Name: 치료 약물은 중요 한 질병에 항생제의 동위 원소 희석 HPLC-MS/MS에 의해 Monitoring 다중화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 학습하세요 HPLC-MS/MS 동위원소 희석법을 이용한 중환자실 항생제 치료 약물 농도 측정 방법을. cefepime, meropenem, ciprofloxacin 등을 정량 분석하여 병원체 감수성에 따른 용량 조절을 지원합니다.

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저자에 대 한 그의 제시 방법 수립 박사 Schütze 감사 하 고 귀중 한 입력에 대 한 박사 Zoller 적절 한 보정 범위에 관한. 저자는 또한 질량 분석 시설 기술 직원을 인정합니다.

참고: 메탄올 등 유기 용 매를 처리할 때 증기 두건에서 작동 하도록 추천 된다. 부피 측정 플라스 크에서 모든 버퍼 및 모바일 단계를 준비 합니다. 지정 하지 않으면, 솔루션 준비 후 최대 1 달 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다.
1. 교정기 및 품질 관리 샘플의 준비
참고: 재고 및 스파이크 솔루션의 준비에 대 한 해당 데이터 분석 시트 추가 파일에 제공 됩니다. 추적의 이유로 해당 열에는 제조 업체, 카탈로그 번호 및 각 항생제의 많은 수를 삽입 합니다. 4 ° C에서 냉장에서 모든 항생제를 녹이 고 작업 시간을 가능한 한 짧게 유지.
<ol><li>준비 물에 25% 메탄올 100 mL: 절대 메탄올 25 mL를 100 mL 부피 플라스 크 프리 필과 그것을 채울 최대 100 mL 증류수.</li>
	<li>준비 물에 200 m m 초 산의 10 mL: HPLC 학년 물 9 mL와 10 mL 부피 플라스 크 프리 필 빙 초 산 (순도 99.5%, 17.4 M)의 115 µ L을 추가 하 고 증류수를 추가 최대 10 mL.</li>
	<li>20 mM 아세트산과 물에서 25% 메탄올 25 mL를 준비: 수성 200 m m 초 산 솔루션의 2.5 mL와 25 mL 부피 플라스 크 프리 필 절대 메탄올의 6.25 mL을 추가 하 고 증류수와 25 mL를 플라스 크를 채우기.</li>
	<li>전체 규모를 사용 하 여 열 초기 무게 추가 파일 에 설명 된 대로 15 mL 원뿔 튜브에 항생제의 적절 한 양의 무게를.</li>
	<li>Fluoroquinolones, ciprofloxacin, moxifloxacin 25% 메탄올-물 20 m m 초 산 등의 재고 솔루션을 준비 합니다. "마지막 볼륨" 열에 있는 추가 파일 에 설명 된 대로이 중된 수량을 해당 볼륨을 추가 합니다. 빠르게 2 분 및 강렬한 vortexing에 의해 초음파 목욕 fluoroquinolone 항생제 분해.</li>
	<li>Cefepime, meropenem, linezolid, 및 25% 메탄올-물에서 piperacillin의 재고 솔루션을 준비 합니다. 이렇게 하려면 열 마지막 볼륨 에 추가 파일 에 설명 된 대로 해당 볼륨이 수량을 추가 하 고 빠르게 강렬한 vortexing에 의해 항생제를 분해 합니다. 마지막 물질로 meropenem을 디졸브.</li>
	<li>10 배 농축된 스파이크 해결책을 보충 파일 에 재고 솔루션의 해당 볼륨 차트에 설명 된 대로 모든 항생제의 재고 솔루션을 결합 합니다.</li>
	<li>0-7 혈 청 교정기를 10 배로 집중된 스파이크 해결책의 1 개의 볼륨으로 마약 없는 혈 청의 9 볼륨 스파이크와 품질 제어 (QC) A-d. 예를 들어 10 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 혈 청의 4.5 ml 스파이크 해결책의 0.5 mL을 추가 하 고 50 rpm에서 롤러 믹서에 4 ° C에서 냉장에서 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 교정기 및 QCs 100 µ L aliquots를 생성 하는 반복적인 피 펫을 사용 합니다.</li>
	<li>교정기, 품질 제어 및 항생제 재고 솔루션-80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장 합니다.</li>
	<li>각 항생제에 대 한 또한 단일 항생제의 1000 mg/L를 포함 하는 깔끔한 솔루션을 준비 합니다. (예를 들어, ciprofloxacin를 사용 하 여 25% 메탄올-물 20 m m 초 산을 포함 하 여에 대 한)는 적절 한 희석 액으로 해당 재고 솔루션을 희석. 참고: 깔끔한 항생제 솔루션은 악기 튜닝 필요만.</li>
</ol>2입니다. 내부 표준 혼합의 준비
참고: 내부 표준 샘플 정리 동안 샘플에 추가 된 관심의 analytes의 동위 원소 표시 대응 됩니다. 내부 표준 레이블된 들을 거의 동일한 전반적인 물리 화학적 특성으로, 그들은 주어진된 샘플의 매트릭스 효과 대 한 보상.
<ol><li>10 mL 쉐이크 플라스 크를 절대 메탄올의 5 mL을 추가 하 여 물에 50% 메탄올 10 mL를 준비 하 고 그것을 채울 최대 10 mL 증류수.</li>
	<li>물 20 m m 초 산을 포함 하 여 50% 메탄올 10 mL를 준비 합니다. 이렇게 하려면 10 mL 플라스 크에 200 m m 초 산의 1 mL를 추가 하 고 절대 메탄올의 5 mL을 추가 하 고 채워 최대 10 mL 증류수.</li>
	<li>제조업체에서 제공 하는 튜브에 직접 1000 mg/L와 내부 표준 (IS)의 재고 솔루션을 생성 합니다. Cefepime-13C12D3 황산 증류수, meropenem D6, linezolid D3, 및 50% 메탄올-물 용액에서 piperacillin-D5 를 분해. Ciprofloxacin D8 50% 메탄올-물에 20 mM 아세테이트 및 moxifloxacin 염-13C1D3 20 mM 아세테이트와 증류수에 용 해.</li>
	<li>오부 집중된 내부 표준 믹스를 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에는 재고 솔루션을 결합 합니다. Cefepime-13C12D3의 meropenem D6, ciprofloxacin D8, moxifloxacin 염-13C1D3의 linezolid 2 µ L의 2 µ L의 1 µ L 10 µ L의 10 µ L을 추가 3, 및 piperacillin-D5 25% 메탄올-물 965 µ L의 10 µ L.</li>
	<li>내부 표준 재고 솔루션 및 오부 집중된 IS 믹스-80 ° c.에 저장</li>
</ol>3. 환자 샘플 저장
주: 혈 청 최대한 빨리 취득 하 고 냉동된 샘플의 콜드 체인 유지 됩니다 확인 하십시오.
<ol><li>전체 혈액 혈 청 컬렉션 튜브에 수집 합니다.</li>
	<li>실 온에서 20-30 분 동안 혈액 응고를 하자.</li>
	<li>10 분 2000 x g 에서 원심 분리 하 여 혈액에서 혈 청을 분리 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 폴 리 프로필 렌 튜브에는 상쾌한을 전송.</li>
	<li>혈 청까지 저장할-80 ° C에서 6 개월까지 분석 이다. 또는-20 ° c.에 3 일까지 샘플을 저장하시오</li>
</ol>4. 버퍼 크로마토그래피에 대 한 준비
<ol><li>준비 물에 1m 암모늄 편대, HPLC 학년 물 100 mL 쉐이크 플라스 크를 사용 하 여 100 mL에 암모늄 편대의 6.306 g을 분해. 4 ° c.에서 1 개월에 솔루션 저장</li>
	<li>모바일 준비 단계는 [10mm 암모늄 편대 물 개미의 산 (99.9:0.1 v/v)]. HPLC 학년 물 약 500 mL와 함께 1000 mL 부피 플라스 크 프리 필, 포 름 산의 1 mL와 10 mL 1 M 염화 편대 솔루션의 추가 하 고 1000 mL를 HPLC 학년 물에 채워. 깨끗 한 유리병에 모바일 단계 A를 전송 및 HPLC 시스템에 연결. 실 온에서 2 주까지 모바일 단계를 저장 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 유리병에 모바일 단계 B. 전송 HPLC 급 절대 메탄올을 준비 하 고 HPLC 시스템에 연결.</li>
	<li>바늘으로 사용 절대 메탄올 용 매를 세척 하 고 모바일 단계 B. 포함 된 유리 병에 해당 튜브를 연결</li>
	<li>물개 및 메탄올-물-개미의 산 (7:92.9:0.1, v/v/v)의 제거 용 매를 생성 합니다. 약 500 mL 증류수와 1000 mL 부피 플라스 크 프리 필 절대 메탄올, 포 름 산의 1 mL의 70 mL을 추가 하 고 1000 mL에 증류수를 추가. 깨끗 한 유리병에 용 매를 전송 및 HPLC 시스템으로 연결. 참고: 다양 한 autosampler 시스템 사용 강한 그리고 약한 바늘 세척 용 매. 이러한 경우, 제조 업체의 권장 사항에 따라 세척 솔루션을 준비 합니다. 예를 들어 메탄올-물-isopropylic 알코올 (70:20:10, v/v/v) 강한 세척 및 물-메탄올 (95:5, v/v)와 약한 세척 할.</li>
</ol>5. 악기 조정
참고:이 단계는 특정 질량 분 서 계에 방법의 설정에 대 한 수행 됩니다.
<ol><li>깔끔한 1000 mg/L 분석 및 내부 표준 솔루션 1시 10분 또는 검출기 신호 강도 따라 모바일 위상 A와 B (50: 50, v/v)의 혼합물에 1: 100 희석. Autotune 기능을 가진 질량 분석기를 조정 하거나 다음 부모 딸 이온 영상14에 대 한 수동 조정: cefepime (481.0 &gt; 167.0/395.7), cefepime-13C12D3 (485.1 &gt; 167.1 / 400.0) meropenem (384.1 &gt; 114.0/141.0), meropenem D6 (390.1 &gt; 114.0/147.2), ciprofloxacin (332.0 &gt; 231.0/245.0), ciprofloxacin D8 (340.1 &gt; 235.1/249.3), moxifloxacin (402.0 &gt; 261.0/383.9), moxifloxacin-13 C1D3 (406.1 &gt; 265.1/388.0), linezolid (338.0 &gt; 235.0/296.0), linezolid D3 (341.1 &gt; 235.1/297.1), piperacillin (518.0 &gt; 143.0/358.9), piperacillin-D5 (523.1 &gt; 142.8/364.1).</li>
	<li>Autotuning와 악기에 대 한 감지기를 통해 전압 및 MS 입구의 설정을 자동으로 조정 하려면 autotune 기능을 사용 합니다.</li>
	<li>수동 조정, 악기 설정 및 조정 합니다 (예를 들어, 충돌 전압 충돌 에너지) 최적 (일반적으로 최대)까지 대 한 신호 강도 각 부모와 딸 이온 검출기에서 얻어진 다. 예를 들어 혼합 티를 연결 하 고 0.5 mL/min에서 모바일 위상 A와 B (50: 50, v/v)을 제공 하 고, 지속적으로 0.1 mL/min의 유량과 깔끔한 항생제 또는 내부 표준 달.</li>
</ol>6. HPLC-MS/MS 설정
참고: 기능 질량 분 서 계, HPLC 시스템 (를 포함 하 여는 autosampler), 및 해당 소프트웨어의 제조업체에 따라 다릅니다. 질량 분 서 계 매개 변수 및 제조 업체의 권장 사항에 따라 세척 절차를 적응.
<ol><li>해당 질량 분석기 매개 변수 저장 'MS 조정 파일 '. 모든 analytes에 대 한 긍정적인 모드 (ESI +)에서 분무 이온화를 사용 합니다. 이온 소스 설정을 사용 하는 악기에 대 한 적응 (예를 들어, 1.5의 모 세관 전압 kV, 소스 온도 120 ° C의, desolvation 온도 400 ° C의, 600 L/h의 desolvation 가스 흐름 율, 0.1 V, RF 렌즈 전압 및 80 ms의 면만 시간).</li>
	<li>분석 및 내부 표준 조정 매개 변수 (예를 들어, 모 세관 전압, 충돌 에너지)에 지정 된 'MS 파일 '.</li>
	<li>Autosampler 조건에 다음과 같이 설정 된 '입구 파일 ': 샘플 온도 10 ° C ± 5 ° C;의 한도 1 x 제거-세척-지우기와 600 µ L에서 세척 순서 제거할 볼륨 교체.</li>
	<li>위에서 언급 한에서 '입구 파일 '설정, 흐름 속도 0.4 또는 0.5 mL/min, 4 분, 실행된 시간 345 바, 압력 높은 한도 및 제한 ± 30 ° C에 열 온도 5 ° c. 모바일 단계 A와 B의 용 매 이름을 추가 하 고 각각 7% B/93% a, 그들을 설정 합니다.</li>
	<li>프로그램에서 크로마 그라디언트는 '입구 파일 ' 다음과 같습니다: 0.00-0.10 7% 모바일 단계 B/93% A, 0.11-0.60와 분 65% 모바일 단계 B/35% A, 0.61-2.10 분 7% 모바일 단계 B/93% A. 95% 모바일 단계 B/5% A, 2.11-4.00 분 분 참고: 추가 열 볼륨, 경 음악 플랫폼 및 USP &lt; 621 &gt; 크로마토그래피 지침16에 설명 된 대로 분석 보존 요인에 대 한 잡고 최대 볼륨을 계산 합니다.</li>
</ol>7. 샘플 측정 마스터 파일
: 참고는 '샘플 측정 마스터 파일 ', 환자 샘플 지정, HPLC-MS/MS 분석 시작 되 고 데이터 평가 수행 됩니다. 낮은 및 높은 품질 제어 쌍을 포함 하 여 두 개의 별도 템플릿 파일 생성 됩니다; A와 C, 다른 한 QC 쌍 B와 D. QC 쌍을 포함 하는 하나의 서식 파일
<ol><li>만드는 새로운 '샘플 측정 마스터 파일 '. 위에서 언급 한 선택 'MS 조정 파일 ', 'MS 파일 ', '입구 파일' (6 절), 그들에 각 샘플 줄 고 15 µ L로 주입 볼륨을 지정 하 고.</li>
	<li>오름차순, 교정기 0-7 및 품질 관리 (QC) 페어/C 또는 QC 쌍 동 "샘플 텍스트"를 추가 합니다.</li>
	<li>샘플 형식을 지정 합니다. 품질 관리 쌍에 대 한 교정기 및 "QC"에 대 한 샘플 유형을 "표준"을 선택 합니다.</li>
	<li>해당 교정기 및 품질 컨트롤 (스프레드시트, 농도 [µ g/mL] 칼 7-칼 0, QC/C 또는 빌딩 참조)에 대 한 각 항 생 물질의 농도 지정 합니다.</li>
	<li>프로그램은 '데이터 평가 방법 '. 계측기 (5 절)을 튜닝 하는 동안 최적화 된 전환을 사용 합니다. 해당 동위 원소 분류 표준 (예를 들어, meropenem-meropenem D6) 각 항생제를 일치 합니다.</li>
</ol>8. 샘플 정리 및 HPLC-MS/MS 분석
참고: 각 샘플 일괄 처리에 대 한 낮은 항생제 농도와 (QC/C 또는 QC 빌딩) 설정 짝된 품질 관리는 처리 및 분석. 다른 배치 사이 짝된 QC 샘플 대체 시퀀스에서 사용 되는 (하루에 1,예를 들어, 선택은 '샘플 측정 마스터 파일 ' 품질 관리를 포함 한 쌍/C; 2 일에 한 포함 한 QC 쌍 동 선택. 혈 청 샘플의 처리는 그림 1에 나와 있습니다.
<ol><li>준비 강수량 에이전트 10% 메 틸-tert-부 틸 에테르 메탄올 (10:90, v/v)에서 (예를 들면, 메 틸-tert의 2.5 mL와 함께 prefill 25 mL 부피 플라스 크-부 틸 에테르 절대 메탄올 25 mL를 채우는).</li>
	<li>C8 역 위상을 열 약 실에 넣으십시오. HPLC와 흐름의 방향에서 질량 분 서 계에 그것을 연결 합니다.</li>
	<li>샘플 목록을 생성 합니다. 해당 열고 '샘플 측정 마스터 파일 ' 서식 파일 추가 목록에 처리할 의미 환자 샘플. 최대 20 환자 샘플의 그룹을 생성 하 고 해당 하는 품질 관리 쌍으로 그들을 측면.</li>
	<li>젖은-프라임 HPCL 시스템 사용 하는 '입구 파일 ' 제어 소프트웨어: 단계로 50% 모바일 A/50% B, "젖은 총리" 기능을 설정 하 고 젖은-프라임 1 mL/min의 유량과 2 분.</li>
	<li>주사기를 새로 고칩니다. 이렇게 하려면 제어 소프트웨어를 사용 하 여 600 µ L의 6 획을 실행 합니다.</li>
	<li>C8 역 위상 열 equilibrate 흐름은 설정 소프트웨어를 사용 하는 '입구 파일 ' 플러시 그것 7% 모바일 확인 0.5 mL/분의 유량을 사용 하 여 5 분의 최소 단계 B/93% A 30 ° c.의 열 온도</li>
	<li>녹여 환자 샘플, 교정기 0-7의 한 약 수와 품질 관리 쌍 (어느 A / B 또는 C/D).</li>
	<li>반복적인 피 펫으로 몇 초 동안 내부 표준 혼합의 25 µ L 100 µ L 교정기, QC 샘플, 또는 소용돌이 튜브 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 환자 혈 청에 추가 합니다.</li>
	<li>벤치탑 통 (예를 들어, 1200 rpm)에 실 온에서 5 분을 위한 혼합물을 품 어.</li>
	<li>반복적인 피 펫과 샘플 내부 표준 혼합 강 수 시 약의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>또, 소용돌이 몇 가지에 대 한 튜브 초 고 벤치탑 통 (예를 들어, 1200 rpm)에 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 탁상 원심 분리기에 20000 x g 에서 현 탁 액을 원심</li>
	<li>HPLC 학년 물 마이크로 삽입 유리 약 병을 사용 하 여 상쾌한 1: 3을 묽 게 하십시오 그리고 그것으로 가공된 샘플은 autosampler 로드.</li>
	<li>수동으로 시작 하는 HPLC-MS/MS 분석는 '샘플 측정 제어 파일 '. 참고: 장기간된 저장을 위해 철저 하 게 단계 붕괴를 방지 하기 위해 [예를 들어, 0.5 mL/min 메탄올-물 (50: 50, v/v)] 제조업체의 추천에 따라 분석 열 플러시.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58148/58148fig1.jpg"> 그림 1: 샘플 정리의 도식 대표. 높은 원심력에 단백질 강 수 밀도 펠 릿을 제공 하 고 그 단백질 강 수 완료 했다 명확한 표면에 뜨는, 나타내는. 전체 처리 시간은 샘플 정리, 컬럼에 분리 및 MS/MS 분석을 포함 하 여 약 30 분입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58148/58148fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
9. 품질 평가 및 정량화
<ol><li>샘플을 처리 하려면 해당 엽니다 '샘플 측정 제어 파일 ', 교정기, 품질 제어 및 환자 샘플을 선택 하 고 그들을 평가 '항생제 정량화 방법 '.
</li>
	<li>특정 분석에 대 한 봉우리 제대로 통합 여부를 확인 합니다. 각 교정기, QC, 그리고 환자 샘플에 대 한 봉우리를 검사 하 고 수동으로 reintegrate 그들 기준선에 필요한 경우.</li>
	<li>보정 곡선을 연구 하 고 다음 품질 기준 충족 여부를 확인할: a) 선형성 전체 보정 범위, b)에 보정 계수 r2 &gt; 0.995, c) 각 교정의 ± 15% 표준 편차는 공칭 값, 부 량 (LLOQ), ± 20%가 필요에의 한 제외.</li>
	<li>위에서 언급 한 조건을 준수 하지 않은 교정 표준 거부 고 다시 회귀 분석을 포함 하 여 교정 곡선을 평가.</li>
	<li>품질 제어를 공부 하 고는 편차는 공칭 값의 ± 15% 이내 여부 검사.</li>
	<li>환자 샘플의 농도 높은 교정기의 농도 초과 하는 경우 1:5 (예, 혈 청의 100 µ L 플러스 증류수의 400 µ L) 샘플 정리 하기 전에 증류수와 샘플 최대 희석. 8.8-8.14 그 특정 샘플에 대 한 단계를 reperform 하 고 그것을 다시 처리.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 원고에 보고 하는 중 환자 실19, 즉 cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, 자주 사용된 항생제의 정량화에 대 한 간단 하 고 강력한 탠덤 질량 분석 기반 방법에 대 한 프로토콜 및 piperacillin14. 스프레드시트 항생제 재고 솔루션, 교정기, 및 품질 컨트롤, 항생제의 순도 및 그들의 counterions의 분자량의 준비에 대 한 원고를 동반 한다. 항생제의 농도 오히려 높은, 그에 주어진 그들의 정량화 분석 관점에서 더 특정 도전 해야 합니다. 따라서, 우리는 확신이 프로토콜은 다양 한 MS 경 음악 플랫폼에 적용 됩니다. 방법 전송, 사용자가 추가 열 량을 계량 하는 격려 된다 및 그들의 컬럼에 시스템의 그라데이션 시작 맞게 막히는 볼륨 따라16시간. 방법 설정 하는 동안 시스템도 이어지기 위해 평가 되어야 한다 ...

항생제는 의학의 실천에 혁명을, 비록 심각한 세균 감염 병 적 상태 및 중요 한 질병1사망률의 주요 원인이 남아 있습니다. 이와 관련, 적절 한 복용량에 적합 한 조직과의 프롬프트 관리 질병 통제2최고 중요성 이다.
증거의 성장 몸은 넓 스펙트럼 항생제와 경험적 치료 환자 집단의 복잡도와 점점 더 문제가 되고있다 보여줍니다. 이것은 특히 집중 치료 단위 (ICU)에 대 한 사실 어디 키 pharmacokinetic (PK) 매개 변수의 엄청난 간 개별 다양성은 자주 관찰3,4. 따라서, 중 환자 실 환자 부족 치료 성공을5,6의 위험 치료 하위 레벨의 절박 한 위험이 있습니다. 그럼 다시, 환자는 심각한 부작용 없이 임상 혜택7에서 발생할 수 있는 항생제 농도 지나치게 높은 불필요 하 게 노출 된다. 항생제 오용 및 부족 한 먹이 지 보건8적 성장 위협 되 고 항생제 저항의 보급을 연료도 있습니다.
항생제의 사용을 개선 하 고 그들의 effectivenessas를 유지 하기 위해, 가능한 한 세계 보건 기구 20159에 항균 성 저항에 대 한 글로벌 행동 계획에 착수 했다. 항생제 관리 프로그램 구성 국가 공중 보건 전략10, 같은 시간에, 그리고 환자 치료11 의 품질을 크게 개선 임상을 돕고 신중한 항균 성 사용의 필수적인 초석 항생제 저항12감소. 항균 성 치료 약물의 응용 프로그램을 통해 개별 환자에서 투약 모니터링 (TDM)이 컨텍스트13주요 악기 이다.
날짜 하려면, 상용 TDM 분석 실험 glycopeptide 항생제와 aminoglycosides 사용할 수만 있습니다. 다른 클래스에서 물질의 정량화는 일반적으로 사내 방법 개발 또는 성가신 수 있는 유효성 검사를 해야 합니다. 그러므로, 선물이 자세히14그들의 임상 관련 농도 범위 내에서 중 환자 실에 가장 관련성이 높은 항생제의 정량화에 대 한 사용할 수 있는 강력한 질량 분석 기반 분석에 대 한 프로토콜. 메서드와 우리의 질량 분석 시설에 최근에 설립 이후로 루틴 중 환자 실에서 TDM에 대 한 적용 되었습니다. 절차 유니폼 샘플 정리, 질량 분석 기능을 갖춘 많은 시설에서 항생제 TDM의 신속한 구현을 위한 수 있도록 간단 하 고 단순 분석 설정을 사용 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, 및 탠덤와 함께에서 동위 원소 희석 액체 크로마토그래피 (LC)를 사용 하 여 인간의 혈 청에 piperacillin의 정량화에 대 한 최적화 된 질량 분석 (MS/MS)입니다. 동위 원소 희석 LC-MS/MS 방법론에 대 한 안정 동위 원소 표시 된 화합물 (예, 혈 청) 특정 행렬에 대 한 관심의 샘플에 추가 됩니다. 동위 원소 분류 기준은 그들의 레이블 없는 대응, 즉 자연 분자 및 부모 이온-하-딸-이온 전환 되 나, 그들의 조각화 제품의 다른 분자 중량으로 관심의 분석에서에서 구분할 수 있습니다. 동위 원소 라는 화합물 그들의 레이블 없는 대응에 비해 거의 동일한 전반적인 물리 화학 행동으로, 그들은 MS/MS의 높은 수준으로 거의 매트릭스 독립적인 분석 정량화를 허용에 대 한 이상적인 내부 표준 정확도15. 요즘, 많은 안정 동위 원소 라는 내부 표준 작은 분자 정량화, 항균, TDM을 포함 하 여 사용할 수 있는 상업적으로 사용할 수 있습니다.
설명된 프로토콜에서 항생제 analytes 컬럼에 분리 분석 C8 알 킬 체인 길이 역 상 열 (100 m m x 2.1 m m, 3 µ m 입자 크기)으로 수행 됩니다. 방법 개발 하는 동안 모든 analytes에 대 한 내부 표준 정규화 된 매트릭스 요소 94.6%와 105.4%, ≤8.314의 변형 계수 했다.

<table><tbody><tr><td>세페핌 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>1097636</td><td>USP 참조 표준</td></tr><tr><td>메로페넴 트리하이드레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>Y0001252</td><td>EP 참조 표준</td></tr><tr><td>시프로플록사신</td><td>시그마-알드리치</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>목시플록사신 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML1581</td><td></td></tr><tr><td>리네졸리드</td><td>토론토 연구 화학물질</td><td></td><td></td>L466500</tr><tr><td>피페라실린 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>93129</td><td></td></tr><tr><td>세페핌-13C12D3 황산</td><td>염 알사킴</td><td>C1297</td> 세페핌 메로페넴-D6<td>에 대한 동위원소 표지 내부 표준</td></tr><tr><td></td><td>토론토 연구 화학물질</td><td>M225617</td> 메로페넴 시프로플록사신-D8에 <td>대한 동위원소 표지 내부 표준</td></tr><tr><td></td><td>토론토 연구 화학물질</td><td>C482501</td><td>시프로플록사신</td></tr><tr><td>목시플록사신-13C1D3 염산염</td>에 대한 동위원소 표지 내부 표준물 <td>토론토 연구 화학물질</td><td>M745003</td> 동위원소 표지 뜸L466502 리네졸리드-D3<td>에 대한 동위원소 표지 내부 표준</td></tr> 토론토 연구 화학물질 리네졸리드 피페라실린-D5<tr><td></td><td></td><td></td><td>에 대한 동위원소 표지 내부 표준</td></tr><tr><td></td><td>토론토 연구 화학물질</td><td>P479952</td><td>동위원소 표지 내부 피페라실린</td></tr><tr><td>메탄올</td>의 표준 <td>JT 베이커</td><td>8402</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>JT 베이커</td><td>4218</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Biosolve</td><td>6914132</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Biosolve</td><td>1070501</td><td></td></tr><tr><td>포름산 암모늄</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>70221-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>tert-부틸 메틸 에테르</td><td>머크</td><td>101845</td><td></td></tr><tr><td>포티스 3 &mu; m C8 100 * 2.1 mm</td><td>Fortis</td><td>F08-020503</td><td></td></tr><tr><td>Ti-PEEK-encased Prifilter (2 &mu; m)</td> <td>Chromsystems</td><td>15011</td><td></td></tr><tr><td>2795 Alliance HPLC 시스템</td><td>Waters</td><td>176000491</td><td></td></tr><tr><td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td><td>Waters</td><td>720000338</td><td></td></tr><tr><td>QuanLynx 4.1 소프트웨어</td> 질량 <td>분석기 제조업체에서 제공하는</td><td>Waters</td> <td>/</td> Data 평가 소프트웨어</tr><tr><td>Supplemental File</td><td></td><td></td><td>Stock Solutions</td></tr></tbody></table>

치료 약물은 중요 한 질병에 항생제의 동위 원소 희석 hplc-ms/ms에 의해 monitoring 다중화

Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses

특히 병원 항생제 관리 프로그램의 구현에 관한 많은 임상 시설에서 항생제의 치료 약물 모니터링에 대 한 늘어나는 수요를 있다.
현재 작업에서는 cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, 및 일반적으로 사용 되는 piperacillin의 정량화에 대 한 다중-고성능 액체 크로마토그래피 탠덤의 질량 분석 (HPCL-MS/MS) 프로토콜 소개 집중 치료 단위에 항생제입니다. 메서드는 이전 유럽 약 기관의 지침에 따라 포괄적으로 검증 된다.
빠른 샘플 정리 후에 analytes는 4 분 이내 C8 역 상 HPLC 열에 분리 하 고 해당 안정 동위 원소 라는 내부 표준 여러 반응에 분무 이온화 (ESI +) 질량 분석에서 정량 시간 모니터링 (MRM)입니다. 제시 방법은 간단한 계측 균일 한 컬럼에 조건 설정, 임상 실험실에서 매일 하 고 강력한 항생제 치료 약물 모니터링에 대 한 허용을 사용 합니다. 보정 곡선 함으로써 민감한 박테리아 및 피크 농도 (C최대) bolus로 가져온 최소 억제 농도 (MIC) 가까이 항생제 금액을 포함 한 pharmacokinetic 농도 범위에 걸쳐 관리 식이요법입니다. 샘플 정리 하기 전에 혈 청 희석이 필요 없이 관리 항생제에 대 한 곡선 아래의 영역 여러 측정을 통해 얻어질 수 있다.

설명 된 프로토콜을 사용 하는 전형적인 크로마 그림 2에 묘사 된다. 현재 시스템에서 열 죽은 볼륨 ~0.22 mL와 ~0.08 mL와 함께 추가 열 볼륨 (인젝터, 배관, 및 커넥터 포함) 결정 했다 미국 약전 (USP) 크로마토그래피 지침16, 따라 주는 ~0.30 mL의 잡고 최대 볼륨입니다. 모든 analytes에 대 한 계산 된 보존 요인 했다 2.8 (cefepime)-대 (piperacillin)에 대 한 4.2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58148/58148fig2.jpg"> 그림 2: 표준화 된 신호 농도와 전형적인 분석 크로마. 항생제는...

여기 선물이 집중 치료 단위, 즉 cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, 및 piperacillin에서에서 자주 사용 되는 항생제의 정량화를 위한 탠덤 질량 분석 기반 프로토콜.

치료 약물은 중요 한 질병에 항생제의 동위 원소 희석 HPLC-MS/MS에 의해 Monitoring 다중화

There is an ever-increasing demand for the therapeutic drug monitoring of antibiotics in many clinical facilities, particularly with regard to the ...

항생제에 대한 치료제 모니터링은 국가 및 지역 항생제 관리 프로그램의 이행을 위한 중요한 요소로 점점 더 인식되고 있습니다. 의료 시설에서 항생제 치료 약물 모니터링에 대한 이러한 증가하는 수요를 충족하기 위해 당사는 관련 병원체의 감수성에 따라 용량을 조정하는 것을 목표로 하는 순환 중인 항생제의 정량화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 질량 분석 기반 프로토콜은 중환자실에서 가장 일반적으로 사용되는 항생제, 즉 세페핌, 메로페넴, 시프로플록사신, 목시플록사신, 리네졸리드 및 피페라실린의 정량화에 최적화되었습니다.보정 범위가 넓기 때문에 이 방법은 투여된 항생제에 대한 곡선 아래의 약동학 영역을 계산하는 데에도 사용할 수 있습니다. 총 처리 시간이 약 30분인 제시된 프로토콜은 임상 실험실에서 매일 항생제 치료 약물을 모니터링하는 데 적합합니다. 먼저, 9 부피의 약물 무함유 혈청을 이전에 준비된 10 배 농축 스파이크 용액 1 부피와 함께 스파이크하여 혈청 캘리브레이터 0에서 7 및 품질 관리 A에서 D를 얻습니다.예를 들어, 10 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 4.5 밀리리터의 혈청에 0.5 밀리리터의 스파이크 용액을 첨가하고 50 rpm의 롤러 믹서에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 배양합니다.반복적인 피펫을 사용하여 1.5ml 폴리프로필렌 튜브에서 100마이크로리터 분취량의 교정기 및 품질 관리를 생성합니다. 교정기, 품질 관리 및 이전에 준비된 항생제 원액을 섭씨 영하 80도에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 6개의 내부 표준물질 원액을 준비한 후 1.5ml 폴리프로필렌 튜브에 결합하여 5배 농축된 내부 표준물질 혼합물을 생성합니다.물 속의 25% 메탄올 965마이크로리터에 원하는 내부 표준물질을 추가합니다. 내부 표준 원액과 5배 농축된 내부 표준 혼합물을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이동상 A를 준비하려면 약 500ml의 HPLC 등급 물을 1, 000ml 부피 플라스크에 첨가합니다.포름산 1 밀리리터, 1 몰 포름산 암모늄 10 밀리리터를 첨가하고 플라스크를 1, 000 밀리리터에 HPLC 등급의 물로 채 웁니다. 그런 다음 이동상 용액을 깨끗한 유리병에 옮깁니다. 이동상 B를 준비하려면 깨끗한 유리병에 HPLC 등급의 절대 메탄올을 첨가합니다.퍼지 용매를 준비하려면 약 500ml의 증류수를 1, 000ml 부피 플라스크에 추가합니다. 70 밀리리터의 절대 메탄올, 1 밀리리터의 포름

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타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

여기, 우리 뒤에 고해상도 (~ 30000) MS-탐지 아군된 펩타이드 표준 단일 클론 항 체에의 정량화에 대 한 펩 티 드 파편의 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리와 결합 하 여 크로마 분석 결과 설명 다이제스트입니다.

액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

이 프로토콜에 설명 합니다 샘플 추출의 효율적이 고 편리한 분석 프로세스와 여러 약물, 독 소 루비 (DOX), 미토마이신 C (MMC) 및 심장 독성 DOX 대사 산물, doxorubicinol (DOXol), 생물학에서의 동시 결정 전 임상 유 방 종양 모델에서 샘플 시너지 약물 조합의 나노 제형으로 치료.

샘플 추출 및 독 소 루비와 미토마이신 C 다음 약물 조합을 전달 나노 입자에 종양 방위 쥐의 동시 크로마 정량

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

여기 멀티 주입-모 세관에 따라 품질 관리와 향상 된 해상도 및 약물 남용 및 그들의 대사 산물의 대형 패널의 검출에 대 한 허용 하는 포괄적인 약물 감시 하는 높은 처리량 방법 설명 전기 이동 법 질량 분석입니다.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

핵자기공명(NMR) 분광법은 다양한 질병을 앓고 있는 환자의 대사 산물에서 조절 장애를 식별하는 데 사용됩니다. 이 기술을 사용하면 정신 나간 대사 산물을 정량화하여 병태 생리학적 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에서는 환자의 대사 특성화를 위한 NMR 기반 접근법의 단계별 절차를 설명합니다.

NMR 기반 대사체학을 사용한 중증 환자의 정신 나간 대사 산물의 식별 및 정량화

학습하세요 HPLC-MS/MS 동위원소 희석법을 이용한 중환자실 항생제 치료 약물 농도 측정 방법을. cefepime, meropenem, ciprofloxacin 등을 정량 분석하여 병원체 감수성에 따른 용량 조절을 지원합니다.

치료 약물은 중요 한 질병에 항생제의 동위 원소 희석 HPLC-MS/MS에 의해 Monitoring 다중화

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