Name: 단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 학습하세요 형광 현미경법을 이용한 단일 세포 에퍼로사이토시스 정량화 방법을 통해 면역 세포가 사 apoptotic 세포를 섭취하는 과정을 분석하고 세포 신호 전달 경로를 평가하는 기술을 익히세요.

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이 연구는 건강 연구 (CIHR) 운영 보조금 MOP-123419, 자연 과학 및 엔지니어링 연구 위원회의 캐나다 발견 그랜트 418194, 그리고 온타리오 교육부의 연구 및 BH 혁신 초기 연구 수상의 캐나다 학회에 의해 투자 되었다. DGW는 프로토콜의 최적화 및 원고;의 쓰기에, 제시 하는 이미지의 일부를 기여 그는 리버풀 대학에서에서 펌프 못쓰게 교부 금에 의해 투자 되었다. CY는 Vanier 대학원 장학금 및 CIHR MD/PhD 재학에 의해 자금입니다. 자금 지원 기관 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

건강 한 지원자에서 혈액의 컬렉션 건강 과학 연구 윤리 위원회의는 웨스턴 온타리오 대학에 의해 승인 되었다. Venipuncture 인간의 연구에 세 배 회의 정책 성명의 지침에 따라 수행 되었다.
1. 문화 및 THP 1 Monocyte 셀 라인의 준비
<ol><li>37 ° C + 5% CO2T25 플라스 크에서 현 탁 액 문화로 문화 THP 1 monocytes. 셀 소 태아 혈 청 (FBS) 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640) + 10%의 5 mL에 성장 한다.</li>
	<li>
부드럽게 흔들어 플라스 크, 성장 매체에 걸쳐 균등 하 게 각 날짜 일시 셀 다음 즉시는 hemocytometer 셀을 계산 합니다. 세포는 세포 밀도 도달 하면 1 x 106 셀/mL passaged 해야 합니다.
	<ol>
<li><li></li><li><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li><li><li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></ol><ol><li></li><li><li><li></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li><li><li></li><li><li><li><li></li><li><li> </li><li><li><li><ol><li></li><li><li><ol><li></li><li></li><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58149/58149eq1.jpg"></li><li></ol></li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><li><li> </li><li><ol><li></li><li><li></li><li></li></ol></li><li></li></ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

이 프로토콜에서 설명 된 방법을 사용 이미징 및 고정 셀 및 라이브 셀 접근을 사용 하 여 동적 efferocytic 프로세스의 정량화. 이러한 방식을 일반적으로 고용된 흐름 cytometry 기반 방법23,24에 여러 가지 이점을 제공합니다. 내부 고정 샘플 얼룩의 사용 속도의 더 강력 하 고 정확한 정량화와 efferocytosis의 범위를 제공 한다-실제로, 많은 교류 cytometry 기반 방법을 간단 하 게 레이블을 apoptotic 세포와 대 식 세포와 다른 fluorophores, 그리고 점수 efferocytosis 공동 apoptotic 세포 마커, 따라서 구별 하는 능력 부족으로 얼룩이 지는 세포의 일부분으로 내 면된 apoptotic 세포 소재 대 구속. 대체 흐름 cytometry 접근 apoptotic 세포24을 표시 하는 pHrodo를 사용 하 여 포함 됩니...

Apoptosis, 또는 프로그램 된 세포 죽음 대부분 다세포 유기 체에서 발생 하 고 그들의 발달 및 항상성1에 대 한 중요 한 높은 규제 생리 적 과정 이다. 정상 세포 회전율 및 배아 개발에 참여 하 고, 이외에 apoptosis 조직에서 감염 되거나 손상 된 세포의 제거를 가능 하 게 하 고 또한 감염, 염증, 암, 응답 하 고으로 의료 개입에 의해 트리거할 수 있습니다. 방사선 치료 또는 스테로이드1등. Apoptotic 세포 노출 "먹고-나" 다양 한 직업 및 비 직업적인 식 세포에 수용 체에 의해 인식 되는 그들의 세포 표면에 신호 총칭 하 여 "efferocytes"로. 이 수용 체의 참여 efferocytosis2,3로 알려진 프로세스를 통해 efferocyte에 의해 통풍 관 및 apoptotic 세포의 저하를 유도 합니다. Phosphatidylserine은 최고의 특징이 먹고-저 운전 efferocytosis 신호. 그것은 일반적으로 apoptosis을 따라서4셀 표면 phosphatidylserine 노출이 막 비대칭 방해 지질 scramblase 활성화와 원형질 막의 내부 자료에 국한 된다. Phosphatidylserine은 성숙한 세포 등 일부 비 apoptotic 세포의 세포 외 표면에 있고 혈소판 활성화. 그러나,이 세포는 하지 "" 나를 안 먹는, 같은 신호 CD47, 그들의 세포 표면5,,67의 존재로 인해 efferocytosed. 노출된 phosphatidylserine efferocytes에 의해 표현 하는 efferocytic 수용 체의 배열에 의해 인식 된다. Phosphatidylserine에이 수용 체의 바인딩을 직접 또는 opsonins의 원조를 통해 활성화 되 나 efferosome8, 막 도약 공포에 apoptotic 세포의 engulfment를 홍보 하는 신호 통로 9 , 10 , 11 , 12.는 efferosome endosomes를 순차적으로 퓨즈와 리소좀, 분자 기계는 efferosome를 시 어 지 다 하 고 저하는 apoptotic 필요한 제공 셀 화물13,14. 일단 저하, apoptotic 세포 유래 자료는 재활용 endosome에 인신 매매-apoptotic 세포 유래 항 원에 면역 응답을 제한 하 고는 apoptotic 세포13에서 영양분의 복구에 대 한 수는 프로세스 15. Apoptotic 세포;의 장애인된 허가에 efferocytosis 결과에 실패 이러한 uncleared 세포는 결국 보조 괴 사를 받 다. 회 저 성 세포 프로-염증 성 cytosolic 내용, 병원 균, 그리고 autoantigens 따라서 감염, 염증, 자기 면역 질병16,17의 연습장 extracellular 환경으로 풀어. 함께, apoptosis와 efferocytosis 죽어가는 및 죽은 세포의 제거를 촉진 하 고 조직의 항상성 유지에 대 한 허용.
Efferocytosis 기본 분자 메커니즘을 조사 apoptotic 세포 통풍 관의 명확한 정량화를 제공 하는 메서드가 필요 합니다. 이 정량화는 다른 글귀와 달리 endocytosis 및 먹어서18,19, efferocytosis 메커니즘 발생할 수 있습니다 하지 증분 통풍 관의 결과로 그대로 목표 셀의 engulfment에서 사실에 의해 복잡 하 게 efferocyte20apoptotic 세포. 여기에 설명 된 프로토콜 설명 생체 외에서 efferocytosis 분석 결과 내 면의 정확한 묘사를 제공 하는 개별 apoptotic 세포의 비 내 면 부분 대 고정 셀의 다양 한 결합 될 수 있다 및 라이브 셀 현미경에 접근 한다. 전통적인 먹어서 분석 추가 항 체 비 내 면 목표, 우리의 방법으로 레이블 하기 위해 실험의 끝에 phagocytic 대상에 특정 라벨 covalently 연결 biotin21 apoptotic 대상으로 다릅니다 , 22. apoptotic 세포 특정 항 체는이 분석 결과에 사용할 수 있는, biotinylation 접근 어떤 단백질 베어링 대상 표시를 허용 하 고 immunostaining 수행 하는 경우에 이차 항 체 분으로 잠재적인 문제를 피할 수 . 특히, 우리는 셀 추적 염료와 biotin 듀얼 얼룩이 있다 apoptotic Jurkat 세포의 준비 개요. 염료를 추적 셀 apoptotic 세포 유래 자료 efferocytosis 중 추적, 표면 biotinylation의 차별에 대 한 허용 하는 반면 efferocytosed apoptotic 세포의 비 내 면 부분에서 내 면화를 허용 합니다. 우리는 또한 문화 및 준비 J774.2 및 THP-1 셀 라인의 murine 인간과 efferocytes로 사용, M2 세포 monocyte 파생에 대 한 기본 셀 efferocytosis, 및 사용에 대 한 Jurkat 세포의 예를 들어 efferocytic 대상으로 설명합니다. 이러한 방법은 다른 세포 선 또는 1 차 셀, 대상 셀 (예: apoptosis, 괴 사 및 necroptosis), 세포 죽음의 어떤 형태를 겪고 그리고 지질 코팅을 통해 apoptotic 세포 시뮬레이션 미크론 크기의 모방에 쉽게 적용할 수 또는 특정 관심의 efferocytic 수용 체에 ligands와 코팅.
이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 필드23,24에 일반적으로 사용 되는 흐름 cytometry 기반 방법 몇 가지 장점이 있습니다. 직접 식 apoptotic 세포 상호 작용, 모두 총 및 비 내 면 apoptotic 세포 물자의 명확한 라벨와 함께 영상으로 efferocytosis의 정량적 측정을 할 수 있다. 또한, pH을 구분 하지 않는 fluorophores의 사용 등 몇 가지 대체 방법을25confounds lysosomal pH에서 FITC와 GFP 형광 억제 혼동 요인 제한 합니다. 마지막으로, 세부 사항에 설명 되지 않은, 하는 동안 이러한 방법을 채택 될 수 있다 transgenes 붙일 표시를 표현 하는 efferocytes를 사용 하 여 또는 후 고정 immunostaining, 신호 분자 활동 및 모니터링의 정량화를 허용 하는 efferocytosis 중 세포 프로세스입니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Wisent</td><td>3500-000-EL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 원형 유리 커버슬립 #1.5 두께</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72290-08</td><td>커버슬립의 크기와 모양은 중요하지 않지만, 세포 배양을 단순화하는 표준 12웰 플레이트의 웰에 18mm가 맞습니다.</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Cayman Chemical</td><td>81590</td><td>1mM(1,000x 스톡 용액)에서 DMSO에 용해(1,000x 원액)</td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa 488</td><td>ThermoFisher</td><td>R37174</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td>건조기에 보관합니다. 원액을 준비하지 마십시오.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace FarRed</td><td>ThermoFisher</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Streptavadin</td><td>ThermoFisher</td><td>SA1001</td><td></td></tr><tr><td>림프폴라이트-폴리 세포 분리 배지</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5071</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-4</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>J774.2 대식 세포 세포주</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85011428-1VL</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 인간 단핵구 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat T 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 efferocytosis의 정량화

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis의 규칙을 공부 apoptotic 세포의 통풍 관을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis를 제어 하는 신호 및 세포 프로세스를 조사 하는 방법을 필요 합니다. 이 정량화 수행 apoptotic 세포 들은 efferocytosed 증분, 따라서 수 정확 하 게 윤곽을 그리 다 잔여 unengulfed 휴대 대 apoptotic 대상의 efferocytosed 부분 사이 방법이 필요로 하기 어려울 수 있습니다. 파편. 여기 설명 된 방법은 이중 라벨 접근 efferocytosis와 efferocytic 용량의 efferocytes 대 식 세포 등의 역학을 정확 하 게 계량을 활용 합니다. Apoptotic 세포의 cytosol apoptotic 세포의 표면 biotinylation 내 면 및 비 내 면 간의 차별화에 대 한 허용 하는 동안 모든 apoptotic 세포 유래 물질의 모니터링을 활성화 하는 셀 추적 염료와 함께 표시 됩니다. apoptotic 세포의 분수 Efferocytes의 efferocytic 용량 라이브 또는 고정 셀의 형광 이미지와 streptavidin 얼룩으로 구분으로 대 내 면된 대상, 바운드의 양을 측정 하 여 결정 됩니다. 이 방법은 cytometry, 즉 비-efferocytosed 대 efferocytosed apoptotic 세포 분수, efferocytic 역학 라이브 셀 현미경으로 측정 하는 능력의 정확한 묘사 같은 방법에 비해 몇 가지 장점이 고 용량을 붙일 레이블 transgenes 표현 하는 세포에 세포 신호의 연구를 수행 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법, efferocytic 활동을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis 동안 활성 세포 신호 경로 심문 하는 데 사용할 수 있는 유연한 실험적인 접근 방식 기반으로 제공 합니다.

밤새 Jurkat 세포의 apoptosis에 1 µ M staurosporine 결과 문화 &gt; Annexin v (그림 1) 얼룩 확인 될 수 있다 세포의 95%. 비록 staurosporine의 농도 및 staurosporine 치료 기간 각 셀 라인에 대 한 최적화 될 필요가 있을 것 이다 다른 세포 유형,이 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 검색 및 efferocytosis의 정량화에 대 한 &gt; 세포의 80%는 efferocytes에 그들을 추가 하기 전에 apoptotic 이어야 한다. Apoptosis (예: 열 충격, etoposide 및 UV 빛)의 다른 inducers를 사용할 수 있습니다, 하지만 우리의 경험, 이러한 생산 apoptosis와 혼합된 셀 인구 apoptotic, 괴 사 성 등을 포함 하는 결과의 더 많은 다른 유형의 유도 및 apoptotic...

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

이 방법은 세포사멸 세포의 흡수를 매개하는 신호 분자의 역할과 같은 efferocytosis 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 방법으로는 항상 분명하지 않은 부분 또는 단편적인 자가사멸 세포 흡수를 포함하여 세포사멸 세포 흡수를 명확하게 정량화할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 면역 세포에 의한 efferocytosis에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 상피 세포나 암 세포와 같은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 현미경 획득 설정을 최적화하기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 인간 대식세포와 세포사멸 Jurkat 세포를 준비한 후 혈구계를 사용하여 세포사멸 세포를 계수합니다. 그런 다음 충분한 양의 세포사멸 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.원심분리를 통해 Jurkat 세포를 500배 g에서 5분 동안 펠렛화합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁합니다. Jurkat 세포가 원심분리기에 있는 동안 10마이크로리터의 DMSO를 새로운 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다.다음으로, DMSO에 최소량의 NHS-비오틴을 용해시킵니다. 그 후, 500 마이크로리터의 세포사멸세포와 PBS 현탁액을 DMSO 및 NHS-비오틴이 함유된 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 적절한 세포 추적 염료를 희석합니다.세포 현탁액을 실온에서 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 동일한 부피의 RPMI 1640과 10% FBS를 첨가하고 어둠 속의 실온에서 추가로 5분 동안 현탁액을 배양합니다. 그 후, 500 배 g에서 5 분 동안 원심 분리를 통해 세포를 펠렛화합니다.그런 다음 상등액을 버리고 염색된 세포를 100마이크로리터의 RPMI 1640에 10% FBS로 재현탁합니다. 100마이크로리터의 염색된 세포 현탁액을 대식세포의 각 웰에 적하하여 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 200회 g에서 1분 동안 원심분리합니다.조직 배양 인큐베이터에서 5%CO2와 함께 섭씨 37도의 플레이트를 배양합니다. 적절한 배양 기간이 끝나면 인큐베이터에서 세포를 제거합니다. 그런 다음 1ml의 PBS로 세포를 두 번 씻습니다.그런 다음 각 웰에 희석된 FITC-conjugated streptavidin을 추가합니다. 그리고 어둠 속에서 20분 동안 접시를 배양합니다. PBS 1ml로 세

quantification-of-efferocytosis-by-single-cell-fluorescence-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 세포사멸 세포의 청소를 연구하기 위한 efferocytosis assay를 시연합니다. efferocytosis는 apoptotic cell이 phagocyte에 의해 삼켜지고 efferosomes라고 하는 소포 내에서 분해되는 다단계 과정입니다. 이 프로토콜은 개별 세포사멸 세포의 내부화된 부분과 내부화되지 않은 부분을 시각화하고 efferocytosis를 정량화하는 방법을 제공합니다.

Fixed Cell Efferocytosis Assay: 형광 현미경을 사용하여 대식세포에 의한 세포사멸 세포의 발포성 흡수를 연구하는 방법

이 비디오는 인간 백혈구에 의한 FITC 표지 병원성 진균 포자의 식세포작용을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 식세포작용된 포자는 counterstaining을 통해 세포 부착 포자에서 식별한 후 유세포 분석을 수행합니다.

인간 식세포에 의한 Fungal Spore Phagocytosis의 정량적 유세포 분석 측정

이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

세포 집단의 생물 학적 및 화학적 분석을 필요로하는 많은 과학적인 연구를 위해 세포는 순도 높은 상태에 있어야합니다. 형광 활성 세포 정렬 (외과)는 순수한 세포 인구를 얻을 수있는 우수한 방법입니다.

형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

학습하세요 형광 현미경법을 이용한 단일 세포 에퍼로사이토시스 정량화 방법을 통해 면역 세포가 사 apoptotic 세포를 섭취하는 과정을 분석하고 세포 신호 전달 경로를 평가하는 기술을 익히세요.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

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