공장 수용 성 단백질과 소화 탄수화물 콘텐츠를 사용 하 여 옥수수 (지 시 메이 스)를 표본으로 측정

이 방법을 통해 식물 과학 및 영양 생태학 분야의 연구원들은 식물 조직의 용해성 단백질과 소화 가능한 탄수화물의 농도를 정확하게 측정할 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 이 두 가지 매우 중요한 다량 영양소를 높은 정확도로 정량화할 수 있는 빠르고 쉬운 방법을 제공한다는 것입니다. 이러한 기술은 식물 단백질과 탄수화물이 육상 먹이 그물의 기초를 구성하기 때문에 생태학 분야에 강력한 영향을 미칩니다.

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 범용 실험실에서 일반적으로 수행되지 않는 몇 가지 단계와 일부 기술이 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 시작하려면 각 조직의 복제 샘플을 라벨이 붙은 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 다음으로 각 샘플의 정확한 질량을 기록합니다.

마이크로피펫터를 사용하여 각 튜브에 0.1몰 수산화나트륨 500마이크로리터를 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 튜브를 30분 동안 음파 가열합니다. 그런 다음 튜브를 예열된 온수 욕조에 15분 동안 넣습니다.

그 후에, 15, 10 분 동안 000 G에 관을 분리기. 각 샘플에 대해 새 피펫 팁을 사용하여 표지된 새 마이크로 원심분리 튜브에 상층액을 피펫으로 주입합니다. 펠릿에 300마이크로리터의 0.1몰 수산화나트륨을 추가하고 10분 동안 원심분리를 반복합니다.

그 후, 상층액을 제거하고 첫 번째 원심분리에서 상등액을 포함하는 튜브로 옮깁니다. 상등액의 pH를 중화하려면 11 마이크로 리터의 5.8 몰 염산을 첨가하십시오. 리트머스 종이를 사용하여 pH가 약 7인지 확인합니다.

다음으로, 각 튜브에 90마이크로리터의 100% 트리클로로아세트산을 추가합니다. 그런 다음 얼음 위에서 튜브를 30분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 13, 000G에서 샘플을 원심분리합니다.

진공 라인과 유리 마이크로피펫 팁을 조심스럽게 사용하여 트리클로로아세트산을 제거합니다. 흡입 팁으로 펠릿을 방해하지 않도록 각별히 주의하십시오. 다음으로, 100마이크로리터의 아세톤으로 펠릿을 세척하고 섭씨 20도로 냉각한 다음 아세톤이 흄 후드에서 증발하도록 합니다.

단백질 펠릿을 수산화나트륨 1ml로 녹입니다. 추가 가열, 소용돌이 및 음파 가열이 필요할 수 있습니다. 각 IGG 표준 용액 160마이크로리터를 A1 위치부터 시작하여 96웰 플레이트에 3회 추가합니다.다음으로, 새로운 1.5ml 튜브에서 각 샘플 용액 50마이크로리터를 증류수 950마이크로리터에 추가합니다.

그런 다음 희석된 각 시료를 H1 위치부터 시작하여 60마이크로리터의 시료를 웰 플레이트에 30마이크로리터씩 추가합니다. 100마이크로리터의 증류수를 모든 빈 샘플과 알 수 없는 샘플 웰에 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트의 각 웰에 40마이크로리터의 Coomassie Brilliant Blue G-250 단백질 염료를 추가합니다.

바늘을 사용하여 우물에있는 거품을 터뜨립니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 595나노미터에서 각 웰의 흡광도 값을 기록합니다.

먼저, 각 조직 샘플의 복제물을 유리 15ml 튜브로 계량합니다. 튜브에 라벨을 붙이고 각 샘플의 정확한 질량을 기록합니다. 다음으로 각 튜브에 0.1몰 황산 1ml를 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다.

그런 다음 튜브를 끓는 물에 1시간 동안 넣습니다. 튜브를 미지근한 수조로 옮겨 식힙니다. 그런 다음 튜브의 내용물을 라벨이 붙은 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 붓습니다.

이 분리기 관 후에 15, 10 분 동안 000 G. 마이크로 피펫을 사용하여 상등액을 새로 라벨링된 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 15마이크로리터의 미지 시료를 자체 시험관으로 이송합니다.

그런 다음 각 튜브에 385마이크로리터의 증류수를 추가합니다. 흄 후드에서 400마이크로리터의 5%페놀을 각 표준 및 미지 샘플 시험관에 추가합니다. 그 직후 각 튜브에 2ml의 황산을 첨가하십시오.

용액 표면에 황산을 첨가하십시오. 튜브를 10분 동안 배양한 후 튜브를 소용돌이칩니다. 그런 다음 튜브를 추가로 30분 동안 배양합니다.

각 시료 튜브에서 800마이크로리터를 폴리스티렌 1.5ml 세미 마이크로큐벳 3개로 옮깁니다. 그런 다음 분광 광도계를 490나노미터에서 읽도록 설정하고 빈 큐벳으로 보정합니다. 마지막으로 분광 광도계를 통해 각 큐벳을 실행하고 흡수도를 기록합니다.

이 프로토콜을 사용하여 3개의 지리적 지역에서 온 4개의 서로 다른 밭 및 옥수수 조직의 용해성 단백질과 소화 가능한 탄수화물 함량을 분석했습니다. 지역 간에 용해성 단백질 함량의 상당한 차이가 관찰되었기 때문에 각 영역에 대한 별도의 분석이 필요했습니다. 지역에 따라 조직 간의 수용성 단백질과 소화 가능한 탄수화물 함량에 몇 가지 차이가 있었습니다.

미네소타에서는 조직의 수용성 단백질 함량만 다양했던 반면, 노스캐롤라이나의 조직은 수용성 단백질과 소화성 탄수화물 모두에서 다양했습니다. 텍사스에서 조직 다량 영양소 함량의 변동성은 다양성에 따라 달랐습니다. 이 기술을 통해 식물 과학 및 영양 생태학 분야의 연구자들은 원소 측정에서 외삽하는 대신 용해성 식물 단백질과 소화 가능한 탄수화물을 정확하게 측정할 수 있습니다.

액체 질소, 농축 산 및 염기로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 이러한 화학 물질로 작업할 때마다 항상 장갑, 보안경, 앞치마 및 발가락이 막힌 신발과 같은 예방 조치를 사용하십시오.