단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

이 방법은 세포사멸 세포의 흡수를 매개하는 신호 분자의 역할과 같은 efferocytosis 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 방법으로는 항상 분명하지 않은 부분 또는 단편적인 자가사멸 세포 흡수를 포함하여 세포사멸 세포 흡수를 명확하게 정량화할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 면역 세포에 의한 efferocytosis에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 상피 세포나 암 세포와 같은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 현미경 획득 설정을 최적화하기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 인간 대식세포와 세포사멸 Jurkat 세포를 준비한 후 혈구계를 사용하여 세포사멸 세포를 계수합니다. 그런 다음 충분한 양의 세포사멸 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

원심분리를 통해 Jurkat 세포를 500배 g에서 5분 동안 펠렛화합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁합니다. Jurkat 세포가 원심분리기에 있는 동안 10마이크로리터의 DMSO를 새로운 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다.

다음으로, DMSO에 최소량의 NHS-비오틴을 용해시킵니다. 그 후, 500 마이크로리터의 세포사멸세포와 PBS 현탁액을 DMSO 및 NHS-비오틴이 함유된 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 적절한 세포 추적 염료를 희석합니다.

세포 현탁액을 실온에서 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 동일한 부피의 RPMI 1640과 10% FBS를 첨가하고 어둠 속의 실온에서 추가로 5분 동안 현탁액을 배양합니다. 그 후, 500 배 g에서 5 분 동안 원심 분리를 통해 세포를 펠렛화합니다.

그런 다음 상등액을 버리고 염색된 세포를 100마이크로리터의 RPMI 1640에 10% FBS로 재현탁합니다. 100마이크로리터의 염색된 세포 현탁액을 대식세포의 각 웰에 적하하여 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 200회 g에서 1분 동안 원심분리합니다.

조직 배양 인큐베이터에서 5%CO2와 함께 섭씨 37도의 플레이트를 배양합니다. 적절한 배양 기간이 끝나면 인큐베이터에서 세포를 제거합니다. 그런 다음 1ml의 PBS로 세포를 두 번 씻습니다.

그런 다음 각 웰에 희석된 FITC-conjugated streptavidin을 추가합니다. 그리고 어둠 속에서 20분 동안 접시를 배양합니다. PBS 1ml로 세포를 세 번 세척하고 헹굴 때마다 5분 동안 샘플을 부드럽게 흔듭니다.

그런 다음 PBS에 4%파라포름알데히드로 세포를 실온에서 20분 동안 고정합니다. PBS로 세포를 한 번 헹구어 과도한 PFA를 제거합니다. 이미징 슬라이드에 커버 슬립을 장착하고 슬라이드를 형광 현미경으로 옮깁니다.

정량화를 위해 충분한 수의 세포의 Z 스택을 캡처합니다. 모든 삼킨 apoptotic 물질이 감지되도록 상기 섹션 사이의 거리를 설정하는 것이 중요합니다. 상기 섹션 사이의 최대 거리는 대물 렌즈의 초점 깊이보다 크지 않아야 하며 일반적으로 0.5에서 1마이크로미터입니다.

가져오기 기능을 사용하여 Z 스택 중 하나를 소프트웨어에 로드합니다. 그런 다음 Set Measurements 패널에서 Integrated density를 측정 옵션으로 선택합니다. streptavidin 및 세포 추적 염료 채널이 모두 오버레이로 표시되는 경우 분석을 가장 쉽게 수행할 수 있습니다.

둘레를 따라 스트렙타비딘 염색이 있는 모든 물체는 스트렙타비딘 양성으로 간주되어야 하므로 스트렙타비딘 음성으로 정량화되어서는 안 됩니다. 이미지가 로드되면 streptavidin과 Freehand 또는 다각형 선택 도구를 사용하여 Z 스택의 단일 평면에서 모든 세포 추적 염료 양성 스트렙타비딘 음극 재료에 동그라미를 칩니다. 그런 다음 해당 영역에서 세포 추적 염료의 통합 강도를 측정합니다.

동일한 Z 섹션에서 스트렙타비딘 염색 및 프리핸드 또는 폴리곤 선택 도구를 사용하여 모든 세포 추적 염료 양성 스트렙타비딘 양성 물질에 동그라미를 칩니다. 마지막으로, 이 영역의 통합 강도를 측정합니다. 이 절차를 사용하여 Staurosporine으로 처리된 Jurkat 세포의 95% 이상이 세포사멸을 거쳤습니다.

대부분의 실험에서, 발포세포화된 세포사멸세포의 분율은 시간에 의존하는 방식으로 증가했다. 다양한 efferocytic cell type 또는 다른 apoptotic cell target에 대해 이 프로토콜을 최적화할 때 apoptotic cell 대 efferocytic cell 비율의 범위를 테스트하는 것이 중요합니다. 일반적으로 10 대 1 또는 30 대 1의 비율이 가장 적합합니다.

이 절차는 발포성 세포에서 형광 리포터 유전자를 발현하여 신호 분자 활성화 또는 세포 내 이동을 추적하도록 쉽게 수정할 수 있으므로 발포성 세포 생성 중에 이러한 프로세스를 이미지화할 수 있습니다.