Name: 공장 수용 성 단백질과 소화 탄수화물 콘텐츠를 사용 하 여 옥수수 (지 시 메이 스)를 표본으로 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 옥수수 조직에서 가용성 단백질과 소화 가능한 탄수화물을 정확하게 측정하는 방법을. 이 기술은 식물 생리학 및 생태학 연구에서 중요한 영양소 분석에 활용됩니다.

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달콤한 옥수수 필드 컬렉션 도움을 우리의 공동 작업자의 모든 감사 러 벅, 텍사스의 도미 닉 Reisig와 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 댄 모트와 텍사스 A & M 대학에서 팻 포터를 포함 합니다. 감사 피오나 Clissold 프로토콜을 최적화 하 고 제공 하는이 원고를 편집. 이 작품 텍사스 A에 의해 부분적으로 지원 되었다 & M C. Everette Salyer 친목 (곤충학과)과 생명 공학 위험 평가 그랜트 프로그램 경쟁 미국 농 무부에서 no. 2015-33522-24099 부여 (가스에 게 수 여 하 고 STB)입니다.

1. 식물 수집 및 처리
<ol><li>수집 및 공장 샘플 처리<ol>
<li>식물 샘플 수집 후 플래시 동결 샘플 집게와 저장소-80 ° c.에 액체 질소로 공장 설비 재료를 찍기로 식물 샘플을 수집 하는 경우는 너무 커서 플래시 동결, 신속 하 게 최대한 빨리 드라이 아이스 및 전송-80 ° C 냉장고를 사용 하는 샘플을 냉각. 식물 재료의 다량 영양소 콘텐츠 컬렉션 후 즉시 공장 샘플을 동결 하는 것이 중요 하다 그래서 조직 공장에서 분리 된 후 변경할 수 있습니다. 주의: 액체 질소는 피부 접촉 시 심한 동상을 발생할 수 있습니다. 승인 된 용기에 액체 질소를 수송 하는 곳을 알아내는-장갑, 아이 구글, 얼굴 방패, 앞치마, 그리고 실험실 외 투를 포함 하 여, 처리 하는 동안 적절 한 보호구를 착용 했는지 확인 하십시오.</li>
		<li>공장 설비 재료 물 제거 되 고 하는 동안 조직 metabolically 활성 되지 않습니다 보장 하기 위해 동결 건조 기를 사용 하 여 lyophilize 샘플의 질량까지 드라이 모든 물 제거 되도록 안정화.</li>
		<li>일단 샘플 건조, 분쇄기 또는 밀을 사용 하 여 정밀한 분말에 갈기. Desiccating 캐비닛 분석까지 샘플을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 수용 성 단백질 분석 결과
<ol><li>샘플 준비<ol>
<li>각 조직, 약 20 m g 각각의 복제 샘플 무게 1.5 mL 폴리스 티 렌 microcentrifuge 튜브 및 튜브 라벨에. 이후 알 수 없는 샘플으로 이러한 샘플을 지칭 합니다. 이 정보 각 불명된 한 견본에서 % 녹는 단백질을 계산 하는 데 필요한 것으로 각 샘플의 정확한 질량을 기록 합니다. 잠금 뚜껑, microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 샘플 솔루션의 손실을 후속 난방 단계 비 잠금 뚜껑 열 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Solubilize 및 알 수 없는 샘플 단백질 분리<ol>
<li>마이크로 pipettor 사용 하 여, 각 튜브를 0.1 M NaOH의 500 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 30 분 동안 sonicate. 뜨거운 물에 예 열 목욕 90 ° c. 주의: 수산화 나트륨 강력한 기반 이며 피부 접촉 시 화상을 일으킬 수 있습니다. 0.1 M NaOH 낮은 농도 나타내지만, 피부 자극을 피하기 위해 보호 장갑을 착용 하십시오.</li>
		<li>15 분 동안 뜨거운 물 목욕에 있는 선반에 튜브를 배치 합니다.</li>
		<li>10 분간 15000 x g에서 튜브를 원심. 각 샘플에 대 한 새로운 피 펫 팁을 사용 하 여 새 레이블된 microcentrifuge 튜브 표면에 뜨는 액체 플라스틱. 10 분 동안 펠 릿과 다시 15000 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 튜브를 0.1 M NaOH의 300 µ L를 추가 합니다. 또, 표면에 뜨는 액체를 수집 하 고 동일한 샘플에서 다른 표면에 뜨는 액체 결합. 정지점, 잠재적인 이며 샘플에 저장 될 수 4 ° C 하룻밤 필요한 경우.</li>
	</ol></li>
	<li>식물 단백질을 침전<ol>
<li>각 샘플 솔루션에 리트머스 종이 담거 서 5.8 M HCl. 확인 ~ 7의 pH의 11 µ L을 추가 하 여 표면에 뜨는 해결책의 pH를 중화. 주의: 염 산 (피부 응용 프로그램 또는 흡입) 피부 접촉 시 화상 일으킬 수 있는 강한 부식성 산 이다. HCl을 처리 하는 동안 피부 자극을 방지 하기 위해 장갑을 착용 합니다.</li>
		<li>각 관에 100 %trichloroacetic 산 (TCA)의 90 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 튜브를 품 어. 단백질의 강수량은 불투명 클리어에서 솔루션을 돌 것 이다. 이 분 후 발생 하지 않으면, 1 시간 동안 튜브를 냉동. 정지점, 잠재적인 이며 샘플에 저장 될 수 4 ° C 하룻밤 필요한 경우. 주의: Trichloroacetic 산 부식성입니다. 피부와의 접촉을 방지 하 고 흡입 방지를 처리할 때 장갑을 착용 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 13000 x g에서 원심 분리기 샘플 정밀한 유리 제 micropipette 팁 (동일한 팁 샘플에서 사용할 수 있습니다)에 연결 된 진공 라인을 사용 하 여 밖으로 suctioning에 의해 표면에 뜨는 TCA를 조심 스럽게 제거. 무거운 흡입을 피하 및 피 펫 팁과 펠 릿 사이의 적절 한 거리를 유지 하 여 단백질 펠 렛을 방해 하지 마십시오.
</li>
		<li>-20 ℃ 아세톤의 100 µ L로 신속 하 게 펠 릿을 세척. 이 단계는 후속 Bradford 분석 실험;을 방해할 수 있는 펠 릿에서 모든 나머지 TCA를 제거 합니다. 그러나, 아세톤 아세톤 다음 신속 하 게 추출 된 펠 릿에서 5 초 이내에 추가 되어야 합니다 그래서 너무 오래 접촉에 남아 있는 경우 단백질 펠 릿을 분해 하기 시작 합니다.</li>
		<li>아세톤 증기 두건 또는 냉장고에 튜브를 삽입 하 여 증발을 허용 한다. 다음, 각 튜브를 1 mL의 0.1 M NaOH 추가 하 여 단백질 pellet을 디졸브. 뜨거운 물에 난방의 여러 라운드를 필요할 수 있습니다 완전히 펠 릿을 녹이는 목욕, vortexing, 및 sonicating. 참고: 더 이상 튜브 증기 두건에서 앉거나 냉장고와는 건조 알 약 얻을, 그들은 다시 solubilize 하는 것이 더 어려운. 그것은 30 분 동안 건조 한 펠 릿을 제안 하 고 아세톤의 존재에 대 한 확인 될 때까지 10-15 분 마다 아세톤 증발 했다 해제 (없음 아세톤 가스는 감지).</li>
	</ol></li>
	<li>표준 솔루션을 혼합 하 고 알 수 없는 샘플 솔루션을 희석 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 알 수 없는 샘플의 총 단백질 함량을 계량.<ol>
<li>소 면역 글로불린 G (IgG) 표 1 (동결 건조 된 또는 IgG 재고 솔루션 각 농도 달성 하기 위해 이온된 수와 혼합 수 있습니다)에 나열 된 농도 따라 표준 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 표준 저장 96 잘 접시에 잘 플레이트의 A1 위치에서 triplicate 시작에서 각 IgG 표준 솔루션의 160 µ L 추가 (0 µ g / µ L에 A1, A2, A3 위치, B1, B2, b 3에서 µ 0.0125 µ g/L 위치, 등).</li>
		<li>증류수의 950 µ L을 0.1 M NaOH의 50 µ L을 추가 하 여 희석된 NaOH 솔루션을 준비 합니다. 빈 부정적인 제어로 3 (G1, G2, G3 위치) 중에 잘 접시에이 솔루션의 60 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 증류수의 950 µ L를 각 샘플 솔루션의 50 µ L을 추가 하 여 알 수 없는 샘플의 희석을 준비 합니다. 그런 다음, H1 위치에서 시작 하는 3 중에 잘 접시에 각 희석된 샘플의 60 µ L를 추가 합니다. 96 잘 접시 6 표준, 1 공백, 및 3 중에서 읽을 때 25 알 수 없는 샘플의 분석에 대 한 허용 해야 합니다. 각 잘 플레이트 분석 자체 IgG 표준 및 빈 샘플을 포함 해야 합니다.</li>
		<li>모든 빈 고 알 수 없는 샘플 우물에 증류수 100 µ L를 추가 합니다. 이제 각 잘 총 160 µ L. 다중 채널 피 펫 (8 채널)를 사용 하 여 포함 한다 Coomassie 화려한 블루 G-250 단백질의 40 µ L 염색 잘 잘 플레이트의 첫 번째 열에 있는 모든 추가. 여러 번 급락 하 여 예제와 함께 염료를 혼합. 피 펫 팁 오염을 피하기 위하여 대체 다른 모든 열에 대해 반복 합니다. 주의: Coomassie 화려한 블루 G-250 자극 하 고 피부, 눈와 접촉 또는 폐를 피해 야 한다. 피부 접촉을 방지 하기 위해 장갑을 착용 합니다. 발생 하는 피부와 접촉 하는 경우이 제품 얼룩 것입니다.</li>
		<li>미 판 분 광 광도 계 읽기 방해할 수로 우물에 있는 모든 거품을 팝업 하는 바늘을 사용 합니다. 웰 스 사이 오염을 피하기 위하여 바늘을 청소. 5 분 동안 실 온에서 품 어 미 판 하자.</li>
		<li>각 잘 595에서 흡 광도 값을 기록 microplate 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm.</li>
		<li>3 빈 우물에 대 한 평균 흡 광도 기록 하 고 각 표준 및 알 수 없는 샘플 읽기에서이 값을 뺍니다. 그런 다음 각 표준 및 알 수 없는 샘플에 대 한 평균 흡 광도 기록 합니다. 참고: 표준 곡선을 사용 하 여 각 불명된 한 견본에 있는 단백질의 양을 계산 하는 단백질에 각 표준의 마이크로 그램에 대 한 각 표준의 평균 흡 광도 떠올리게 하는 가장 쉬운 하지만 하나 단백질 농도 (μ를 플롯할 수 있습니다. g / µ L) 바람직한 경우 각 표준의. 그러나 다음 계산,, 마이크로 그램, 아니라 농도 (µ g / µ L)에 따라 표준 곡선을 참조 하십시오.</li>
		<li>각 표준 음 (표 1)에 단백질의 총 금액에 대해 각 표준의 평균 흡 광도 플롯 합니다. 이러한 데이터에 선형 회귀선 적합 하 고 잘 평균 흡 광도 (그림 1a)에 따라 각 알 수 없는 샘플에서 (µ g) 단백질의 양을 계산 하는 방정식을 사용 하 여. 참고:이 줄의 상관 계수 (r 값) 보다 큰 0.98 정기적으로 0.99 근처 이어야 한다. 표준 회귀 각 접시에 적용 됩니다, 그리고 각 접시에 알 수 없는 샘플 웰 스를 별도로 분석 해야 따라서.</li>
		<li>단백질의 평균 금액은 각 알 수 없는 샘플 잘 계산 됩니다, 일단 다음 방정식을 사용 하 여 각 원래 샘플에서 (µ g) 단백질의 총 금액을 계산 하. Mp = (((Wp/60) x 1000) / 50) * 1000 Mp = 원래 견본에 있는 단백질의 µ g Wp 잘 불명된 한 견본에 있는 단백질의 µ g =<ol>
<li>다음, 다음 수식을 사용 하 여 각 샘플에서 단백질의 비율을 결정. Pp = ((Mp/1000) /Mi) * 100 Pp = 샘플에서 % 단백질 M나 샘플 (mg)의 초기 질량 = 참고: 경우에 따라 샘플 위 흡 광도 임계값을 능가 수 있습니다. 그렇다면, 샘플 솔루션 필요할 수 있습니다 추가 희석 단계 2.4.3에서. 다음 후속 계산에 추가 희석에 대 한 차지 해야 합니다. 일부 microplate 리더 브랜드는 또한 자동으로 표준 곡선 데이터에 따라 각 알 수 없는 샘플의 평균 단백질 농도 계산 하는 컴퓨터 소프트웨어를 제공 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. 소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과
<ol><li>샘플 준비<ol>
<li>각 조직의 약 20mg 각 복제 샘플 무게를 다 십시오, 스크류 캡 고무 줄 (길이 100 m m)와 15 mL 튜브 유리에. 이후 알 수 없는 샘플으로 이러한 샘플을 지칭 합니다. 방수 마커 또는 뚜껑에 테이프 라벨 튜브 라벨 고 기록 각 샘플의 정확한 질량이이 정보 각 불명된 한 견본에 % 탄수화물을 계산 하는 데 필요한 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>알 수 없는 각 샘플에서 소화 되기 쉬운 탄수화물을 추출 합니다.<ol>
<li>4 각 튜브와에 나사 뚜껑을 단단히 튜브 그래서 0.1 M H2의 1 mL를 추가 합니다. 1 시간 동안 끓는 물 욕조에 배치 합니다. 주의: 황산은 매우 부식성. 그래서 H2를 처리할 때 장갑, 아이 구글, 그리고 앞치마 착용4 증기 두건에서이 단계를 수행 하 고.</li>
		<li>미지근한 물 욕조에 튜브에서 멋진. 붓고 튜브 내용을 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (일부 식물 소재 남아 유리 튜브에 하는 경우 염려 되지 않음).</li>
		<li>10 분간 15000 x g에서 튜브를 원심. 새 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 마이크로 pipettor와 장소 표면에 뜨는 액체를 제거 합니다. 관 수 수 냉장 하룻밤이 시점에서. 분석 결과 함께 계속, 단계 3.3.2 참조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표준 솔루션을 혼합 하 고 알 수 없는 샘플의 총 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 계량.<ol>
<li>D(+) 포도 당 농도와 표준 솔루션 표 2에 나열 된 준비. 각 표준 솔루션의 400 µ L로 6 개의 유리 시험관을 준비 합니다.</li>
		<li>자체 테스트 튜브에 알 수 없는 각 샘플의 15 µ L 플라스틱 고 각 시험관에서 400 µ L의 전체 볼륨에 대 한 각 증류수의 385 µ L를 추가 합니다. 증기 두건에서 각 표준 및 알 수 없는 샘플 테스트 튜브에 5% 페 놀의 400 µ L을 추가 하 고 신속 하 게 플라스틱 집중된 H2의 2 개 mL 등4 각 튜브에. 피 펫 팁 테스트 튜브 내용을 터치 하지, 그냥 화면에 추가할 솔루션 (리피터 피 펫이에 대 한 최고의 작품).</li>
		<li>10 분 동안 품 어 관 게 그리고 신중 하 게 소용돌이 내용을 혼합 튜브. 30 분 추가 대 한 품 어. 주의: 페 놀 및 황산 부식성 irritants 있습니다. 피부, 눈, 그리고 흡입 노출에서 보호를 포함 하는 적절 한 보호구를 사용 하 여 화학 증기 두건에서이 단계를 수행: 얼굴 방패 또는 눈 고글, 고무 장갑, 랩 앞치마, 그리고 부츠. 혼합 페 놀 황산도에서 발열 반응 결과는 뜨겁게 되 고 튜브에서 발생 합니다.</li>
		<li>각 3 폴리스 티 렌 1.5 mL 세미 마이크로 큐 벳 (샘플 당 3 기술 복제)의 각 관에서 샘플의 800 µ L 플라스틱. 490에서 읽을 분 광 광도 계를 설정 nm. 포함 된 증류수 표준 또는 알 수 없는 샘플, 읽기 전에 간헐적으로 샘플 읽기에 걸쳐 빈 베트를 보정. 분 광 광도 계를 통해 각 베트를 실행 하 고는 흡 광도 기록. 기술에 걸쳐 평균 각 알 수 없는 샘플에 대 한 복제합니다. 참고: 경우에 따라 샘플 위 흡 광도 임계값을 능가 수 있습니다. 그렇다면, 샘플 단계 3.2.3에 희석 한다. 희석도 후속 계산에 대 한 차지 해야 합니다.</li>
		<li>각 표준에 대 한 평균 흡 광도 계산 합니다. 참고: 표준 곡선을 사용 하 여 각 알 수 없는 샘플에 총 소화 되기 쉬운 탄수화물의 양을 계산 하는 D (+) 포도 당 각 표준에의 마이크로 그램에 대 한 각 표준의 평균 흡 광도 복귀 하기 쉬운 하지만 하나 또한 수 있습니다. 바람직한 경우 각 표준의 D (+) 포도 당 농도 (µ g / µ L)를 플롯 합니다. 그러나 다음 계산,, 마이크로 그램, 아니라 농도 (µ g / µ L)에 따라 표준 곡선을 참조 하십시오.</li>
		<li>각 표준 솔루션에서 D (+) 포도 당 (µ g)의 총 금액에 대 한 평균 흡 광도 그려서 표준 곡선을 계산 합니다. 이러한 데이터에 선형 회귀선 적합 하 고 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 각 알 수 없는 샘플에서 (µ g) 탄수화물의 총 금액을 계산: Mc = (((x -A b)/m)/(15)) * 1000 Mc 샘플에서 탄수화물의 µ g = X = 알 수 없는 샘플의 평균 흡 광도 b = y-절편 (표준 회귀 선) m = 경사 (표준 회귀 선) 이 라인의 상관 계수 보다 큰 0.98 정기적으로 0.99 근처 이어야 한다. 다음, 다음 수식을 사용 하 여 각 샘플에서 탄수화물의 비율을 결정. Pc = ((Mc/1000) / (Mi)) * 100 Pc % 탄수화물 = M나 샘플 (mg)의 초기 질량 =</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

효과적인 식물 관련 추출 프로토콜 확고 색도계 분석 실험을 결합 함으로써 여기 설명 하는 분석 실험 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠를 측정 하기 위한 합리적이 고 정확한 방법을 제공 합니다. 우리의 결과 옥수수를 사용 하 여 모형 다른 생물학으로 관련 공간 스케일에서 정확한 측정을 얻기 위해 이러한 프로토콜을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 예를 들어 우리 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 지리적 지역, 종류 (또는 genotypes), 조직 유형, 그리고 심지어 공간 분리 조직 간의 차이 감지할 수 있었다. 모두 분석을 할 수 있는 일반적인 실험실 장비 및 시 약, 요구만 기본적인 실험실 기술를 사용 하 고 짧은 시간 내 샘플 (50-75)의 비교적 큰 숫자를 분석할 수 있습니다.
비록 상대적으로 쉽게 수행 하기 위해, 몇 가지 단계, 다른 사람 보다 더 중요 한 그리고 제대로 수행 하는 경우는 결과의 정확도 제한할 수 있습니다. 예...

식물 바이오 매스는 사실상 모든 지상파 음식-웹의 기초를 형성 한다. 식물 뿌리 시스템을 통해 토양에서 영양 요소 확보를 생체 합성 조직 그들의 잎에 햇빛. 특히, 탄소와 질소 탄수화물, 단백질 (아미노산의 구성)를 만드는 데 사용 됩니다 빌드하고 지질 하는 데 필요한 식물 바이오 매스 (주목 해야 한다 그에 식물 생리학 용어 "다량 영양소" 종종 N, 등 토양 요소 참조 그러나 P, K, S,,이 문서를 통해이 기간을 참조 합니다 쓰이므로, 단백질, 탄수화물, 지질 등). Herbivores 소비 공장 설비 재료, 식물 조직에 포함 된 macronutrients 그들의 구성 부분으로 세분화 되며 소비자의 생리 적 프로세스를 구동 하는 데 사용. 이 방법에서는, 식물 macronutrients 높은 순서 생태 상호 작용 및 음식 웹 역동성에 대 한 중요 한 의미와 함께 소비자 생리학에 강한 영향이 있다.
동물의 왕국에 걸쳐 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 macronutrients 생존, 재생산, 그리고 성능1에 가장 밀접 하 게 묶여 있습니다. 또한, 동물의 대다수는 적극적으로 그들의 생리 적 요구1,2를 충족 하기 위해 이러한 두 개의 macronutrients의 그들의 섭취를 조절 합니다. 이 사실이 특히 식물 조직, 설탕 및 아미노산의 농도 감지 하는 곤충 herbivores에 대 한 차례로 먹이 행동을 지시 하는. 그 결과, 수용 성 단백질을 식물 그리고 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 식물 곤충 상호 작용의 진화에 강한 역할을 했다.
우세는 동안 공장 수용 성 단백질에 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 데이터 상대적으로 드물다 (6,7,,89,10,11참조), 식물 원소 콘텐츠 (탄소, 질소, 인)에서 사용할 수 있는 데이터입니다. 크게이 요소는 식물 미네랄 영양3,,45에 기본 역할 때문입니다. 요소, 측정 어디 상관 관계 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물의 양을 추정 하는 데 사용 되었습니다 하지만 정확한 계산 종종 얻기 어렵다. 예를 들어, 탄소는 모든 유기 화합물에 편 존재 하기 때문에 공장 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠의 지표로 서 탄소를 사용 하 여 아니다. 원소 질소 공장 수용 성 단백질 콘텐츠, 사이 강한 관계가 그리고 일반화 된 질소-단백질 변환율은 종종 활용. 그러나, 질소-단백질 변환 높은 종의12,13,14,15, 하 게 일반화 된 변환의 사용 가능성이 있다는 강력한 증거가 있다 부정확 한. 이 때문에, 질소-단백질 변환 요소는 종종 특히 정도로 herbivores에 영양 연구에 필요한 정밀을 부족 합니다. 또한, N 포함 된 식물 allelochemicals, 미치 죠 및 glucosinolates는 herbivores, 독성 등의 존재는 이러한 변환을 혼동 수 있습니다.
여기, 우리는 수용 성 단백질과 식물 조직에서 소화 되기 쉬운 탄수화물의 농도 측정 하기 위한 두 개의 화학 분석을 제공 합니다. 이 분석 실험, 제시 하지만 그 그들은 동시에 사용할 수 같은 식물 샘플을 분석 하 식물 macronutrients의 보다 포괄적인 분석을 달성 하기 위하여 건의 된다. 둘 다 비슷한 방법론을 정량화 하 여 흡 광도 통해 다음 추출 단계의 구성 된 사용 합니다. 식물 샘플 준비는 또한 쉽게 연동에서 모두 분석을 실행 하려면 두 프로토콜에 대 한 동일 합니다. 이 분석 실험의 유틸리티 할 그들의 참신에서 줄기 하지 그들은,에 의존 (브래드 포드, 존스, 뒤부아) 확고 색도계 분석 실험16,17,18, 하지만 여기서 우리는 명확 하 고 쉽게 따라 조직 더 애매 한 특정 식물 추출 기술17,19 이러한 메서드를 결합 하 여 이러한 분석의 응용 식물 관련 필드에 액세스할 수 있도록 하는 프로토콜입니다.
두 분석 실험에 대 한 식물 macronutrients는 동결, lyophilizing, 및 식물 소재를 연 삭 하 여 물리적으로 추출 처음. 수용 성 단백질 분석 결과 대 한 추가 화학 추출17,19 vortexing 및 난방 NaOH 솔루션에서 샘플의 몇 라운드를 통해 수행 됩니다. Coomassie 화려한 블루 G-250를 활용 하 여 잘 알려진 Bradford 분석 실험 다음 수용 성 단백질과 3000-5000 Daltons16,17사이 polypeptides를 계량 하는 데 사용 됩니다. 이 분석 결과 1-20 µ g 미 판 당 총 단백질 사이 탐지 범위 잘 또는 < 25 µ g/mL, 하지만 하지 측정 무료 아미노산을 않습니다. 소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과의 추출 단계 스미스 그 외 여러분 의 희석 산 방법에 따라 20 녹는 설탕, 전 분, 그리고 fructosan-하지만 하지 구조 탄수화물의 격리에 대 한 수 있습니다. 페 놀 황산 산 정량화 방법 뒤부아 외 에서 가져온 것입니다. 18 모든 모노-, 올리고-고 류 뿐만 아니라 (메 틸 유도체) 측정. 이 분석 결과 특정 설탕을 계량 수 하지만 여기 우리가 총 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 표시기로 사용 (참조 스미스 외. 20 더 자세한 분석을 위해). 함께,이 분석 실험 공장 환경 생리학 및 초 성능, 지상파 음식-웹의 기지에서 리소스 품질에 중요 한 데이터를 제공 하 강하게 연결 된 두 개의 macronutrients를 측정 합니다. 이러한 프로토콜을 제시 식물 생리학, 초 식 동물의 영양 생태학, 식물-초 상호 작용의 더 철저 한 이해를 얻기 위하여 식물 다량 영양소 데이터 집합 생성을 촉진 합니다.

<table><tbody><tr><td>마이크로플레이트 리더(분광 광도계)</td><td>Bio-Rad</td><td>모델 680 XR</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축</td>액 <td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td>450mL</td></tr></tbody></table>

공장 수용 성 단백질과 소화 탄수화물 콘텐츠를 사용 하 여 옥수수 (지 시 메이 스)를 표본으로 측정

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

원소 데이터 일반적으로 herbivores 자원으로 식물 품질을 유추 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 탄소 생체에서의 유비, 포함 하는 질소 식물 방어 화합물 및 질소와 식물 단백질 콘텐츠 모든 종의 수천에서 존재 이러한 추정의 정확도 제한 합니다. 또한, 식물에 초점을 맞춘 연구 및/또는 초 식 동물 생리학 필요 하지 사용 하 여 이루어집니다 정확도의 수준을 일반화 상관 관계. 여기에 제시 된 방법 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물, 동물 생리 적 성능에 가장 밀접 하 게 연결 하는 두 식물 macronutrients 직접 측정을 위한 명확 하 고 빠른 프로토콜 연구를 제공 합니다. 프로토콜은 정확 하 고 재현 가능한 결과 제공 하는 최적화 된 공장 관련 소화 단계 잘 특징이 색도계 분석 실험을 결합 한 제품. 조직 표시 이러한 분석 실험 감도에서 변화를 감지 하는 다른 달콤한 옥수수의 우리의 분석 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 여러 공간 비늘에 걸쳐 공장. 이러한 포함 하는 식물 사이 성장 하는 지역 및 식물 종 또는 품종, 뿐만 아니라 공장 내 조직 종류에 차이 같은 조직 내에서 심지어 위치 차이. 원소 데이터 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 결합도 식물 미네랄 영양 식물 생리 프로세스와 연결할 식물 생물학에 있는 새로운 기회를 제공. 이러한 분석은 또한 수용 성 단백질 및 영양 생태학, 식물-초 상호 작용 및 생리 및 생태 연구에 향상 시킬 것입니다 음식 웹 역동성을 공부 하는 데 필요한 소화 되기 쉬운 탄수화물 데이터 생성 도움이 됩니다.

이러한 방법의 유용성을 표시 하려면 우리는 수용 성 단백질 및 4 개의 다른 분야와 곤충 herbivores에 대 한 개별 잠재적인 영양 자원 역할 sweetcorn 조직의 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠를 분석 했다. 우리는 미국 (미네소타, 노스캐롤라이나, 텍사스)에서 3 개의 농업 지역에서 옥수수의 귀를 수집 달콤한 옥수수 (즉, genotypes)의 5 개의 다른 다양성 및 한의 다양 한 필드 옥수수는 outgroup로 포괄. 표 3 옥수수 샘플 및 그들이 수집에 대 한 요약을 보여 줍니다. 모든 품종 완성도, 수집 하지만 품종 간의 발달 차이 그들은 아니었다 심기 후 같은 날에 수집 된 모든. 우리는 신속 하 게 (수정된 잎 둘러싸고 cob) 껍질을 분리 하 여 별개 조직으로 귀를 처리 하 고 방법에 표시 된 모든 조직으로-80 ° C에서 저장 하기 전에 귀에서 실크 (빛나는 섬유 껍질과 커널 사이). 각 조직 했다...

여기에 설명 된 프로토콜 수용 성 단백질 및 식물 조직에서 소화 (비 구조) 탄수화물 콘텐츠 측정을 위한 명확 하 고 친근 한 방법론을 제공 합니다. 이 두 공장 macronutrients 계량 수 식물 생리학, 영양 생태학, 식물-초 상호 작용 및 식품 웹 생태 분야 진출을 위한 중요 한 의미를 갖는다.

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

이 방법을 통해 식물 과학 및 영양 생태학 분야의 연구원들은 식물 조직의 용해성 단백질과 소화 가능한 탄수화물의 농도를 정확하게 측정할 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 이 두 가지 매우 중요한 다량 영양소를 높은 정확도로 정량화할 수 있는 빠르고 쉬운 방법을 제공한다는 것입니다. 이러한 기술은 식물 단백질과 탄수화물이 육상 먹이 그물의 기초를 구성하기 때문에 생태학 분야에 강력한 영향을 미칩니다.일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 범용 실험실에서 일반적으로 수행되지 않는 몇 가지 단계와 일부 기술이 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 시작하려면 각 조직의 복제 샘플을 라벨이 붙은 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 다음으로 각 샘플의 정확한 질량을 기록합니다.마이크로피펫터를 사용하여 각 튜브에 0.1몰 수산화나트륨 500마이크로리터를 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 튜브를 30분 동안 음파 가열합니다. 그런 다음 튜브를 예열된 온수 욕조에 15분 동안 넣습니다.그 후에, 15, 10 분 동안 000 G에 관을 분리기. 각 샘플에 대해 새 피펫 팁을 사용하여 표지된 새 마이크로 원심분리 튜브에 상층액을 피펫으로 주입합니다. 펠릿에 300마이크로리터의 0.1몰 수산화나트륨을 추가하고 10분 동안 원심분리를 반복합니다.그 후, 상층액을 제거하고 첫 번째 원심분리에서 상등액을 포함하는 튜브로 옮깁니다. 상등액의 pH를 중화하려면 11 마이크로 리터의 5.8 몰 염산을 첨가하십시오. 리트머스 종이를 사용하여 pH가 약 7인지 확인합니다.다음으로, 각 튜브에 90마이크로리터의 100% 트리클로로아세트산을 추가합니다. 그런 다음 얼음 위에서 튜브를 30분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 13, 000G에서 샘플을 원심분리합니다.진공 라인과 유리 마이크로피펫 팁을 조심스럽게 사용하여 트리클로로아세트산을 제거합니다. 흡입 팁으로 펠릿을 방해하지 않도록 각별히 주의하십시오. 다음으로, 100마이크로리터의 아세톤으로 펠릿을 세척하고 섭씨 20도로 냉각한 다음 아세톤이 흄 후드에서 증발하도록 합니다.단백질 펠릿을 수산화나트륨 1ml로 녹입니다. 추가 가열, 소용돌이 및 음파 가열이 필요할 수 있습니다. 각 IGG 표준 용액 160마이크로리터를 A1 위치부터 시작하여 96웰 플레이트에 3회 추가합니다.다음으로, 새로운 1.5ml 튜브에서 각 샘플 용액 50마이크로리터를 증류수 950마이크로리터에 추가합니다.그런 다음 희석된 각 시료를 H1 위치부터 시작하여 60마이크로리터의 시료를 웰 플레이트에 30마이크로리터씩 추가합니다. 100마이크로리터의 증류수를 모든 빈 샘플과 알 수 없는 샘플 웰에 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트의 각 웰에 40마이크로리터의 Coomassie Brilliant Blue G-250 단백질 염료를 추가합니다.바늘을 사용하여 우물에있는 거품을 터뜨립니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 595나노미터에서 각 웰의 흡광도 값을 기록합니다.먼저, 각 조직 샘플의 복제물을 유리 15ml 튜브로 계량합니다. 튜브에 라벨을 붙이고 각 샘플의 정확한 질량을 기록합니다. 다음으로 각 튜브에 0.1몰 황산 1ml를 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다.그런 다음 튜브를 끓는 물에 1시간 동안 넣습니다. 튜브를 미지근한 수조로 옮겨 식힙니다. 그런 다음 튜브의 내용물을 라벨이 붙은 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 붓습니다.이 분리기 관 후에 15, 10 분 동안 000 G. 마이크로 피펫을 사용하여 상등액을 새로 라벨링된 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 15마이크로리터의 미지 시료를 자체 시험관으로 이송합니다.그런 다음 각 튜브에 385마이크로리터의 증류수를 추가합니다. 흄 후드에서 400마이크로리터의 5%페놀을 각 표준 및 미지 샘플 시험관에 추가합니다. 그 직후 각 튜브에 2ml의 황산을 첨가하십시오.용액 표면에 황산을 첨가하십시오. 튜브를 10분 동안 배양한 후 튜브를 소용돌이칩니다. 그런 다음 튜브를 추가로 30분 동안 배양합니다.각 시료 튜브에서 800마이크로리터를 폴리스티렌 1.5ml 세미 마이크로큐벳 3개로 옮깁니다. 그런 다음 분광 광도계를 490나노미터에서 읽도록 설정하고 빈 큐벳으로 보정합니다. 마지막으로 분광 광도계를 통해 각 큐벳을 실행하고 흡수도를 기록합니다.이 프로토콜을 사용하여 3개의 지리적 지역에서 온 4개의 서로 다른 밭 및 옥수수 조직의 용해성 단백질과 소화 가능한 탄수화물 함량을 분석했습니다. 지역 간에 용해성 단백질 함량의 상당한 차이가 관찰되었기 때문에 각 영역에 대한 별도의 분석이 필요했습니다. 지역에 따라 조직 간의 수용성 단백질과 소화 가능한 탄수화물 함량에 몇 가지 차이가 있었습니다.미네소타에서는 조직의 수용성 단백질 함량만 다양했던 반면, 노스캐롤라이나의 조직은 수용성 단백질과 소화성 탄수화물 모두에서 다양했습니다. 텍사스에서 조직 다량 영양소 함량의 변동성은 다양성에 따라 달랐습니다. 이 기술을 통해 식물 과학 및 영양 생태학 분야의 연구자들은 원소 측정에서 외삽하는 대신 용해성 식물 단백질과 소화 가능한 탄수화물을 정확하게 측정할 수 있습니다.액체 질소, 농축 산 및 염기로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 이러한 화학 물질로 작업할 때마다 항상 장갑, 보안경, 앞치마 및 발가락이 막힌 신발과 같은 예방 조치를 사용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

종자 - 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

이 비디오는 식물 조직의 용해성 단백질 함량을 정량화하는 비색 방법을 설명합니다. 이 방법은 용해성 단백질과 상호 작용하여 조직의 용해성 단백질 함량에 비례하는 파란색의 안정적인 단백질 염료 복합체를 형성하는 Coomassie Brilliant Blue G-250 염료를 사용합니다.

식물 조직의 용해성 단백질 함량을 정량화하기 위한 수용성 단백질 분석

이 비디오는 식물 조직에 존재하는 소화 가능한 탄수화물을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이는 다양한 식물 조직에서 데이터를 수집하여 영양 생태학, 식물-초식 동물 상호 작용 및 먹이-그물 역학을 연구하는 데 도움이 됩니다.

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이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

여기, 우리 미 프로토콜 곡물 샘플을 처리 하 고 높은 처리량 분석 파이프라인에 통합이 미 접근 제시. 이것은 현재 사용할 수 있는 프로토콜의 높은 처리량 적응 이다.

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곡물의 전사체 프로파일링을위한 방법이 제시된다. 마이크로어레이 기반 유전자 발현 프로파일링은 시리얼 곡물로부터 고품질의 총 RNA를 분리하는 것으로 시작하여 cDNA 생성을 계속합니다. cRNA 라벨링 및 마이크로어레이 혼성화 후 신호 감지 및 품질 관리를 위한 권장 사항이 제공됩니다.

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Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 데모의 주요 목적은 식물 바이오매스 샘플에서 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 상세한 Updegraff 프로토콜을 제공하는 것입니다.

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표현형을 측정하기 위한 저비용 식물 이미징 방법과 이미지 캡처를 위한 모범 사례 및 식물 형질을 정량화하기 위한 이미지 분석 파이프라인이 제시됩니다. 이러한 방법은 더위, 가뭄 및 결합된 비생물적 스트레스 조건에서 옥수수(Zea mays) 표현형을 측정하는 데 적용되었습니다.

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기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 식별에 기초하여 미세 조류의 지방산 함량 및 조성의 결정을위한 방법을 설명한다. tripentadecanoin 내부 표준 물질은 추출과 불완전 에스테르 교환시 가능한 손실을 보상하기 위해 사용된다.

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배우세요 옥수수 조직에서 가용성 단백질과 소화 가능한 탄수화물을 정확하게 측정하는 방법을. 이 기술은 식물 생리학 및 생태학 연구에서 중요한 영양소 분석에 활용됩니다.

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