Name: 파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 배우세요 개 난소 조직에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하고 배양하여 분화시키는 방법을. 이 기법은 재생 의학 및 수의학 연구에 활용될 수 있는 신뢰할 수 있는 줄기 세포 공급원을 제공합니다.

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저자는 친절 하 게 제공 하는 난소 UNESP FCAV의 개 살 균 프로그램을 인정 합니다. 이 작품은 FAPESP (프로세스 번호 2013/14293-0)와 망 토에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

이 실험은 4 개의 잡종 여성 개 개 살 균 프로그램에 선택 수술 후 기증의 난소와 함께 수행 되었다. 이 실험은 UNESP-FCAV (프로토콜 번호 026991/13)의 동물의 사용에 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험 준비
<ol><li>준비 하거나 메 마른 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 칼슘 또는 마그네슘의 500 mL를 구매 합니다.</li>
	<li>준비는 콜라 나 DPBS의 1 mL에 효소의 40 µ g을 혼합 하 여 솔루션을 재고. 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 하 고 저장 2 mL aliquots-20 ° c.에</li>
	<li>항생제의 1%와 10% 태아 혈 청 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 낮은 혈당에서 배양을 준비 합니다.</li>
	<li>살 균 자료 수집:가 위, 집게, 조직 배양 플라스 크, 요리, 튜브, 그리고 5 mL와 10 mL 펫.</li>
	<li>표준 셀 문화 실험실 장비를 사용 하 여: 생물 안전 캐비닛 (BSC), 5% CO2 와 38 ° C 원심 분리기에서 설정 셀 문화 인큐베이터.</li>
	<li>BSC를 청소: 70% 소독 장갑 낀 손으로 EtOH, UV 빛을 사용 하 여.</li>
</ol>2. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분리
<ol><li>수술 후, 실험실에서 그들의 도착까지 난소 원뿔 튜브에 얼음에 PBS에 계속.</li>
	<li>PBS의 10 mL로 두 100 mm 페 트리 접시를 채우십시오.</li>
	<li>튜브에서 난소를 제거 하 고 PBS 가진 첫 번째 페 트리 접시에 그들을 전송. 움직임을 혼합 함께 그들을 씻어.</li>
	<li>부드럽게 난소를 검색 하 고 다른 접시에 놓습니다. 멸 균 핀셋과가 위, 아주 작은 조각, 약 1 m m 크기에서에 조직을 말하다.</li>
	<li>난소 조직 35 mm 페 트리 접시에 전송 하 고 콜라의 2 개 mL를 추가. 좀 더 조직을 말하다.</li>
	<li>3 h는 38 ° C에 인큐베이터에서 배양 접시를 놓고 부드럽게 원형 움직임 마다 20 분 페 트리 접시를 흔들.</li>
	<li>3 h 후 인큐베이터에서 배양 접시를 제거 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 접시의 내용을 전송 합니다. 확장 미디어의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 원심 분리 전에 튜브 반전. 원심에서 2100 x g 7 분 제거 튜브는 상쾌한 고 확장 미디어의 3 mL와 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>T25 병에 펠 릿을 전송 합니다. 5%와 인큐베이터에 병을 배치 3 h 38 ° C에서 CO2 . 참고: 프로시저의 가장 중요 한 부분은 외피의 3 h 후 미디어를 변경 하는.</li>
	<li>인큐베이터에서 병을 제거 하 고 나머지 조직으로 미디어를 제거 합니다. 병에 신선한 확장 미디어의 3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>미디어 모든 48 h 변경 하 고 관찰 셀룰러 합류에 대 한 병. 참고: 절차의 주요 단계는 그림 1에서 볼 수 있습니다.</li>
</ol>3. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 확장
<ol><li>
셀 통로
	<ol>
<li>셀 합류에 도달, 병에서 미디어를 제거 합니다.</li>
		<li>PBS의 3 mL 병을 씻어. PBS를 제거 합니다.</li>
		<li>트립 신 고 3 분에 38 ° C에 인큐베이터에서 병 부드럽게 탭 분리를 셀 수 있도록 병의 1.5 mL를 추가 합니다. 참고: 셀 합류 약 5-7 d 초기 도금 후에 도달 한다.</li>
		<li>확장 미디어의 3 mL를 추가 하 고 내용을 원뿔 튜브에 전송.</li>
		<li>원심에서 2100 x g 7 분 제거 튜브는 상쾌한 고 확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>부드럽게 튜브의 내용을 균질.</li>
		<li>세 고 인큐베이터에 다시 세포와 함께 튜브를 넣어 셀을 수행 하기 위해 샘플의 10 µ L의 약 수를 가져가 라.</li>
		<li>hemocytometer로 믹스의 장소 10 µ L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 계산
	<ol>
<li>현미경의 10 X 목표를 사용 하 고는 hemocytometer의 눈금선에 초점.</li>
		<li>5 개의 작은 사각형 (그림 2)에 있는 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>50, 000 밀리 리터 당 셀의 수를 추정 하 여 계산된 수를 곱하면.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분화
참고: 차별화 분석 힐 외 에 설치 하는 지침에 따라 수행 했다 9.
<ol><li>잘, 3 중, 4 잘 문화 접시를 사용 하 여 당 씨 1.0 x 104 셀.</li>
	<li>확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 원형 움직임으로 접시를 교 반 하십시오.</li>
	<li>24 시간 후 문화 미디어를 바람직한 차별화 미디어 바꿉니다.</li>
	<li>대 한 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 분화, 품 어 30 d 유도 미디어 셀, 미디어 교체와 함께 모든 3 디 특정 차별화 키트가 분석이 실험의 각을 위해 사용 되었다.</li>
	<li>Neurogenic 혈통 차별화 유도 미디어 미디어 교체 매 3 d와 함께 10 일에 대 한 셀을 품 어. 여기에서 사용 하는 미디어 DMEM 낮은 포도 당, 2 mM valproic 산, 1 µ M 날린, 10 µ M 산림, 염화 칼륨 5 m m, 5 µ g/mL 인슐린, 그리고 200 µ M 자 hydroxyanisole 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>Endoderm 선구자, 5 d 시 약 제조업체의 지침에 따라 endoderm 미디어에서 품 어.</li>
	<li>원시 생식 세포 계보 차별화 유도 미디어 미디어 교체 매 3 d와 14 d 셀을 품 어. 여기에서 사용 하는 미디어 포함 된 DMEM, 10 %FBS, 1mm 나트륨 pyruvate, 10 ng/mL LIF, 1mm 불필요 한 아미노산, 2 m L-글루타민 m, 5 µ g/mL 인슐린, 0.1 m m β-mercaptoethanol, 60 µ M putrescine, 20 µ g/mL 올려진다, 10 ng/mL 마우스 표 피 성장 인자, 인간의 1 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 40 ng/mL 인 glial 세포 선 파생 된 neurotrophic 요인, 및 15 mg/L 페니실린.</li>
</ol>

<ol><li>Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGazit%2C+Z+%22Handbook+of+Stem+Cells+%282nd+Edition%29%22">Handbook of Stem Cells (2nd Edition)</a>. Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 증거 MSCs ovariectomy 후 생물 학적 폐기물 이라고 여겨진다 개 난소 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다 제공 합니다. 사실은 많은 세포 유형 난소에서 찾을 수 있습니다, 우리 구와 같은 형태와 단층에서 성장 하는 셀을 성공적으로 선택, 플라스틱에 그들의 급속 한 준수에 따라 MSCs를 선택 하는 프로토콜을 제안 했다.
골 수에서 MSCs의 파생의 첫 번째 보고서는 문화11;의 첫 번째 48 h 동안 MSCs의 플라스틱 접착 용량에 따라 그러나,이 방법은 이종 인구 phenotypically 및 분리 기능, 적어도 골12에 대 한 잠재력을가지고 보고 되었습니다. 제안 된 문화 메서드는 또한 플라스틱 접착 용량으로 셀을 선택 하 고 있는 바람직한 셀 정렬의 필요성 없이 많은 세포 유형, 조직에서 중간 엽 세포를 분리. 사실은 세포 접착8...

줄기 세포에 초점 년간 과거, 강력한 재생 의학 치료 발견의 집단 목표에 의해 연료 되었습니다 연구 노력을 실질적으로 증가 했다 출판된 연구의 수입니다. 줄기 세포는 두 개의 기본 정의 마커: 자기 혁신과 차별화. 중간 엽 줄기 세포 정기 조직 회전율에 대 한 책임은 고1배아 줄기 세포 비해 분화의 보다 제한 된 용량을가지고. 최근에, 많은 연구 다양 한 MSCs의 그리고 논의 중인 주제는 배아 및 성체 줄기 세포 간의 차이점 모든2에 존재 하는 여부.
Ovarium 표면 상피는 커밋되지 않은 세포의 층, 상대적으로 덜 분화, 두 상피와 중간 엽 마커3, 유지 하는 다른 종류의 세포에 대 한 응답에서으로 분화 하는 능력을 표현 하는 환경 신호4. 줄기 세포는 난소에서의 정확한 위치는 잘 알려진; 그러나, 그것은 bipotential 창시자 tunica albuginea에서 생식 세포5일으키 제안 되었습니다. 이러한 셀 stromal 기원6 또는에 있는 또는 난소 표면7에 인접 면역학 연구 가설 있다. 이후 중간 엽 줄기 세포 세포 접착8에 중요 한 역할을 재생 하는 수많은 수용 체를 표현, 실험 가설을 급속 한 접착을 가진 세포의 인구를 선택 하면 명확 하 게 세포의 인구를 분리 하는 것을 테스트 하도록 설계 되었습니다. 실제로 엽으로 characterizable. 최근, 우리의 그룹 문화의 첫 번째 3 h 문화 접시의 플라스틱 표면에 접착의 급속 한 접착9전시 세포의 순화 된 인구를 얻기 위하여 그들의 용량에 따라 난소 조직에서 MSCs의 파생을 했다. 여기는 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포 분리를 위한 개발된 방법에 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>디피에스&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>조직 플라스크</td><td>Corning</td><td>CLS3056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 저당</td><td>Thermo Fisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>12484-010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>StemPro 지방형성 분화 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1007001</td><td></td></tr><tr><td>StemPro 연골형성 분화 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1007101</td><td></td></tr><tr><td>StemPro 골형성 분화 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1007201</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Definitive Endoderm Kit</td><td>StemCell</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 2035S</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 2411GA</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1036G</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1041</td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Milipore</td><td>MAB353</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Tubulin&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>DDX4</td><td>Invitrogen</td><td>PA5 -23378</td><td></td></tr><tr><td>IgG- FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR80F</td><td></td></tr><tr><td>IgG- FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR120F</td><td></td></tr></tbody></table>

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)에 대 한 관심은 절연, 확장, 및 문화의 그들의 용이성으로 인해 지난 10 년간 증가 했다. 최근에, 연구는 이러한 세포 넓은 차별화 용량을 증명 하고있다. MSCs에서 풍부 하 고 생물학 낭비로 ovariectomy 수술 후 자주 취소 됩니다는 사실 때문 난소 세포 기반 치료를 위한 유망한 후보자를 나타냅니다. 이 문서에서는 격리, 확장에 대 한 절차를 설명 합니다 및 MSCs의 세포 분류의 필요성 없이 개 난소에서 파생 된 기술. 이 프로토콜은 임상 시험에서이 매우 구별할 세포의 광범위 한 적용으로 인해 재생 의학에 대 한 중요 한 도구 나타내고 치료 사용.

송곳 니 난소에서 중간 엽 줄기 세포 분리:
난소 MSC 격리 절차는 그림 1에 요약 됩니다. 수술, 조직 닦지, 콜라 소화, 그리고 미디어 변화는 문화의 시작 후 3 h, 후 빠른 플라스틱 접착제 속성 상 상속 MSC 인구는 성공적으로 개 난소 조직 으로부터 격리. 빠르게 수확된 셀 문화 접시의 플라스틱 표면에 준수 하 고 전형적인 MSC와 같은 형태 (그림 3)과 형태학 상으로 균질 단층 문화로 성장 했다.
난소 MSC의 특성</...

여기, 우리가 격리, 확장, 및 개 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포의 분화 하는 방법을 설명합니다.

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

이 절차의 전반적인 목표는 개 난소 조직에서 파생 된 중간 엽 줄기를 분리, 확장 및 차별화하는 것입니다. 이 실험은 개 살균 프로그램에서 선택 수술 후 기증 된 4 개의 mongrel 암컷 개난소와 함께 수행되었습니다. 이 실험은 상파울루 주립 대학, FVAC의 동물의 사용에 윤리위원회에 의해 승인되었다.대표적인 결과. 토론.결론.

derivation-differentiation-canine-ovarian-mesenchymal-stem

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

자기 갱신과 신체의 모든 세포 유형으로 차별화하는 인간 배아 줄기 세포의 능력은 그들이 모두 의료 어플 리케이션을위한 개발과 질병의 근본적인 질문을 해결하기위한 연구 도구로 큰 약속을 개최하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 내부 세포 질량 immunosurgical 절연에 의해 배아에서 인간 배아 줄기 세포의 유도에 대한 간결한, 단계별 절차를 제공합니다.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

우리는 작은 분자 기반 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)에 마우스 배아 줄기 세포의 차별 화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 차별화 후 30 일에 의해 고효율 Olig2 + NG2 + OPCs를 생성합니다. 우리는 또한 행동 잠재력을 불 수있다 "급상승"OPCs를 생성하는 방법을 설명합니다.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

최근 몇 년 동안 체외 배양 방법에서 사용하는 생식 세포의 형성은 체세포 줄기 세포의 여러 가지 유형을 사용하여 증명되었습니다. 이 문서에서는 시각적으로 초기 난 모세포 - 유사 세포로 신생아 마우스 유래 줄기 세포의 분화를 발표 할 예정이다.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

시험관 분야 분석법은 암 줄기세포를 식별하는 데 일반적으로 사용됩니다. 여기에서는 단일 분석과 다중 세포 기반 구체 분석을 비교합니다. 더 힘든 단일 세포 기반 분석 또는 메틸셀룰로오스 보충제는 더 정확한 결과를 제공하는 반면, 액체 배지에서 수행되는 다중 세포 기반 분석은 세포 밀도의 영향을 크게 받을 수 있습니다.

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수에서 얻어지며 확장 배양이 필요합니다. 시료가 처리 전에 응고되면 (효소) 혈전용해제인 우로키나아제(urokinase)를 사용하는 프로토콜을 적용하여 혈전을 분해할 수 있습니다. 따라서 세포가 방출되어 확장 배양에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 리샘플링에 대한 빠르고 저렴한 대안을 제공합니다.

효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

이 프로토콜은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 인간 파골세포의 분화를 제시하고 파골세포 및 파골세포 전구체의 특성 분석 방법을 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

배우세요 개 난소 조직에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하고 배양하여 분화시키는 방법을. 이 기법은 재생 의학 및 수의학 연구에 활용될 수 있는 신뢰할 수 있는 줄기 세포 공급원을 제공합니다.

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

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