Name: 물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 학습하세요 Oryzias latipes 뇌하수체 원세포 배양법으로 온도, 삼투압, pH를 최적화하여 생리학적 환경을 모사합니다. 이 방법은 세포 생존율 90% 이상을 유지하며 호르몬 반응 및 전기생리학적 활성 분석이 가능합니다.

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이 프로젝트는 생명과학과 연구 노르웨이 위원회, 부여 번호 243811 및 244461 (양식 프로그램)의 노르웨이 대학에 의해 투자 되었다. 우리는 물고기 시설을 유지 하기 위한 생명 공학의 노르웨이 대학에서 루르 드 Carreon 탄을 감사입니다.

이 연구에서 동물 실험은 생명 과학, 관리 및 연구 동물의 복지에 대 한 다음 지침의 노르웨이 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>정확한 측정을 위해 제조업체의 지침에 따라 osmometer 및 pH 미터 계기 보정.</li>
	<li>
캘리포니아2 +-와 Mg2 +500ml를 준비-Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (dPBS), 7.75 (단계 1.2.1)을 pH와 290 mOsm/kg (단계 1.2.2) 살 균 여과 (1.2.3 단계) 전에 osmolality 조정 무료.
	<ol>
<li>신중 하 게 신중 하 게 해결책을 교 반 하면서 방울 1 M NaOH 솔루션을 추가 하 여 보정 된 pH 미터 7.75에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>보정된 osmometer를 사용 하 여 솔루션의 osmolality 측정 하 고 마 니 톨 290 mOsm/kg osmolality 증가 하는 데 필요한 금액을 계산. 마 니 톨의 필요한 금액을 추가 하 고 다시 올바른 조정 되도록 솔루션의 osmolality 측정. 참고: 필요한 마 니 톨의 크기는 일반적으로 다른 배치 사이 변화 한다, 측정 osmolality에 따라 다릅니다. 마 니 톨에의 한 분자 1 삼 투 입자를 같습니다.</li>
		<li>멸 균 필터 dPBS 솔루션 0.2 µ m 필터를 사용 하 여. 참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 3 개월 이상.</li>
	</ol>
</li>
	<li>L-글루타민 및 중 탄산염, Leibovitz (L-15) 문화 매체의 500 mL를 준비 하 고 그것은 10 mm NaHCO3 (단계 1.3.1), 4.5 m m 포도 당 (1.3.2), 단계 및 2mm 상용 글루타민 (1.3.3 단계) 보완. 290 mOsm/kg (1.3.4), 단계에 대 한 해결책을 조정 살 균 필터 그것 (1.3.5 단계), 페니실린 스 솔루션 (단계 1.3.6)의 2.5 mL을 추가. 참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에 적어도 4 주 동안.<ol>
<li>10 m m 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL 당 NaHCO3 의 420 mg을 추가 합니다.</li>
		<li>4.5 m m 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL 당 포도 당의 405 mg을 추가 합니다.</li>
		<li>2mm 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL에 글루타민 솔루션의 100 x 재고의 5 mL를 추가 합니다. 모든 용액 해산 때까지 휘저어.</li>
		<li>마 니 톨을 사용 하는 osmometer (단계 1.2.2에서에서 수행)와 290 mOsm/kg을 솔루션을 조정 합니다.</li>
		<li>0.2 µ m 필터를 사용 하 여 L-15 매체의 살 균 여과 수행 합니다.</li>
		<li>살 균 여과 후 페니실린의 50 U/mL 및 50 µ g/mL 스에 해당 하는 페니실린 스 솔루션의 2.5 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mL (0.1%) 트립 신 유형 II-S (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS에 녹아의 1 mg/mL를 사용 하 여 트립 신 솔루션의 준비. 살 균 플라스틱 튜브에 2ml의 aliquots를 만들고 사용까지-20 ° C에서 저장. 참고: Aliquots 2 mL의 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 3 개월 이상.</li>
	<li>1 mg/mL (0.1%) 트립 신 억제 물 유형 I-S의,를 사용 하 여 트립 신 억제제 솔루션 50 mL를 준비 하 고 (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS에서 해산 하는 DNase의 2 µ g/mL와 함께 그것을 보완. 살 균 플라스틱 튜브에 2ml의 aliquots를 만들고 사용까지-20 ° C에서 저장. 참고: Aliquots 2 mL의 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 3 개월 이상.</li>
</ol>2입니다. 장비 준비
<ol><li>셀 분리에 대 한 팁을 연마 하는 불에 의해 유리 펫을 준비 합니다. 2 다른 크기 범주와 팁을 확인 (0.6-0.8의 중간 오프닝 µ m 및 0.4-0.6의 작은 개통 µ m) 동시에 피펫으로 선회 하면서 시간과 거리는 불꽃에서 재생 하 여. 넣어 유리 펫 깨끗 한 유리 용기에 압력솥 (모드를 사용 하는 고체 105 ° C에서 45 분).</li>
	<li>얼음으로 폴리스 티 렌 상자를 준비 합니다.</li>
	<li>해 부 동안에 pituitaries를 전송 하 고 얼음에 유지 1.5 mL (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS의 플라스틱 튜브를 준비 합니다.</li>
	<li>(단계 1.2 준비) 수정된 dPBS의 10 mL 15 mL 튜브를 준비 하 고 셀 분리까지 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>신선한 준비 또는 트립 신, 트립 신 억제제 솔루션 (1.4와 1.5 단계에서 준비)의 aliquots를 해 동 하 고 사용까지 얼음에 그들을 유지.</li>
	<li>pituitaries의 화학 분리 하기 전에 원하는 온도 도달 물 수 있도록 해 부를 시작 하기 전에 26 ° C에 물 목욕을 설정 합니다.</li>
	<li>전에, 하는 동안, 그리고 물고기를 고정 해 부 및 정밀한 바늘 및 왁 스 격판덮개에 사용할 미세 집게를 포함 한 사용 후 70% 에탄올과 모든 해 부 도구를 청소 합니다. 깨끗 한 장갑을 사용 (변경 하 고 자주 청소) 셀의 잠재적인 오염을 방지 하는 전체 절차 동안.</li>
</ol>3. 뇌 해 부 및 세포 분리
<ol><li>얼음 비 자금 (0 ° C)에 그것을 immersing 하 여 물고기를 안락사. 돌이킬 수 없는 저체온증이 충격을 위해 적어도 1 분 동안 얼음 비 자금에서 물고기를 둡니다. 참고: 몇 초 후 동원 정지 및 평형 손실이 발생할 것입니다. 생선과 얼음 물에 완전히 빠져들은 거짓말을 하지 않습니다, 얼음 위에 후자는 질 식으로 이어질 것입니다 하 고 잠재적인 피부 화상을 신속 하 고 자비 롭 저체온증이 충격 대신 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>신속 하 게 그물에 물고기 해 부 현미경 아래 왁 스 격판덮개 전송 하 고 목을 통해 바늘 펀치 척추를 파괴.</li>
	<li>안정 해 부 하기 전에 머리 (뇌)의 뒤에 머리의 각 측에 (입)을 통해 전면에 한 바늘을 삽입 하 여 미세한 바늘을 사용 하 여 왁 스 격판덮개에 물고기의 머리 핀.</li>
	<li>해 부 현미경 아래 물고기 하 고 부드럽게 직각된 팁과 미세 집게를 사용 하 여 머리의 상단에 비늘을 긁어.</li>
	<li>신중 하 게 머리의 측면에서 피부 아래 좋은 집게의 각된 끝을 삽입 하 고 집게 포함 두개골 지붕에 확고 한 그립을 잡고 있는 동안 입의 방향에는 집게를 천천히 움직여서 두개골 지붕 제거.</li>
	<li>잘라 척수 완전히 직각된 팁과 집게를 사용 하 여. 참고: 시간 효율적으로 중요 한 요소, 그래서 작업 이다 고 정확 하 게 제한 시간을 보냈다는 pituitaries의 해 부에서 세포는 접시에 도금 될 때까지. 일부 연습 후 뇌 해 부 10 주위 에서만 있는 물고기, 당 약 2-3 분 소요 됩니다 s 두뇌는 이미 노출 될 경우는 뇌 하 수 체를 선택 하는 데 필요한.</li>
	<li>신중 하 게 노출 하는 뇌 하 수 체 고 스트레이트 팁으로 깨끗 한 겸으로 해 부 입으로 뇌를 플립. 플라스틱 튜브 1.5 mL 수정 dPBS를 포함 하는 뇌 하 수 체 전송 (자세한 단계 2.3 참조) 얼음에. 하는 뇌 하 수 체 튜브에 성공적으로 추가 되 고 아무것도 집게에 남아 현미경 집게의 끝을 확인 하십시오. 참고: 문화 요리 준비를 동시에는의 수에 따라 필요에 따라 많은 pituitaries를 해 부. 엄지손가락의 규칙으로 서 성인 생선 접시 (다운스트림 응용 프로그램에 따라 달라 집니다)는 세포의 적절 한 밀도를 당 적어도 10 pituitaries를 계산 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 pituitaries 아래로 회전 합니다. 조심 스럽게 dPBS 유리 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 모든 pituitaries를 제거 하지 않도록 주의.</li>
	<li>씻어는 pituitaries, 1-2 s, 탁상 원심 분리기에서 스핀 다운 trypsin 솔루션의 추가 1 mL을 추가 하기 전에 유리 피 펫을 사용 하 여 액체의 대부분을 제거 (단계 1.4에서에서 준비) trypsin 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>가령, 부드러운 떨고, 30 분, 26 ° C에서 물 욕조에 튜브를 품 어 또는 양자 택일로, 영화 튜브 몇 번 인큐베이션 기간 동안.</li>
	<li>실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 pituitaries 아래로 회전 시키십시오 그리고 모든 pituitaries 튜브의 하단에 위치 하 고 있는지 확인 하십시오. 유리 피 펫과 트립 신 솔루션의 대부분을 제거 하 고는 트립 신을 비활성화 하는 pituitaries 세척 트립 신 억제 물 솔루션 (1.5 단계에서 준비) 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 그들을 아래로 회전 하 여 튜브의 하단에 pituitaries를 수집 합니다. 유리 피 펫과 액체의 대부분을 제거 하 고 트립 신 억제 물 솔루션 (1.5 단계에서 준비) 1 mL를 추가 합니다. 부드러운 떨고, 가령 20 분 26 ° C에서 물 욕조에 튜브 또는 양자 택일로, 영화 튜브 몇 번 비활성화는 트립 신을 인큐베이션 기간 동안.</li>
	<li>L-15 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 도금 하기 전에 적당 한 온도 pH 도달할 수 있도록 1% CO2 와 26 ° C에 적어도 10 분 동안 품 어 하 여 중앙 유리 바닥 35 m m 폴 리 d lysine 코팅 셀 문화 접시를 준비 합니다. 참고: 플라스틱 셀 문화 접시 사용할 수도 있습니다. 중앙된 유리 바닥 접시를 사용 하 여의 주요 장점은 셀 도금은 지역 이다 더 작은, 따라서, 적은 뇌 세포는 접시 당 필요. 일부 다운스트림 응용 프로그램 또한 유리 하단 (즉, 일부 이미징 기법)을 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>기계적 분리를 시작 하기 전에 원하는 온도 도달할 수 있도록 4 ° C에 15 mL 튜브에 대 한 냉각 원심 분리기를 설정 합니다.</li>
	<li>수집 회전 하 여 튜브의 하단에 pituitaries 실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 (에서 단계 3.11) 트립 신 억제제 솔루션 튜브 및 모든 pituitaries 전에 튜브의 하단에 위치 해 있는지 확인 신중 하 게 유리 피 펫을 사용 하 여 트립 신 억제제 솔루션의 대부분을 제거 합니다. 참고: 다음의 모든 단계에서 층 류 벤치 (LAF) 프로토콜 셀의 오염을 피하기 위하여 셀 작업에 대 한 인증을 수행 합니다.</li>
	<li>뇌 조직 조각 (단계 2.4에서에서 준비) 얼음 수정된 dPBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 불 광택 유리 피 펫 (단계 2.1에서에서 준비)에서 (x 6-7) 위아래로 조직 조각을 빨 아. 참고: 온도 필수적인 측면, 그래서 4 ° c.에 모든 솔루션을 유지 이 시점에서 앞으로, 가능 하면 얼음에 모든 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 조직 조각을 아래로 회전 시키십시오 그리고 신중 하 게 얼음에 새로운 15 mL 튜브에 해리 셀 (거의 1 mL)을 포함 하는 dPBS의 위쪽 부분을 전송. 튜브의 바닥으로 피 펫 조직 조각 남아 있습니다 이동 하지 마십시오.</li>
	<li>단계 3.16-3.17 dPBS의 모든 10 mL 사용 될 때까지 한 번에 셀 차가운 dPBS의 1 mL에 해리를 반복 합니다. (추가 하는 dPBS의 마지막 3-4 mL)에 대 한 분리의 중소 열고 스위치를 끝으로 더 작은 개통을 가진 유리 피펫은와 유리 피 펫을 사용 하 여 시작 합니다. 여전히 표시 되는 경우 조직 조각 분리 프로시저의 끝으로 분리, 대 dPBS 2 마지막 단계 쪽으로 약 10 배를 pipetting 증가 하 고 마지막으로 잔여 조직 조각을 남겨두고. 부드럽게 셀 resuspend 그리고 거품의 표면에 셀 연결 셀 손상 발생할 수 있습니다으로 거품을 만들지 마십시오. 참고:이는 이 프로토콜의 중요 한 단계 이며 좋은 결과 달성 하기 위해 몇 가지 훈련이 필요 합니다.</li>
	<li>원심 분리기 (4 ° C에 냉각 된 사전)에 4 ° c.에서 10 분 동안 200 x g 에서 셀 아래로 회전 튜브를 균형 셀 펠 릿 것 튜브의 측면 표시 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>원심 분리기에서 튜브를 조심 스럽게 제거 하 고 부드럽게는 원심 분리 후 직접 유리 피 펫과 상쾌한 빈 15 mL 플라스틱 튜브에 전송. 상쾌한의 대부분을 제거 하지만 작은 (수시로 보이지 않는) 셀 펠 릿 손실 되지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 L-15 문화 매체의 50-100 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend. 참고:이 단계에서 가능 하다는 셀의 개수 및 생존 능력 테스트 (예: 셀 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 존재 계산), 하지만 주의 세포 현 탁 액의 일부를 사용 하 여이 목적에 대 한 수익률을 낮출 것 이다. 로 셀 접시의 센터 외부 확산의 위험을 증가 시킬 것 이다 큰 서 스 펜 션의 볼륨을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>조심 스럽게 L-15 매체 (준비 단계 3.13에서에서)의 2 개 mL를 포함 하는 셀 문화 접시 중간에 해리 셀 똑. 유리 바닥의 오목 부분 외부 확산 셀 것을 피하기 위해 인큐베이터에 그들을 이동 하기 전에 약 5 분 동안 접시의 바닥에 침 몰에 셀 수 있습니다.</li>
	<li>철저 하 게 침 몰 하 고 접시의 바닥에 연결을 모든 셀 수 있도록 26 ° C와 1% CO2 접시를 품 어.</li>
	<li>30 분 후 그들은 문화 접시에 첨부 되도록 현미경에서 세포를 봐.</li>
	<li>26 ° C와 1% CO2에서 셀을 품 어를 계속 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 변경의 대부분 (전부는 아니지만) 보통 3-4 일 마다. 참고: 셀을 방해 하 고 있도록 유리 바닥에서 분리 수 있습니다 매체를 더 자주 변경 하지 마십시오. 실험에 대 한 셀을 사용 하 여 그들을 뿌리기 후 1 주일 이내.</li>
</ol>

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<li>Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+volume+regulation+in+response+to+changes+in+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain volume regulation in response to changes in osmolality.</a> Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).</li>
</ol>

저자는 선언할 수 없다.

체 외에서 세포 배양 시스템 연구자 올바른 방법1에서 사용 하는 경우 다른 생물학 질문의 과다 한 답변에 대 한 강력한 도구를 제공 합니다. 그것은 그 해리 셀 인접 셀에 그들의 연결을 잃 었 수 있습니다 얻은 다른 기능 속성 보다 그들은 원래 에 비보를 기억 하는 것이 중요. 위험에 생체 외에서 실험에서 얻은 결과 잘못 해석 되 고 피하기 위해, 그것은 고려의 종 및 셀 형식에 기본 셀 문화 절차를 조정 하는 것이 중요. 심지어 중간 조정 표준 문화 절차와 사용 되는 솔루션의 뿌리깊은 특정 셀 형식의 문화 조건을 변경할 충분 한 많습니다.
이 프로토콜 최적화 된 조건을 준비 하 고 유지 하는 솔루션의 온도, osmolality, pH, 및 pCO2 사용을 매개 변수를 조정 하 여 달성 될 수 있는 성인 메 다카 pituitaries에서 1 차 셀 문화에 대 한 설명 이...

세포 배양 정상적인 세포질 생리학에서 마약 검사 및 발암1에 이르기까지 생물학 질문에 응답 하기 위한 우수한 모델 시스템을 제공 하는 분자 생물학 연구에 사용 되는 주요 도구 중 하나입니다. 1 차 셀, 효소 및 기계적인 방법을 사용 하 여 동물 조직에서 직접 분리는 종종 세포 보다 더 생물학적으로 관련 생물학 응답 vivo에서 상황에 가까이 있을 수 있습니다 간주 됩니다. 1 차 셀 문화를 준비 하기 위한 프로토콜 관심 있는 셀은 적응 하는 특성을 모방 하 고 생리 적으로 의미 있는 결과 얻을 각 종 및 세포 유형에 최적화 되어야 합니다.
물고기 세포에 대 한 기본 문화권 조건을 설명 하는 유사한 프로토콜에 비해 다소 부족 한 반면 수많은 프로토콜 포유류 세포 시스템에 대 한 문화 조건을 설명 합니다. 셀 온도, pH, 그리고 osmolality, 빠른 변화에 취약 하며 분리 절차 중 특히 취약 합니다. 상업적인 소금 솔루션 포유류 세포 배양에 사용 되는 문화 미디어 pH 버퍼 시스템 조건과 osmolality 특히 teleost 생선에 적합 하지 않습니다. 그것은, 그러므로, 측정 솔루션 관심의 종에서 이러한 매개 변수의 순수 관련 레벨을 조정 하는 것이 중요.
일반적인 잉어를 포함 하 여 여러 teleost 물고기 종에서 한 주 하 문화 (Cyprinus 카 르 피 오)2,3, 잔디 잉어 (Ctenopharyngodon idella)4, 금붕어 (auratus 떡 )5, 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)6, 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라)7, 틸 라 피아 (Oreochromis mossambicus)8, zebrafish (Danio rerio)9, 그리고 대서양 대구 (Gadus morhua)10. 관심의 종 부 화 온도 조정 외에도 이러한 프로토콜의 몇 가지가지고 인 큐베이 팅 관심, 습도 분위기에서 7.5 7.2에서 ph의 종 차선 수 있는 포유류-같은 조건에서 셀 포함 하는 3-5% CO2. 또한, 그것은 이러한 기본 세포 배양의 여러 준비에 사용 되는 솔루션의 osmolality 조정 된 경우에 불분명 하 고 다른 솔루션 사이의 안정적인.
현재 프로토콜 대서양 대구10 주 문화 이전 작업에 따라 고을 부 화 온도, osmolality, pH, 그리고 이산화탄소 (pCO2)의 부분 압력을 포함 하 여 pH 버퍼 시스템의 구성 메 다카 (O. latipes)의 생리학. 메 다카는 작은 (3-4 cm) 민물고기 이다, 동쪽 아시아. 이 요즘, 그것 사용 된다 세계의 많은 연구소에서 모델 종으로 그것은 상대적으로 쉽게 번 식 하 고 많은 일반적인 물고기 질병11저항력. 여러 이점이 있다 모델로, 4-40 ° C11, 짧은 생성 시간, 투명 한 태아, 성 결정 유전자12, 그리고 시퀀스 게놈13, 뿐만 아니라에서 많은 온도 허용 오차를 포함 하 여 메 다카를 사용 하 여 다른 사용 가능한 유전 자원입니다.
이 프로토콜의 기본 문화 조건 medakas 물고기 시설에서에 보관 되는 26 ° C의 온도 맞게 최적화 됩니다. 또한,는 osmolality 290 mOsm/kg 담 수에 살고 있는 메 다카를 소금물에 살고 있는 대서양 대구에서 320 mOsm/kg에서 감소 되 고 메 다카 플라즈마14의 정상적인 osmolality은. 비교에서는, 포유류 플라즈마의 전형적인 osmolality 275-295 mOsm15의 범위입니다. 다양 한 온도에서 살고 물고기 고 물고기 포유류에서 다른 혈액과 세포 외 액의 pH와 버퍼 용량을 만드는 물과 직접 접촉에 있는 아가미. 포유류 문화 미디어는 pH 약 7.4의 미디어는 37 ° c.에 습도 공기에 5% CO2 의 표준 분위기 equilibrated 때 발생 하는 버퍼 시스템에 일반적으로 포함 됩니다. PH는 온도 의존 및 감소 온도16(물)에 중립 pH 증가 대 한 값입니다. 전형적인 teleost 물고기 플라스마 pH 7.9177.7에서 배열 한다. 이 프로토콜의 최적화는 pH 7.85 pH 7.75 메 다카는 CO2 0.5%에서 1%로 증가 하 여 26 ° C에서 보관에 12 ° C에서 보관 하는 대구에서에서 감소를 포함.
또한, 중 탄산염 버퍼 용량 물고기와 포유류에서 매우 다르다. CO2 물고기에서 아가미를 통해 쉽게 교환 이며 물에 pCO2 폐18에서 pCO2 의 극히 일부에. 온도 또는 pCO2 변경 하는 것은 pH와 매체의 버퍼 변경 됩니다. 따라서, pH도 포유류 세포 배양에 대 한 권장 pCO2 물고기 셀에 최적 이며 따라서, 문화 미디어는 물고기에 대 한 순수 관련 값을 포함 하는 버퍼 시스템으로 최적화 되어야 합니다 그리고 특정 관심의 종입니다. 이 프로토콜 메 다카 pituitaries에서 1 차 셀 문화를 준비 하 고 조정 부 화 온도, osmolality, pH, 그리고 pH 버퍼 시스템의 1 차 셀을 준비할 때 고려해 야 할 다른 중요 한 매개 변수 외에 포함 하는 방법을 설명 합니다. 문화 비 포유류 종에서.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 염화칼슘 및 염화마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수(dPBS)</td><td>Sigma(Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D8537</td><td>1M NaOH로 용액을 pH 7.75, 만니톨로 290mOsm으로 조정합니다.</td></tr><tr><td>L-15 배지 (Leibovitz), L-글루타민</td><td>시그마 없음 (Merck, Damstadt, Germany)</td> <td>L5520</td><td>보충제 10 mM NaHCO3, 4.5 mM 포도당, 2 mM 글루타맥스가 함유된 500 ml 배양 배지. 만니톨을 사용하여 용액을 290mOsm으로 조정하고 0.2 &micro를 통해 용액을 필터링합니다. m PES 멸균 필터, 2.5mL 페니실린-스트렙토마이신 용액을 추가하기 전(자세한 내용은 아래 참조).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5881</td><td>1M 용액 방울을 떨어뜨려 dPBS의 pH를 증가시키고 배양 배지를 7.75로 증가시킵니다.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma(Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5761</td><td>10mM NaHCO3는 500mL 배양 배지당 420mg과 같습니다.</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>63565</td><td>dPBS 및 배양 배지의 삼투압을 증가시키는 데 사용합니다. 290mOsm의 삼투압에 도달하는 데 필요한 정확한 양을 계산합니다.</td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마 (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>G5400</td><td>4.5 mM&nbsp; D-포도당은 500mL 배양 배지당 405mg과 같습니다.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td><td>35050-061</td><td>L-글루타민의 대체품으로 안정성이 향상되었습니다. 2mM Glutamax는 500mL 배양 배지에서 100x 스톡 5ml와 같습니다.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마(Merck, Damstadt, Germany)</td><td>P0781</td><td>원액 10,000단위 페니실린 및 mL당 10mg 스트렙토마이신. 500mL L-15 배지(50 U/mL 페니실린 및 50 &마이크로와 동일)에 2.5mL의 원액을 사용합니다. g/mL 스트렙토마이신).</td></tr><tr><td>트립신 II-S</td><td>시그마(Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T7409</td><td>dPBS 용액에 1mg/mL를 준비합니다.</td></tr><tr><td>트립신 억제제 I-S</td><td>유형 시그마 (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T6522</td><td>dPBS 용액에 1 mg/mL를 준비하고 2 &micro를 보충합니다. g/ml Dnase I(아래 세부 정보 참조).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D5025</td><td>트립신 억제제 용액에 사용(위 참조).</td></tr><tr><td>0.2 & 마이크로; m 폴리에테르설폰(PES) 멸균 필터 시스템</td><td>Corning Inc.(Corning, NY)</td><td>431097</td><td>조정 후 dPBS 및 L-15 매체의 멸균 여과에 사용합니다.</td></tr><tr><td>유리 바닥, 폴리 d-라이신 코팅이 된 35mm 세포 배양 접시</td><td>MatTek Corporation(Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>, 다운스트림 응용 분야에 따라 플라스틱 접시로 교체할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>Dumont #5 세밀한 펜치</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11254-20</td><td>직선 팁</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 세밀한 펜치</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11253-25</td><td>각도 45&deg; 팁</td></tr><tr><td>스테레오 현미경 SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td><td></td>뇌<td>하수체 해부에 사용합니다.</td></tr><tr><td>Alegra X-22R Centrufuge</td><td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>냉각 옵션 포함 (현재 모델 XR-30과 유사).</td></tr><tr><td>수조</td><td>Techne(영국</td><td></td> 스태퍼드셔)<td>온도 조절이 가능한 모든 수조가 가능합니다.</td></tr><tr><td>파스퇴르 유리 피펫</td><td>VWR (NY)</td> <td>612-1701</td><td>외경 1.6 mm, 사용 전에 화재 광택 및 오토 클레이브.</td></tr><tr><td>Galaxy MiniStar 테이블 원심분리기</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>작은 테이블 원심분리기라면 무엇이든 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>가는 바늘/곤충 핀</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>26001-40</td><td>직경 0.03 mm. 대신 다른 가는 바늘을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>왁스 플레이트</td><td></td><td></td><td>큰 페트리 접시에 녹인 파라핀 왁스를 첨가하여 맞춤 제작.</td></tr></tbody></table>

물고기 pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

1 차 세포 배양 세포 속성 및 제어 된 환경에서 격리 된 셀의 메커니즘 연구 과학자 들에 의해 일반적으로 사용 되는 강력한 도구입니다. 포유류와 물고기 사이 생리에 광대 한 차이도 불구 하 고 물고기에서 기본 세포 문화 프로토콜 종종 기반으로 포유류 문화 조건, 자주만 약간 수정 합니다. 환경 차이는 체온 뿐만 아니라 혈 매개 osmolality, pH, 그리고 pH 버퍼 용량에 영향을. 셀 문화 미디어와 유사한 작업 솔루션 extracellular 액체 또는 혈액 혈 청에는 셀이 적응의 특성을 모방 의미는, 그것은 중요 이러한 매개 변수에 동물을 특별히 조정 됩니다.
현재 프로토콜 메 다카 (Oryzias latipes)에 대 한 최적화 된 기본 문화 조건을 설명합니다. 프로토콜과 격리 하 고 건강 한 유지 하는 방법에 자세한 내용은 1 주일 이상에 대 한 뇌 세포를 해리 하 여 제공 하는 다음 단계가 포함 됩니다: 1. 값 osmolality 조정 메 다카 혈액 플라스마, 2에서에서 발견.의 조정에 부 화 온도 정상 메 다카 온도를 (여기 수족관 시설에서), 3. 비슷한 온도에서 사는 다른 어 종에 비해 값을 pH와 중 탄산염 버퍼의 조정. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 결과 메 다카에 대 한 생리 적으로 의미 있는 결과 홍보 하 고 다른 비 포유류 종에서 1 차 셀 문화를 만드는 과학자 참조 가이드로 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜 메 다카 pituitaries에서 기본 세포 배양의 준비를 설명 하 고 최소한 1 주일에 대 한 문화에서 유지 될 수 있는 건강 한 세포를 제공 한다. 프로토콜 메 다카14 생리 관련 값을 기반으로 하며 또한 성인 물고기는 도금을 수확 하는 조직에서 전체 절차 동안 7.75의 pH 및 290 mOsm/kg의 osmolality를 사용 하 여 뇌 조직에 최적화 된 (그림 1 및 그림 2) 문화에 셀.
이 프로토콜에 의해 생성 하는 기본 세포 배양 실험에서 대표적인 결과 그림 3, 그림 4및 <stro...

여기 우리가 준비 하 고 유지 하는 메 다카 (Oryzias latipes)에서 기본 뇌 세포 배양 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 최적화 된 조건을 고려 온도, osmolality, pH 등의 중요 한 매개 변수 흉내 낸 함으로써 생리 적으로 더 의미 있는 결과 물고기의 생리 적 조건에 의해.

물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

이 방법은 뇌하수체 세포가 통제된 환경에서 어떻게 기능하고 상호 작용하는지에 관한 내분비학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 메다카에 생리학적으로 의미 있는 결과를 촉진하고 다른 종의 1차 세포 배양을 위한 참조 가이드를 제공한다는 것입니다. 먼저 메다카의 머리를 왁스 플레이트에 고정하고 입에 가는 바늘 하나를 삽입하고 뇌 뒤쪽 머리 양쪽에 하나씩 삽입합니다.물고기를 해부 현미경 아래에 놓고 끝이 각진 미세한 집게를 사용하여 머리 꼭대기에서 비늘을 부드럽게 긁어냅니다. 머리 옆 피부 아래에 집게를 조심스럽게 삽입하고 집게를 입 쪽으로 천천히 움직여 두개골 지붕을 제거합니다. 겸자로 척수를 완전히 잘라내고 뇌를 입 쪽으로 조심스럽게 뒤집어 뇌하수체를 노출시킵니다.얼음 위에 1.5ml의 변형된 DPBS가 들어 있는 플라스틱 튜브에 끝이 곧은 깨끗한 집게로 글랜드를 수확합니다. 뇌하수체를 모두 채취한 후 실온에서 1-2초 동안 마이크로 원심분리기로 조직을 회전시키고 유리 피펫을 사용하여 뇌하수체 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 DPBS를 조심스럽게 제거합니다. 마이크로 원심분리기에서 1-2초 동안 1ml의 트립신 용액으로 조직을 세척하고 유리 피펫을 사용하여 대부분의 상층액을 흡인합니다.트립신이 모두 제거되면 샘플에 트립신을 1ml씩 더 넣고 섭씨 26도의 수조에서 30분 동안 가끔 부드럽게 튕기면서 조직을 배양합니다. 배양이 끝나면 뇌하수체를 1-2초 동안 원심분리하고 유리 피펫을 사용하여 조직을 방해하지 않고 대부분의 트립신을 제거합니다. 그런 다음 1ml의 트립신 억제제 용액으로 샘플을 세척하여 트립신과 원심분리기를 1-2초 동안 비활성화합니다.상등액을 제거한 후 튜브에 트립신 억제제 용액을 1ml더 넣고 섭씨 26도의 수조에서 20분 동안 플릭으로 샘플을 배양합니다. 조직이 배양하는 동안 중앙 유리 바닥이 있는 35mm 폴리-D-라이신 코딩 세포 배양 접시에 2ml의 L-15 배지를 추가하고 플레이트를 섭씨 26도, 1% 이산화탄소에서 최소 10분 동안 평형을 이룹니다. 배양이 끝나면 뇌하수체를 1-2초 동안 원심분리하고 튜브에서 모든 트립신 억제 용액을 조심스럽게 흡인합니다.층류 후드에서 뇌하수체 조직 조각에 1ml의 얼음처럼 차가운 변형 DPBS를 추가하고 화염 광택 유리 피펫을 사용하여 기포가 생기지 않도록 주의하면서 얼음 위에서 조직을 6-7회 부드럽게 분쇄합니다. 1-2초 동안 다시 원심분리한 후, DPBS의 상층을 포함하는 해리된 세포 약 1ml를 얼음 위의 새로운 15ml 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 중간 크기의 구멍이 있는 피펫 팁에서 시작하여 마지막 3-4밀리리터의 DPBS를 위해 더 작은 구멍이 있는 피펫 팁으로 전환할 때까지 10ml의 DPBS가 모두 사용될 때까지 trituration 및 disharated cell collection을 9회 더 반복합니다.유리 피펫을 사용한 기계적 해리는 이 프로토콜의 중요한 단계이며 좋은 결과를 얻기 위해서는 몇 가지 교육이 필요합니다. 깨지기 쉬운 해리된 세포가 손상되지 않도록 세포 용액을 부드럽게 피펫팅합니다. 10번째 분쇄 후 펠릿이 있을 각 튜브의 측면을 표시하고 예냉각된 원심분리기에서 샘플을 회전시킵니다.원심분리가 끝나면 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 유리 피펫을 사용하여 상등액을 즉각적이지만 부드럽게 플라스틱 15ml 튜브에 옮기고 작고 자주 보이지 않는 펠릿을 방해하지 않고 대부분의 상등액을 제거한 다음 펠릿을 50-100마이크로리터의 L-15 배양 배지에 조심스럽게 재현탁합니다. 해리된 세포를 미리 준비된 세포 배양 접시의 중간에 조심스럽게 떨어뜨리고 세포가 접시 바닥으로 가라앉도록 약 5분 동안 시킨 후 접시를 인큐베이터로 옮겨 세포가 유리 바닥의 움푹 들어간 부분 외부로 퍼지지 않도록 합니다. 섭씨 26도, 이산화탄소 1%에서 30분 후 광학 현미경으로 세포를 확인하여 접시 바닥에 부착되었는지 확인하고 해리된 뇌하수체 세포 배양액을 7일 이상 인큐베이터에 반환하지 않습니다.약 10 개의 성인 medaka pituitaries를 수확하는 것은 보통 파종 후에 접시 당 약 50, 000에서 100, 000의 세포의 조밀도를 귀착됩니다. 죽어가는 세포의 수는 시간이 지남에 따라 거의 일정하며, 세포의 95% 이상이 하루 후에 생존할 수 있고 90% 이상이 3일 후에도 여전히 살아 있으며, 배양 1주일 동안 생존율이 약간 감소하는 것이 관찰됩니다. 황체형성 호르몬 생식선 세포를 발현하는 GFP의 전기생리학적 기록은 해리된 뇌하수체 세포가 배양에서 4일 후에 자발적으로 활동 전위를 발사할 수 있음을 보여줍니다.또한, 성선 자극 호르몬 방출 호르몬의 자극에 따라, 세포막의 초기 일시적인 과분극 현상이 뒤따르고, 이는 탈분극 및 활동 전위의 지속 시간 증가와 수반되는 발사 빈도의 급격한 증가가 뒤따릅니다. 이 절차를 시도하는 동안 뇌하수체 세포를 건강한 상태로 유지하기 위해 정확하고 효율적인 방식으로 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 qPCR 또는 고급 이미징 기술과 같은 다른 방법을 수행하여 특정 치료법이 뇌하수체 세포 생리학을 어떻게 변화시킬 수 있는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 제브라피시 배아에서 일차 망막 신경절 세포를 배양하는 방법을 보여줍니다. 초기 단계의 배아는 눈을 분리하기 위해 해부를 거치고, 그 후 기계적으로 해리되어 망막 신경절 세포의 현탁액으로 만들어집니다. 이 세포 현탁액은 축삭돌기 발달을 촉진하기 위해 접착 단백질로 코팅된 커버슬립에서 배양됩니다.

제브라피시 배아(zebrafish embryos)에서 일차 망막 신경절 세포 배양 생성

체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규제 메커니즘의 식별 가능 척추 동물의 계통.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

우리는 귀 및 쥐의 꼬리에서 일차 섬유 아세포를 생성하기위한 간단하고 신속한 실험 절차를 설명한다. 절차는 특별한 동물 훈련을 필요로하지 않고, 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 배양 섬유 아세포의 생성을 위해 사용될 수있다.

마우스 귀와 꼬리 조직에서 생성 차 섬유 아세포 배양

알긴산 비드의 3차원 배양은 단순성과 재현성으로 인해 뇌하수체 선종 세포를 유지하기 위해 선택되었습니다. 이 절차에는 초기 효소 분해 및 종양 조직의 기계적 해리가 포함되었으며, 후속 세포 현탁액은 알긴산 비드로 캡슐화되었습니다.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

설명 하는 최적화 된 프로토콜을 electrophysiological 녹음으로 패치 클램프 기술을 사용 하 여 뇌 세포의 뒤에 가능한 뇌-뇌 하 수 체 조직을 조각, teleost 물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 만들기는 구멍이 패치 구성입니다.

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

선물이 zebrafish 태아 transfection 라이브 셀 이미징 뿐만 아니라 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀을 준비 하는 프로토콜의 기본 셀 문화를 준비 하기 위한 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

이 프로토콜은 출생 후 생쥐 또는 쥐의 신 피 질 및 해 마 로부터 형광 GABAergic 또는 glutamatergic 뉴런의 정제 및 배양을 위한 세포 선별 방법을 설명 한다.

형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

여기서, 시험 관 내에서 일차 돼지 망막 색소 상피세포를 배양하는 방법을 제시한다.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

여기에서 우리는 단일 세포 시퀀싱을 위한 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 준비를 보여줍니다.

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

학습하세요 Oryzias latipes 뇌하수체 원세포 배양법으로 온도, 삼투압, pH를 최적화하여 생리학적 환경을 모사합니다. 이 방법은 세포 생존율 90% 이상을 유지하며 호르몬 반응 및 전기생리학적 활성 분석이 가능합니다.

물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

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