Name: Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 학습하세요 T7 박테리오파지 정량을 위한 qPCR 방법으로 바이러스학 및 미생물학 연구에서 복잡한 샘플의 파지 수를 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 기술은 파지 디스플레이 바이오패닝 실험의 다수 샘플 분석에 시간 효율적이며 정확한 정량화를 제공합니다.

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이 작품은 PhRMA 기초 연구 동기 부여에 의해 지원 되었다 고 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 건강의 국가 학회의 보너스 번호 R01HL138251에서 부여 합니다.

1. 뇌관 디자인 및 T7 살 균 소 게놈 DNA에 대 한 분석
<ol><li>T7 살 균 소 게놈 DNA의 확대를 위한 뇌관 디자인. 참고: F (앞으로)와 R (반전) 뇌관 ( 재료의 표참조) T7 DNA 순서를 증폭 라이브러리 변수 영역 (그림 1) 상류에 위치.</li>
	<li>용융 온도 (Tm), 백분율 GC 내용 (GC %), 뇌관 이합체, 머리 핀 형성 및 PCR 적합성 (그림 1)를 포함 한 뇌관의 매개 변수를 평가 하는 적절 한 뇌관 분석기를 선택 하십시오.</li>
	<li>뇌관 oligonucleotides (oligos), 주문 그리고 도착 시 DNase과 RNase 무료 울트라 순수 물 1.5 mL 원심 분리기 튜브, 100 µ M 재고 농도 확인 하 고 몇 달 동안-20 ° C에서 저장에 동결 건조 된 oligos resuspend.</li>
	<li>100 µ M 뇌관의 여러 aliquots (각 1.5 mL 튜브에 약 50 µ L)을 확인 합니다. 참고:이 단계는 자주 freeze-thaw 주기를 방지 하기 위해 사용 됩니다.</li>
</ol>2. t 7 살 균 소 게놈 DNA의 정량화에 대 한 표준 준비
<ol><li>직렬로 0.1 µ g / µ L (1.0 x 108 fg / µ L) 참조 T7 살 균 소 DNA를 희석 (구입, 0.1 µ g / µ L의 알려진된 농도에 자료 참조) 10 1.0 x 10에서6 100 fg / µ L 울트라 순수 H2O 0.2 mL PCR 튜브에 x 1.0. 20 µ L (그림 2)의 총 볼륨의 각 농도 준비 합니다.</li>
	<li>소용돌이 PCR 튜브 희석의 각 단계에서 철저 하 게 혼합 되도록 합니다. 또한, 다음 희석에 DNA 샘플을 추가할 때 팁을 변경 합니다. 참고: 그것은 정량 실험의 모든 일괄 처리에 대 한 표준 곡선에 대 한 DNA 표준의 새로운 솔루션을 준비 하 고 좋습니다.</li>
	<li>방정식 1 (아래)를 사용 하 여 변환할 T7 페이지 참조에 대 한 DNA 농도 fg / µ L에서 게놈 복사본 (gc) /µL (그림 2).</li>
	<li>T7 gc / µ L에서 살 균 소 DNA 농도 = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq1.jpg">(1) 참고: bp: 기본 쌍; 참조 T7 genomic DNA는 37314 혈압.</li>
</ol>3. 살 균 소 샘플 전에 정량 Pcr 반응 준비의 전처리
<ol><li>
(옵션 1) 피펫으로 20 µ L 한 T7 클론 (살 균 소)의 낭 성 섬유 증 (CF) 생체 외에서 에 대 한 biopanning에서 선택-1.5 mL 원심 분리기 튜브로 점액 모델 처럼. 1.25 단위의 DNase 추가 나 (0.5 µ L) 각 20 µ L 샘플을. 참고: T7 페이지 시스테인 제한 heptapeptide 라이브러리 (CX7C)은 15 분 동안 24-잘 막 삽입 ( 재료의 표참조)에 코팅 하는 CF 같은 점액에 대 한 biopanned. 자세한 내용은 결과 섹션에서 제공 됩니다. T7 클론이 eluate에서 정량 샘플 준비를 위해 선택 되었다.<ol>
<li>옵션 2: 피펫으로 200 µ L는 t 7의 1.5 mL 튜브에 복제 하 고 5 단위의 DNase 추가 나 (2 µ L) 각 샘플을. 참고:이 단계에서 선택 하는 살 균 소 견본의 볼륨 biopanning에서 수집 된 볼륨에 따라 달라 집니다. Biopanned 살 균 소의 정량에는 프로토콜의 포커스를 실행 하는 동안 단계 biopanning T7 페이지의 사용자 프로토콜에 자세한 키트 ( 재료의 표참조)13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T7 페이지 샘플 튜브 (3.1 단계)을 닫습니다 그리고 온수 건조 목욕 (즉, 열 블록)에 10 분 동안 37 ° C에서 그들을 품 어.</li>
	<li>튜브 (3.2 단계)에서 열된 건조 목욕 (그림 3A)에서 15 분 100 ° C에서 품 어. 주의: 증발 및 응축 열 단계 동안 발생, 이후 1.5 mL 원심 분리기 튜브 완전히 덮인 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>10 미 믹스 10 s, 및 18,534 x g 10에서 스핀 터치 활성화 모드와 동 믹서에 튜브를 삽입 하 여 페이지 설정에 대 한 18,534 x g 에서 3.3 단계에서 열 처리 페이지를 회전 s 다시. 참고:가 열된 살 균 소 샘플 잘 혼합 되도록 스핀-믹스-스핀 사이클이입니다.</li>
	<li>밤새 실험 벤치 또는 냉장고에서 4 ° C에서 저장소에 그들을 떠나는 하 여 실 온 (RT)에서 샘플 튜브를 식혀. 참고: 실험은이 단계에는 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 정량 Pcr 반응 준비
참고: 한 PCR 반응 한 샘플입니다. 각 PCR 반응 포함 5 µ L 정량 마스터의 믹스 (자료 참조), 5 µ M 뇌관 쌍 믹스의 1 µ L, H2O 2 µ L, 2 µ L 열 처리 T7 페이지 샘플의. 다중 PCR 반응에 대 한 살 균 소 샘플을 제외 하 고 모든 시 약 한 1.5 mL 튜브에 혼합 됩니다. 각 시에는 프리 믹스의 볼륨 정량에 대 한 살 균 소 견본의 수에 따라 달라 집니다.
<ol><li>알 수 없는 농도의 10 biopanned 페이지 샘플 및 3 중에서 표준 농도의 7 샘플에 대 한 정량 프리 믹스를 준비 합니다. 그 결과, 51 총 샘플 및 따라서 51 정량 반응 (즉, 샘플 당 하나의 반응) 있다. 51 반응에 대 한 255 µ L 정량 마스터 믹스 (51 x 5 µ L), 뇌관 (51 x 1 µ L)의 51 µ L 및 H2O의 102 µ L의 (2 µ L x 51)의 프리 믹스를 준비 합니다. 참고: 그것 aliquoting 96 잘 정량 플레이트의 각 음에 PCR 혼합 하는 동안 볼륨 손실에 대 한 보상을 몇 가지 추가 PCR 반응 준비 하 고 좋습니다.</li>
	<li>Aliquot 8 µ L 51 우물 (즉, 51 정량 반응)의 총에 대 한 정량 96 잘 접시의 각 음에 PCR 프리 믹스의. Aliquoting 중 팁을 변경할 필요가 있다.</li>
	<li>열 처리 T7 페이지 샘플 (단계 3.4)의 2 µ L 또는 T7 페이지 참조 DNA (단계 2.1) 각 잘 (그림 3B);를 추가합니다 교차 오염을 방지 하기 위해 잘에 다른 DNA 샘플을 추가할 때 팁을 변경 합니다. 또한, 정량 프리 믹스 (즉, 8 µ L PCR 섞으로은)의 표면 아래에 2 µ L DNA 샘플 분배.</li>
	<li>접착 필름으로 정량 접시를 봉인. 참고:이 단계는 중요 한 정량 접시의 유형에 관계 없이. 권장된 키트를 사용 하 여 완전히; 접시를 봉인 그렇지 않으면, 모든 봉인 지역 접시에 PCR 동안 볼륨 손실 하면 사이클링.</li>
	<li>형광 photobleaching를 최소화 하기 위해 알루미늄 호 일 정량 플레이트 랩 고 정량 장비에 그것을 실행.</li>
</ol>5입니다. 정량 사이클링 조건
참고: 정량 자전거 조건 설정 했다 특정 정량 장비에 ( 재료의 표참조).
<ol><li>정량 Pcr 장비에서 정량 96 잘 접시를 실행 합니다. 장비, 다음과 같은 실험 조건 (그림 3C)를 설정 하는 메뉴에서 설정을 선택 합니다.</li>
	<li>사이클링 다음과 같이 10 µ L의 샘플 볼륨에 대 한 조건 설정: 2 분 50 ° C에서 하나 주기 2 분 동안 95 ° C에서 하나 주기 다음의 40 주기 (15 95 ° C s, 1 분 동안 60 ° C). 용융 곡선 설정 후, 실행: 15 s, 1 분 동안 60 ° C 및 95 ° C 15 s 95 ° C의 1 개 주기.</li>
	<li>6 단계에 설명 된 대로 데이터를 분석을 진행 합니다.</li>
</ol>6. 정량 원시 데이터를 분석 하 고 변환 정량에서 Ct 값 gc / µ L을 t 7 살 균 소에 대 한
<ol><li>원시 정량 데이터를 분석 하 고 원시 데이터 (그림 4)의 독특한 플롯을 분석 하 여 데이터 품질을 평가 합니다. 참고: 증폭 플롯, multicomponent 줄거리 및 용융 곡선 작 키 특성을 정량의 데이터 품질을 검사할 플롯 됩니다.</li>
	<li>
표준 곡선 (2.1 단계)의 각 농도에서 triplicate 샘플에서 평균 임계값 주기 (Ct) 값 계산 합니다.
	<ol>
<li>평균 Ct (Y)에 대 한 로그 (gc / µ L) (X) Y 선형 곡선을 플롯 kX + b = (k는 선형 곡선의 기울기, b는 절편).</li>
		<li>계산 하는 선형 계수14 R2 (R2 가 되어야 합니다 &gt; 0.99).</li>
	</ol>
</li>
	<li>사용 하는 표준 곡선 Y = kX + b gc / µ L (그림 5)에서 biopanning 샘플 (즉, 페이지 CF 같은 점액에 대 한 선택) T7 페이지의 수를 계산 하. 참고: k 표준 곡선의 기울기 이다.</li>
	<li>증폭 효율을 계산 하는 다음 수식으로 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq2.jpg">(2) 참고: k 참조 DNA 정량에서 생성 된 표준 곡선의 기울기 이다. 증폭 효율의 이상적인 범위 90-110%입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11848876">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li>
<li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+technologies%3A+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li>
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<li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li>
<li>T7Select Biopanning Kit. , Millipore Sigma. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP ">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP </a> (2018).</li>
<li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21116397">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemitry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li>
<li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29180282">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li>
<li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro%2C+Oropouche%2C+and+oropouche-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li>
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<li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

우리 살 균 소 게놈 DNA5, 계량을 정량 방법을 개발 하 고 우리가 여기 설명 T7 페이지 CF 같은 점액 장벽에 대 한 선정을 열거 하는 정량 방법을 적응. 간행물의 양적 실시간 PCR 실험 (MIQE) 지침에 대 한 최소 정보 개발 T7 페이지15의 열거에 대 한 정량 방법의 유효성을 검사 하 적응 했다. 우리는 biopanning 실험에서 페이지 척도를 개발 하는 프로토콜은 시간 효율적, 안정적이 고 경제적인 방법입니다. 정량 샘플 준비를 위해 우리의 프로토콜만 살 균 소 솔루션의 높은 온도 치료 (100 ° C, 15 분)을 사용 하 고 살 균 소 DNA 추출 및 정화 단계 기존의 전략11,17,에 비해 요구 하지 않았다 18. 또한, 살 균 소 입자, 더 정확 하 ...

살 균 소 (살 균 소) 디스플레이 기술, 1985 년, 조지 스미스에 의해 개발은 대상 또는 세포 막, 질병 항 원, 세포 세포 또는 특정 수용 체에 대 한 펩 티 드 또는 단백질 ligands를 식별 하는 강력한, 높은 처리량 접근 장기 고 지난 2 년간1,2조직. 여기, polypeptides 또는 단일 체인 항 체의 임의의 라이브러리 페이지 (일반적으로 M13 또는 T7)의 외 투 단백질에 표시 되 고 특정 ligands 고정된 단백질에 생체 외에서 또는 vivo에서 이동에서 확인할 수 있습니다. 반복 선택 과정을 통해 생물 시스템입니다. 다음, ligands 질병3,4의 진단 및 치료에 대 한 이미징 또는 치료 에이전트와 결합 될 수 있습니다. 그것은 정확 하 게 biopanning의 여러 단계 중 페이지를 열거 하는 중요 한: (1) 계량 기판에 바인딩할 페이지 (2) 하 고 선택의 각 라운드 농축 인지 확인 하려면 페이지를 계량 (살 균 소 농축 나타냅니다 biopanned 살 균 소 선호도 대상에 대 한)입니다. 정량화, 더블 레이어 패 분석 결과, 현재 금 표준에는 여러 과제가; 그것은 지루한, 성가신, 잠재적으로 많은 수의 샘플에 대 한 부정 확 한입니다. 따라서, 우리의 그룹 T7, M13 살 균 소 입자 biopanning5에서 열거 하는 민감한, 재현 하 고, 정확 하 고 효율적인 시간 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 방법을 개발 했습니다.
정량 Pcr T7 및 M13 페이지를 정확 하 게 계량 하는 매력적이 고 실현 가능한 방법 이다. 때문에 각 개별 살 균 소 입자 (dsDNA 또는 ssDNA) 게놈 DNA의 복사본을 하나 포함할 수 있습니다, 한 살 균 소 게놈은 한 살 균 소 입자; 살 균 소 게놈의 수를 측정, 페이지의 수를 정할 수 있다. 정량, 형광 기자 중 염료 비 특히 살 균 소 게놈 DNA 바인딩 또는 PCR 증폭, 동안 시퀀스 특정 뇌관 그리고 형광을 통해 구체적으로 신호 증폭의 각 라운드 증가. 형광 신호 그 라운드/사이클 확대의 임계값에 도달 하는 때 임계값 주기 (Ct)으로 유명 하다. 참조 살 균 소 DNA의 알려진된 농도 표준 곡선을 설정할 Ct 값에 대 한 구성 됩니다. DNA 샘플의 Ct 값으로 표준 곡선을 사용 하 여 페이지의 농도 보간됩니다 수 있습니다.
동안 수많은 전략 이전 개발 되었고 페이지 biopanning에서 척도를 광범위 하 게 사용, 그들 각각의 구체적인 과제는. 가장 인기 있는 하 고 기존의 방법은 더블 레이어 패 분석 결과입니다. 여기, 호스트 박테리아 감염 페이지 직렬 희석에 준비 된, 고체 agar 기판에 도금 및 천;와 겹쳐 페이지 수 플 라크 형성 (즉, 플 라크 형성 단위 또는 pfu) 한 천 배지에서의 열거 됩니다. 상 패 분석 결과 이며 민감한 하지만 지루한, 시간이 정확 하지 않은, 특히 많은 예제와 높은 농도5. 또한, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA) T7, M13 살 균 소 입자6,7,8열거 적응 되었습니다. 여기, 페이지 다른 희석에 묶여있다 고 고체 기판 (즉, 한 미 판), 살 균 소 특정 항 체를 탐지 캡처하고 기자 (예를 들어, 효소 민감한 비 기판, fluorophores)를 사용 하 여 검색 현재 살 균 소 입자의 수를 결정 합니다. 샘플의 정보 (예를 들어, 형광, 흡 광도) 알려진된 농도에서 살 균 소 표준에 대 한 알 수 없는 농도 척도를 사용할 수 있습니다. 살 균 소 기반 ELISAs 개발 되었습니다 하지만 그들은 잠재적인 제한 다른. 한 그룹 개발 종이 기반 샌드위치 ELISA를 7 배나 (10-1029 pfu/mL); 부 량 범위 그러나,이 방법은 항 체 코팅의 여러 단계를 필요한 그리고8분석 결과 대 한 전체 하루에 최대 했다. 우리의 그룹 또한 M13 살 균 소 입자를 계량 하는 ELISA 방법 개발 했지만 10의 덜 민감한 감지 범위6  1011 pfu/mL5. M13 열거 하 전환 란타넘족 형광 프로브를 개발 하 고 20 분; 내 부 량 데이터를 얻을 수 있습니다. 그러나,이 분석 결과 10의 좁은 동적 범위 1012 pfu/mL99 . 한 그룹 솔루션, M13 살 균 소 입자를 열거할 원자 힘 현미경 검사 법을 사용 하지만이 고급 전자 현미경 필요 농도10의 좁은 범위 내에서 일했다. 또 다른 연구 형광 M13 및 T4 기자 페이지를 트랩 및 형광 방울; 수로 페이지를 단 분산 유화 제 사용 그러나,이 접근은 또한 10에서 좁은 부 량 범위 전시 106 pfu/mL112 . 드롭릿 디지털 PCR M13 페이지를 계량 하는 데 사용 되었습니다, 동안이 접근은 전염 성 및 비 전염 성 살 균 소 입자12의 번호를 수 없습니다.
우리의 그룹 최근 정량 방법을 열거 하는 두 개의 서로 다른 형광 기자 염료5를 사용 하 여 혈액-뇌 장벽 세포 모델에 대 한 biopanning에서 식별 T7 및 M13 페이지를 개발 했습니다. 상기 정량화 방법에 비해 정량 방법 개발 되었고 높은 처리량 및 수많은 샘플을 계량 시간 효율적인 DNase와 전염 성 및 비 전염 성 페이지 구분 나 전처리의 수는 살 균 소 샘플입니다. 중요 한 것은,이 이렇게 수 reproducibly 고 정확 하 게 계량 M13 및 T7 biopanning 샘플에서 살 균 소. 살 균 소 정량의 지역에 있는 연구원은 초보자 안내, 여기 우리가 T7 살 균 소 입자 시스테인 제한 된 라이브러리 (CX7C)에서 한 체 외에 낭 성 섬유 증 (CF) 점액 장벽에 대 한 패닝 열거 하는 상세한 정량 방법을 설명 합니다. 이 작품에서 정량 방법 살 균 소 입자와 물, 토양, 및 체액을 포함 하 여 다른 소스에서 biopanning의 다른 종류에서 계량을 확장할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>재료 및 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers for T7 genomic DNA</td><td>IDT</td><td></td><td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td></tr><tr><td>T7 Select packaging control DNA</td><td>EMD Millipore</td><td>69679-1UG</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 96웰 반응 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 마스터 믹스--Power up SYBR Green 마스터 믹스</td><td>Applied biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4313663</td><td></td></tr><tr><td>T7Select 415-1 클로닝 키트</td><td>EMD Millipore</td><td>70015</td><td>사용자 프로토콜 : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td></tr><tr><td>DNase I 솔루션</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>24웰 트랜스웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3472</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</ strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Pico 21 마이크로 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002415</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>HERMO SCIENTIFIC 멀티 블록 히터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>모델:2001</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>M-20 마이크로플레이트 스윙 버킷 로터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Real-time PCR 소프트웨어</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>v1.2</td></tr><tr><td>Real-time qPCR primer design</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 pcr

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

이 프로토콜 T7 페이지 페이지 선택 실험 (즉, "biopanning")에서 열거 하 양이 많은 PCR (정량)의 사용을 설명 합니다. 정량은 DNA, 계량에 형광 기반의 접근 그리고 여기, 살 균 소 게놈 살 균 소 입자에 대 한 프록시로 계량에 적응. 이 프로토콜에서 추가적인 DNA 정화 없이 높은 온도 난방을 사용 하 여 손쉬운 살 균 소 DNA 준비 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 열 처리 페이지의 작은 볼륨 및 정량 반응의 작은 볼륨에만 필요합니다. 정량은 높은 처리량 및 빠르고, 처리 하 고 다른 페이지 열거 방법에 2-4 헤 비교에에서 반응의 96 잘 접시에서 데이터를 가져올 수, 정량 시간 효율적입니다. 여기, 정량은 낭 성 섬유 증 같은 점액 모델 생체 외에서 biopanning에서 식별 T7 페이지를 열거 하는 데 사용 됩니다. 정량 방법 척도 biopanning의 다른 종류를 포함 하 여 다른 실험에서 T7 페이지를 확장할 수 있습니다 (예., 단백질 바인딩, vivo에서 움직일 수 살 균 소 심사) 및 기타 소스 (예: 시스템 또는 체액). 요약 하자면,이 프로토콜 DNA 캡슐화 바이러스 척도를 수정할 수 있습니다.

정량 Pcr 뇌관 디자인 다른 뇌관 디자인 도구를 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 뇌관 디자인 프로그램은 그들의 자신의 내장 알고리즘을 계산 하 고 뇌관, 예를 들어, GC %, Tm, 뇌관 이합체 또는 머리 핀 형성 등 의 중요 매개 변수 일반적으로, 주요 기준은 다른 유사 뇌관 설계 도구, 및 뇌관 그들의 지침에 따라 설계할 수 있습니다. 뇌관 폭발 뇌관의 특이성을 확인을 사용할 수 있습니다. 1 개의 뇌관 쌍 게놈 DNA를 그림 1에 나와 t 7의 변수 영역의 상류를 대상. 살 균 소 샘플에서 biopanning, 절대 알 수 없는 농도 결정 하기 위해 정량화 접근-표준 곡선 정량화-살 균 소 게놈 DNA 복사본을 열거 하 선정 되었다. T7 살 균 소 DNA를 참조 (참조 자료) 알려진된 농도에서 0.1 µ g / µ L 직렬 1.0 x 10에서 희석은0 ~...

재현, 정확 하 고 시간이 효율적인 정량 PCR (정량) 방법 살 균 소 T7 열거 하는 여기에 설명 되어 있습니다. 프로토콜에는 살 균 소 게놈 DNA 준비, PCR 반응 준비, 정량 자전거 조건, 및 정량 데이터 분석 명확 하 게 설명합니다.

Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

이 방법은 복잡한 견본 및 박테리오파지 기지를 둔 진단 및 치료에서 박테리오파지의 열거와 관련있는 바이러스학 및 미생물학 필드에 있는 중요한 문제점을 대답하는 것을 도울 수 있었습니다. 이 기술의 주요 장점은 파지 디스플레이 바이오패닝 실험에서 많은 수의 샘플을 시간 효율적이고 정확한 정량화를 가능하게 한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 라시미 모한티와 제 실험실대학원생 인 Jasmim Leal이 될 것입니다.프라이머를 설계하고 재고 농도를 생성한 후, 마이크로리터 당 0.1 마이크로그램의 농도로 참조 T7 파지 DNA를 얻을 수 있습니다. 초순수수를 사용하여 마이크로리터 당 100만 펨토그램에서 0.2 밀리리터 PCR 튜브의 마이크로리터 당 1펨토그램에 이르는 이 DNA를 10배 연속 희석시킵니다. 각 농도의 20 마이크로리터를 준비하여 파이펫 팁을 변경하고 희석의 각 단계 사이에 튜브를 소용돌이치게 하십시오.그런 다음 마이크로리터 당 펨토그램에서 마이크로리터 당 게놈 사본으로 T7 파지 참조 DNA 농도를 변환합니다. 첫째, 시료 T7 파지 클론의 파이펫 200 마이크로리터는 원하는 10개의 샘플 각각에 대해 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 복제한다. 각 튜브에 DNase 의 마이크로리터 2개를 추가합니다.튜브를 캡하고 가열 된 건조 목욕에서 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 가열 된 건조 목욕에서 15 분 동안 섭씨 100도에서 배양하십시오. 10초 동안 18, 534배 g에서 열 처리 파지를 함유한 튜브원심분리기.원심 분리튜브를 터치 활성화 모드로 설정된 소용돌이 믹서에 10초 동안 놓아 파지를 섞습니다. 10초 동안 18, 534회 g로 다시 회전합니다. 그 후, 실온으로 냉각하기 위해 실험실 벤치에 샘플을 약 1 시간 남겨 둡니다.qPCR 프리믹스를 알 수 없는 농도의 10개의 바이오팬드 파지 샘플과 트리플리케이트의 표준 농도 7개 시료에 대해 준비한다. qPCR 마스터 믹스 255마이크로리터, 프라이머 51마이크로리터 및 102마이크로리터의 물을 포함하는 51개의 샘플에 대한 프리믹스가 생성되었습니다. 준비된 PCR의 8마이크로리터를 96웰 qPCR 플레이트의 51개의 웰에 혼합합니다.다음으로 각 우물에 열 처리 된 T7 파지 샘플 2 개를 추가하여 qPCR 프리믹스의 표면 아래에 분배합니다. 접착제 필름을 사용하여 접시를 밀봉하십시오. 알루미늄 호일에 플레이트를 감싸서 형광 사진 표백을 최소화한 다음 qPCR 장비에서 플레이트를 실행합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 사이클링 조건을 설정하고 곡선 설정을 녹입니다. qPCR을 실행하면 증폭 플롯, 용융 곡선 플롯 및 다중 구성 요소 플롯을 원시 데이터에서 분석합니다. 증폭 플롯은 각 샘플의 PCR 증폭이 성공여부를 나타냅니다.다성분 플롯은 증폭 주기 전반에 걸쳐 형광 신호의 증폭 및 붕괴를 나타낸다. 용융 곡선 플롯은 프라이머의 특이성을 검증하는 데 사용되지만 각 PCR 제품에는 고유한 용융 온도가 하나 있기 때문에. 표준 곡선은 참조 DNA에서 생성됩니다.여기서 증폭 효율은 qPCR 연구에서 92.4%의 대표적인 데이터로 계산된 다음 마이크로리터당 10~1,000만 개의 게놈 사본의 테스트 범위에서 이중 층 플라크 분석에 의해 정량화된 동일한 파지에 비교된다. 여기에서 볼 수 있듯이 qPCR 수량의 파지 수는 플라크 분석보다 높습니다. 분산계수에 의해 표현되는 qPCR 방법의 반복성은 이 절차를 시도하는 동안 2.85에서 27.2%에 이르는 값을 갖는 것으로 보이며, 큐PCR의 개발 및 사용에 대한 많은 고려 사항이 있다는 것을 기억하는 것이 중요하며, 신중한 처리 및 시료 준비 및 관련 장비의 교정을 포함하여 파지를 정확하게 정량화하는 것이 중요합니다.이 방법에 따라, 다른 기술은 복잡한 환경 샘플에서 생체 생체 파닝, 파지 라이브러리 DNA 제제 및 차세대 염기 검출에 포함된 다양한 응용 분야에서 파지 입자를 열거하기 위해 수행될 수 있다. 파지는 실험실에서 생물학적 위험으로 간주되며 장갑과 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비와 같은 예방 조치는 절차를 수행하는 동안 항상 착용해야합니다.

quantitative-pcr-of-t7-bacteriophage-from-biopanning

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR

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