장됩니다. 심하게 마취된 쥐부터 시작한다. 가슴과 복부를 면도하고 클로르헥시딘 면봉으로 피부를 닦습니다.

흉강을 연 후 횡격막의 오른쪽에서 왼쪽에 있는 흉곽의 앞쪽을 절단하여 양측 개흉술을 시행합니다. 흉곽을 위로 잡고 폐에서 혈전 형성을 방지하기 위해 27 게이지 바늘을 사용하여 박동하는 심장의 우심실에 1000 밀리리터의 헤파린 2 밀리리터를 주입합니다. 흉곽을 제거한 후 18 게이지 바늘을 좌심실에 삽입하여 혈액이 배출될 수 있도록 한 다음 25 게이지 바늘을 사용하여 15밀리리터당 12.5 단위의 헤파린 화 PBS를 우심실에 주입합니다.

다음으로, 갑상선 기저부의 기관을 절제하고 하행 대동맥을 반접합 정맥 수준과 대동맥 아치에서 가지로 조심스럽게 제거합니다. 흉강에서 심폐 차단을 제거한 후 좌심실의 절반을 잘라낸 다음 우심실을 통해 주폐동맥에 맞춤 제작된 18게이지 스테인리스 스틸 바늘 캐뉼라를 삽입합니다. 2-0 실크 넥타이로 캐뉼라를 고정하고 우심실과 심방을 조심스럽게 노출시킵니다.

먼저 수은 30mm의 생리학적 관류 압력에서 헤파린화된 PBS가 탈세포화 장치의 병 안으로 자유롭게 흐를 때까지 실행한 다음 폐동맥 캐뉼라를 통해 폐동맥 말단의 탈세포화 장치에 심장-폐 블록을 부착합니다. 헤파린 처리된 PBS로 15분 세척한 후 헤파린 처리된 PBS 병을 0.15% 황산나트륨과 탈이온수가 함유된 병으로 교체하고 폐를 2시간 동안 관류하여 탈세포화합니다. 탈세포화 후 폐 골격을 통해 탈이온화된 오토클레이브수를 15분 동안 관류한 후 10분 동안 탈이온수에 1%비이온성 세제를 투

마지막으로, 항생제가 보충된 500ml의 오토클레이브 PBS로 병을 교체합니다. 분당 6밀리리터로 펌프를 가동하고 72시간 동안 폐를 관류하면 무세포 폐를 즉시 사용할 수 있습니다. 펌프 카트리지에 70% 에탄올을 분사하고 산소공급기의 유출 끝을 펌프 튜브에 연결하고 다른 쪽 끝을 생물 반응기의 1.5피트 튜브에 연결하여 산소공급기를 설정합니다.

무균 상태에서 생물 안전 캐비닛에 생물 반응기 병을 설정합니다. 폐동맥을 통한 흐름을 제어하기 위해 여성 Luer lock의 머리에 3방향 스톱콕을 부착한 다음 기관을 통한 세포 파종을 위해 다른 여성 Luer lock 격벽에 단방향 스톱콕을 연결합니다. 병 바깥쪽에 2인치 튜브를 연결하고 병 안쪽에 6인치 튜브를 연결하여 매체를 순환시킵니다.

바이오리액터 병을 산소공급기에 연결하기 위해 튜브를 준비합니다. 수컷 루어 락을 2피트 튜브에 장착하고 암컷 루어 러그 스타일 T를 부착하여 접근성을 제공하고 수컷 루어 락과 암컷 루어 락을 두 개의 풋 튜브에 부착합니다. 세포 배양 배지를 추가하고 생물반응기를 인큐베이터로 옮깁니다.

산소공급기 튜브를 열린 두 끝에 연결하여 폐쇄 루프 바이오리액터로 만듭니다. 분당 6ml로 펌프를 사전 실행하여 산소공급기와 튜브에 배양 배지를 채워 튜브에 기포가 발생하지 않도록 합니다. 튜브에 매체가 채워지면 마개를 닫고 생물반응기 병의 양쪽 끝에서 산소공급기를 분리합니다.

생물 반응기 병을 생물 안전 캐비닛에 넣고 배양 배지를 마개에 통과시키고 폐 골격의 폐 캐뉼러를 부착합니다. 세포 폐 모델로 작업하는 경우 탈세포화를 건너뜁니다. 수확된 폐는 생물반응기에 다이어던트로 설정할 수 있습니다.

배양 배지를 다시 편도 마개를 통과시켜 공기를 제거하고 실크 실로 기관 캐뉼라를 기관에 묶은 다음 생물 반응기 병 뚜껑을 닫습니다. 생물 반응기를 인큐베이터로 옮기고 펌프를 시동하십시오. 배양 배지를 10-15분 동안 실행하여 모든 엽이 팽창하고 폐가 양호한 모양으로 보이는지 확인합니다.

전이성 모델에 대해 다음과 같이 무세포 또는 세포 폐 골격을 수정합니다. 매달린 폐 골격이 있는 생물반응기 캡을 열고 Luer 잠금 주사기를 사용하여 5ml의 배양 배지를 기관을 통과시킵니다. 각도 집게를 사용하여 분기점에서 기관을 통해 2-0 실크를 통과시킵니다.

분기점에서 오른쪽 폐로 가는 기관을 묶고 배양 배지를 통과시켜 기관을 통해 왼쪽 폐로 매체가 자유롭게 흐르는 것을 확인합니다. RPMI 1640 완전 배양 배지에서 A549 또는 H1299와 같은 폐암 세포를 50ml 부피의 세포를 밀리리터당 2-300만 개의 세포 농도로 준비합니다. 기관 캐뉼라 위에 20ml Luer lock 주사기를 놓고 주사기에 15ml의 세포를 추가합니다.

세포 현탁액이 중력에 의해 폐엽을 통과하도록 합니다. 기포가 통과하기 전에 나머지 셀을 추가합니다. 파종이 완료되면 주사기를 제거하고 15분 동안 기다린 다음 생물 반응기에 새 배지를 추가합니다.

인큐베이터에 다시 넣고 기포를 제거한 후 분당 6밀리리터로 폐 골격을 관류합니다. 온전한 폐의 조직병리학은 폐포와 폐렴을 보여줍니다. 여기에서 볼 수 있듯이 탈세포화는 폐 세포의 완전한 제거로 이어지며 무세포 폐의 조직 병리학은 손상되지 않은 기저막을 나타냅니다.

탈세포화된 폐의 Movat's pentachrome 및 elastin stain은 온전한 혈관 구조와 기관지와 함께 콜라겐, 피브린 및 엘라스틴의 존재를 나타냅니다. 탈세포화된 폐의 DNA 분석은 DNA 함량이 99% 이상 감소한 것으로 나타났습니다.무세포 폐는 세포 배양을 위해 생물반응기에 직접 사용할 수 있습니다. 조직학적 분석은 종양 성장의 존재를 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안 심장의 우심실에 헤파린을 주입하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 개발 이후, 이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 폐암에서 종양 세포의 전이로 이어지는 유전적 및 후성유전학적 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.