Name: 카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 Synthase의 유전자 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 학습하세요 C. arabica L. 세포 현탁액에서 카페인 추출 및 정량화 방법과 카페인 합성효소 효소 활성 평가 기법을 통해 식물 모델에서 카페인 생합성을 이해하는 데 도움이 되는 이 실험 방법을.

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우리 연구소의 작품 SMTHS 하 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (CONACyT 219893)에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 이 연구 또한 CONACyT와 시스테 나시오날 드 Investigadores (4422) RJPK (No. 37938)을 부여한 장학금에 의해 지원 되었다. 저자는이 원고를 작성 하는 동안 그것의 설치의 사용에 대 한 CIATEJ를 감사합니다. 특별 감사 박사 빅토르 마누엘 곤살레스 멘도사 시설에 대 한 분자 생물학 섹션 및 발렌틴 멘도사 로드리게스, IFC, UNAM에서 모든 권장 사항에 대 한이 문서의 촬영 기간 동안 연장 됩니다.

1. C. arabica L.의 셀 정지에서 카페인 추출
<ol><li>C. arabica 셀 정지9를 사용 합니다. 연속 광원 (8.3 W/m2) 25 ° C에서 흔들어 상수 100 rpm 격주 비주류 pH 4.3에서 Skoog와 村 重 매체에 의해 정지를 유지 합니다.</li>
	<li>11 µ m 기 공 필터 종이 부 흐 너 깔때기를 사용 하 여 진공 여과에서 세포를 수확.</li>
	<li>등록 규모를 사용 하 여 수집 된 셀의 신선한 무게, 알루미늄 호 일에 그들을 포장, 액체 질소에서 그들을 멈추게 하 고 분석까지-80 ° C에서 그들을 유지.</li>
	<li>72 h에 대 한 냉동된 세포 자료 lyophilize</li>
	<li>건조 중량 수율을 추정 하기 위해서는 동결 건조 된 셀의 무게를 등록 합니다.</li>
	<li>재사용 가능한 폴 리 에틸렌 봉투 (9 cm x 7.5 cm)에 가루 재료를 저장 합니다. 사용까지 정밀한 분말을 한 desiccator에 게 자료를 macerate.</li>
	<li>분석 규모 건조 세포 물질의 0.5 g을 측정 하 고 유리 플라스 크 (25 mL)에 그것을 추가.<ol>
<li>동결 건조 된 셀에 아세톤 10 mL을 추가 하 고 30 대와 동 믹서에서 혼합 균질에 대 한 s. 다음, 플라스 크 알루미늄 호 일로 밀봉.</li>
		<li>회전자를 사용 하 여 5 h를 실 온 (25 ° C)에서 100 rpm에서 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브 및 13000 x g 에서 원심 분리기는 10 분 전송 액체 단계 새로운 튜브에 그것에 감소에 대 한 모든 자료를 전송 증기 두건에서 실 온에서 건조.</li>
	<li>아세톤의 25 µ L로 샘플 resuspend</li>
</ol>2. 얇은 하 여 카페인의 평가 대 한 조건 층 크로마토그래피 (TLC)-Densitometry
<ol><li>이전 resuspended 카페인 추출의 1 µ L 고정 단계에 적용 됩니다. 참고: 실리 카 젤 번호판 (F254) 고정 위상으로 사용 됩니다. 적용 하기 전에 샘플, 번호판 크로마토그래피 챔버에 클로 프롬-메탄올 [9:1 v/v]의 10 mL와 함께 개발 되었다 (14 cm x 12 cm x 9.5 cm), 판 상 온에서 건조 되었다. 샘플 적용 됩니다 컬럼에 플레이트의 특성은 그림 1에 표시 됩니다. 챔버는 접시를 개발 하기 전에 용 매와 30 분 동안 포화 되었다. TLC 판 오염을 피하기 위하여 장갑을 사용 하 여 처리 해야 합니다.</li>
	<li>모바일 위상 cyclohexane 아세톤 [40:50 v/v]의 10 mL와 크로마토그래피 챔버에 TLC를 개발 합니다. 참고:이 혼합 0.34의 보존 팩터 (Rf) 카페인의 분리 수 있습니다.<ol>
<li>상공에서 TLC 판을 제거 하 고 실 온에서 완전히 건조 보자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>짧은 파장의 자외선 빛에 카페인 밴드 시각화 (UV, 254 nm). 소형 UV 램프를 사용 합니다. 또한,이 단계 사용 하 여 UV 보호 고글.</li>
	<li>273에서 densitometry에 의해 카페인 레벨을 계량 nm. 악기는 크로마토그래피 소프트웨어 제어 됩니다.</li>
</ol>3. Ribonucleic 산 (RNA) 절연
<ol><li>1.1 단계와 필터 종이 (11 µ m 기 공 크기) 진공 여과 액에서 세포 정지를 가져가 라.</li>
	<li>필터 종이에서 셀룰러 자료를 수집 하 고 분석 균형에 세포질 물자의 0.5 g으로 무게 알루미늄 호 일에 그것을 포장. 액체 N2샘플을 동결.</li>
	<li>액체 질소로 도자기 박격포에 셀 샘플을 macerate 하 고 RNA 격리 시 약까지 무 균의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 소독 300 ° C에 휩 싸이 다 용광로에서 도자기 박격포 6 h. RNA 격리 시 페 놀, guanidine isothiocyanate 및 다른 구성 요소를 포함.<ol>
<li>살 균 microcentrifuge 튜브 (1.5 mL)에 500 µ L의 샘플을 전송 합니다. 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1)의 300 µ L equilibrated 페 놀 (pH 8.0)의 300 μ를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>와 동 믹서와 샘플을 믹스 하 고 4 ° c.에 15 분 동안 20000 x g 에서 원심</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브를 상위 단계의 300 μ를 전송 합니다. 소 프로 파 놀의 200 μ를 추가 합니다. 1 h-20 ° c.에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>12000 x g 4 ° C에서 10 분 동안에 관을 원심 그리고 액체 단계를 가만히 따르다.<ol>
<li>튜브에 펠 릿을 형성 하기 위하여 에탄올 (70%)의 1 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 12000 x g 에서 centrifuge 그리고 가만히 따르다. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>건조 실 온 (25 ° C)에서 1.5 h에 대 한 샘플. Resuspend diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 25 μ와 RNA 추출 물-물 처리. 참고: RNA 추출 물 0.1% DEPC v/v로 치료 사용 합니다.</li>
</ol>4. Deoxyribonuclease (DNase)와 RNA 사본을의 외피
<ol><li>살 균 microcentrifuge 관으로 총 RNA의 2 µ g 추출 추가 합니다. 10 x 반응 버퍼 (100 mM Tris HCl 25 m m MgCl2, 1mm CaCl2)의 1 μ를 추가 합니다. 1 U / µ L DNase의 1 μ를 추가 합니다.<ol>
<li>DEPC 처리 물으로 10 μ의 최종 볼륨을 반응을. 믹스 샘플, 1 분 동안 짧게 2000 x g 에서 원심 분리기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>50 m m disodium ethylenediaminetetraacetate이 수화물 (나2EDTA)의 1 μ의 추가 함께 반응 중지 하 고 10 분 동안 65 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>Agarose 젤 전기 이동 법으로 RNA의 무결성을 분석 합니다.<ol>
<li>표준 1 %agarose 젤 준비 하 고 핵 산 얼룩 솔루션 intercalating x 3의 1 µ L와 얼룩.</li>
		<li>500 적용 RNA의 ng는 agarose에 젤 고 젤을 실행.</li>
		<li>젤 사진 문서 시스템을 사용 하 여 RNA의 무결성을 시각화.</li>
		<li>의해 역전사 cDNA 합성에 대 한 템플릿으로 RNA 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 보완 Deoxyribonucleic Acid (cDNA) 합성
<ol><li>Microcentrifuge 튜브를 총 RNA의 2.5 μ g를 추가 합니다. 올리고-deoxythymine (dT) 뇌관의 1 μ 더하고 nuclease 무료 물 관 13 μ 최종 볼륨을 채워. 샘플을 혼합 하 고 1 분 동안 2000 x g 원심.</li>
	<li>그리고 2 분 동안 4 ° C에서 65 ° C 5 분에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>역전사 효소, deoxynucleotide 된 (dNTPs) 믹스 (각 dNTP의 10 m m)의 2 μ 및 역전사 (200 U / µ L)의 1 μ에 사용 되는 반응 버퍼 x 5의 4 μ를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 1 분 동안 2000 x g 에서 원심.</li>
	<li>그리고 10 분 동안 70 ° C에서 50 분 동안 45 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>CDNA 농도 UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량.</li>
	<li>중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 대 한 템플릿으로 cDNA를 사용 합니다. 참고: 반응 버퍼 10으로 사용 되었다 (4.1.1 단계) x 5 x 번 집중 (5.3 단계), 각각.</li>
</ol>6. 실시간 양이 많은 PCR (정량) CCS1 유전자 증폭
<ol><li>PCR microcentrifuge 튜브를 5-카-X-rhodamine (ROX)의 Taq DNA 중 합 효소 (0.1 U/mL) x 2, 0.1 μ M의 7.5 μ를 추가 합니다. 참고:는 뜨거운 시작 Taq DNA 중 합 효소 2 x 2 x 집중 솔루션으로 사용 되었다.<ol>
<li>Nuclease 무료 물 5 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>CCS1 (AB086414) 유전자를 증폭 하는 10 μ M 앞으로 역 뇌관의 각 0.75 μ 추가 (앞으로: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3'와 역: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Tubulin에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 별도 반응에 집 유지 유전자로 (앞으로: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3'와 역: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.</li>
		<li>600 추가 cDNA 템플릿의 ng.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 분 및 5 분 동안 95 ° C 하 30 95 ° C의 40 주기 위한 실시간 PCR 시스템에 반응 품 어 50 ° C에서 증폭 반응을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s와 72 ° C 30에 대 한 s.</li>
	<li>50 ° C에서 샘플을 품 어 30 s 및 20 ° C 10에 대 한 s.</li>
	<li>PCR 소프트웨어와 데이터를 분석 합니다.</li>
	<li>2 상대 식 계산-ΔΔCT 방법 설명 Livak 및 Schmittgen (2001)12. 참고: 오염 제거 시 약 또는 확대 뇌관 이합체 DNA 서식 파일 (서식 파일 통제, NTC) 제외한 모든 구성 요소를 포함 하는 컨트롤 반응 분석.</li>
</ol>7. 총 단백질 추출 L. C. arabica 세포 현 탁 액의
<ol><li>중간-기 공 필터 종이 진공 아래 셀 정지를 필터링 합니다.</li>
	<li>1 g 세포 물자의 무게 그리고 알루미늄 호 일에 그것을 포장.<ol>
<li>액체 질소로 샘플을 동결. 정밀한 분말을 얻기 위해 소독된 도자기 박격포에 샘플 macerate</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리 유리병에 샘플을 전송 하 고 2.5 mL의 추출 버퍼 (400 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane 염 산 염 (Tris HCl), pH 8.0, 10 m m β-mercaptoethanol, 5mm 나2EDTA 및 0.5% (w/v) 나트륨 하는데에 추가.<ol>
<li>2 분 동안 소용돌이 믹서에 샘플을 믹스. 참고: 샘플은 단백질 변성을 방지 하기 위해 얼음에 보관 중요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C에서 20 분 20000 x g 에서 샘플 원심 고 극저온 튜브 (2 mL)에 500 µ L aliquots를 전송. 사용까지-72 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
	<li>562에서 샘플의 단백질 농도 측정 표준으로 소 혈 청 알 부 민으로 bicinchoninic 산 분석 결과 사용 하 여 분 광 광도 계에 nm.</li>
</ol>8. 효소 분석 결과 카페인 Synthase에 대 한
<ol><li>200 µ M 샘, 메 틸 [3H]의 4.07 kBq 포함 microcentrifuge 튜브에 반응 혼합물 준비-샘, 200 µ M 브로민, 200 µ M MgCl2및 5 µ M 카페인. PH 8.0에서 100 mM Tris HCl와 200 µ L 볼륨을 증가.</li>
	<li>얼음에 microcentrifuge 관을 유지 하 고 단백질의 밀리 그램 7-9를 포함 하는 수용 성 분수의 볼륨을 추가. 그런 다음, 소용돌이 의해 혼합 하 고 서 모스 탯 목욕/circulator에 30 ° C에서 30 분 동안 품 어. 여러 샘플의 일괄 처리에 대 한 충분 한 시간 30 분의 정확한 기간에 모든 샘플에 대 한 반응을 중지을 주고 1 분 기간에 중복에서 각 샘플을 품 어.<ol>
<li>반응을 중지 하 고 소용돌이 믹서와 샘플을 흔들 다음 클로 프롬의 1 mL를 추가 합니다. 용 매에 방사성 카페인을 제거 하려면 3 분 소용돌이 믹서를 사용 하 여 샘플을 흔들어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 5 분 11000 x g 에서 원심 하 고 신중 하 게 900 µ L의 볼륨을 복구 합니다. 그런 다음, 섬광 튜브 샘플 전송.</li>
	<li>상 온 25 ° c.에 후드에 건조를 완료 하는 데 클로 프롬을 증발 유리병에 섬광 액체의 5 mL을 추가 하 고 샘플을 혼합.</li>
	<li>섬광 카운터에 카페인에 통합 하는 방사능을 분석 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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우리가 현재 여기 카페인 콘텐츠를 평가 하기 위한 최적의 조건, CS 활동 및 수준에서 생체 외에서 식물 조직 배양, C. arabica의 셀 정지 등. 이전 보고서 유지 셀 빛 조사 하 고 문화 매체에 테오 브로민 제제의 존재는 카페인, 카페인 분리 방법을 평가 수의 수준을 높이기 위한 적합 한 매개 변수 확인 반전 단계 고성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC RP)를 사용 하 여. 현재, 셀 정지 생 합성 카페인 공부에 대 한 경제적 장점을 가진 간단 하 고 빠른 방법을 사용 하는 몇 가지 보고 있다. 여기, 대체 평가 사용 하 여 TLC densitometry 셀 추출 물에 카페인의 정량 분석에 대 한 효율적인 카페인에 대 한 분리 방법을 보였다. 셀에 카페인을 평가 하는 문화 셀 보고14,15이전에 테오 브로민 제제를 피드 하는 데 필요한 아니었다.
<p class="jove_co...

카페인은 이다 biosynthesized Coffea1속의 식물 이차 대사 산물. 이 알칼로이드 methylxanthine 가족에 속하는 그리고 그것 병원 체와 herbivores2,3의 부작용에 대 한 역할을 할 수 있기 때문에 화학 공장으로 간주 됩니다. 또한,이 대사 산물은 일반적으로 소모한 전세계4,5커피 음료의 자극 속성에 대 한 책임. 그것의 속성으로 인해 여러 연구 그룹 생 합성 통로 카페인6,7의 놓을 공부에 관심이. 현재, 식물 체 외에서 세포/조직 문화 다양 한 생물과 비 생물 적인 전략8,9에서 카페인 축적을 평가 하기 위한 대체 역할을 합니다.
카페인 생 합성 포함 다음 주문된 N해당 ribose nucleoside에서 7 methylxanthine의 가수분해 릴리스-3-1 위치에서 methylations. 특정 S-adenosyl 메티오닌 (SAM)-종속 N-methyltransferase (NMT) 반면 7, 위치에 메 틸 화를 catalyzes 브로민 synthase (TS) 및 CS 관련에 3-고 1-methylations, 각각, 테오 브로민 제제 생산 및 카페인입니다. 고유한 NMTs를 인코딩 하는 유전자의 연구는 카페인 생산10,11을 조절 하는 메커니즘을 이해 수 있다. N-methyltransferase 활동이 CS 카페인11의 생 합성 통로의 마지막 두 단계를 catalyzes. 커피 나무 묘 목에 그것 보였다 빛 방사선 카페인 생 합성 증가 귀착되는 CS 활동을 증가할 수 있다. 최근에, 우리는 가벼운 방사선 조사에서 C. arabica L.의 셀 정지의 유지 보수는 abiotic 스트레스 요인을 카페인8의 생 합성 통로 영향을 미치는 생산 효과 평가 하기 위한 최적의 조건을 보였다. 이러한 연구에서 얻은 정보 같은 생체 외에서 시스템에 카페인 생 합성 통로의 연구를 극대화 하기 위한 대사 공학 및 시스템 생물학에 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
카페인 생 합성의 연구에 대 한 적합 한 모델의 장점을 감안할 때, 우리 C. arabica L. 셀 정지에 카페인 추출 조건 최적화 그것은 또한 유전자 사본 Coffea 카페인 synthase 1 (CCS1) 인코딩이 효소의 수준을 평가 하기 위한 방법론 단계 뿐만 아니라 효소 활동 공부에 대 한 유용한 프로토콜을 개발할 수 있습니다. 여기, 우리는 추출 하 고 얇은 층 크로마토그래피와 densitometry (TLC densitometry) C. arabica 셀 정지에 카페인을 계량 프로토콜을 보고 합니다.

<table><tbody><tr><td>무라시게 & Skoog 기초 염 혼합물</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>팩 크기: 50 L 시약 (mg/L) 암모늄 나이트레이트 (1650) 붕산 (6.2) 염화칼슘, 무수 (322.2) 염화코발트 & 황소; H2O (0.025) Cupric Sulfate&bull; 5H2O (0.025) Na2EDTA&bull; 2H2O (37.26) 철황산염&황소; 7H2O (27.8) 황산 마그네슘, 무수 (180.7) 황산 망간&황산; H2O (16.9) 몰리브딕산 (나트륨 소금)&bull; 2H2O (0.25) 요오드화 칼륨 (0.83) 질산 칼륨 (1900) 인산 칼륨, Monobasic (170) 아연 황산염 & 황산; 7H2O (8.6) myo-inositol (100) 티아민 (10) 시스테인 (25) 자당 (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)</td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>SIGMA</td><td>C0750-5G</td><td>STANDARD-5g</td></tr><tr><td>Theobromine</td><td>SIGMA</td><td>T4500</td><td>20 g</td></tr><tr><td>CAMAG TLC Scanner-4</td><td>CAMAG</td><td>27.62</td><td></td></tr><tr><td>WinCATS 평면 크로마토그래피 관리자 소프트웨어</td><td>CAMAG</td><td>1.4.10</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>이소아밀 알코올 (24:1)</td><td>SIGMA</td><td>C-0549</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>시클로헥산</td><td>JALMEX</td><td>C4375-13</td><td>1 L</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>J.T. BAKER</td><td></td><td>900643 4 L</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>J.T. BAKER</td><td>9093-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>JALMEX</td><td>C-4425-15</td><td>3.5 L</td></tr><tr><td>TLC 실리카겔 60 F254</td><td>Merck</td><td>1.05554.0001</td><td>TLC 플레이트</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>M6250</td><td>SIGMA</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>(+)-나트륨 L-아스코르브산염</td><td>A4034</td><td>SIGMA</td><td>100 g</td></tr><tr><td>트리즈마 베이스</td><td>SIGMA</td><td>T6066</td><td>1 Kg</td></tr><tr><td>염산 36.5-38%</td><td>J.T. 베이커</td><td>9535-05</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>피어스 BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo scientific</td><td>232227</td><td>키트</td></tr><tr><td>메틸 [3H]-S-아데노실 메티오닌</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155</td><td>15 Ci/mmol</td></tr><tr><td>액체 섬광 바이알</td>의 특정 활성도 <td>SIGMA</td><td>Z253081</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 수조/순환기</td><td>Cole Parmer</td><td>60714</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td> <td>튜브Eppendorf</td><td></td><td>튜브 1.5 mL</td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS23202A</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>원심분리기 5804</td><td>Eppendorf</td><td>5804 000925</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Thermolyne</td><td>LR 5947</td><td></td></tr><tr><td>도자기 모르타르</td><td>Fisherbrand</td><td>FB961B</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman</td><td>Z274844</td><td>Porosity medium</td></tr><tr><td>Picofuge</td><td>Stratagene</td><td>400550</td><td>2000 x g</td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>및</td><td>HR-120</td><td>모델 HR-120</td></tr><tr><td>섬광 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>6500</td><td></td></tr><tr><td>젤 사진 문서화 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemic XRS</td><td>모델 Chemic XRS</td></tr><tr><td>컴팩트 UV 램프</td><td>UVP</td><td>95002112</td><td>UVGL-25</td></tr><tr><td>Scienceware HDPE Buchner 깔때기</td><td>SIGMA</td><td>2419907</td><td>Type 37600 믹서</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Thermo scientific</td><td>15596-018</td><td>200 mL</td></tr><tr><td>ReverdAid 역전사 효소</td><td>Thermo scientific</td><td>#EP0441</td><td>10000 U</td></tr><tr><td>Oligo (dT)18 프라이머</td><td>Thermo scientific</td><td>#S0131</td><td>100 &micro; M</td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free</td><td>Thermo scientific</td><td>#EN0525</td><td>1000 U</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1.25 mL</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Thermo scientific</td><td>R0191</td><td>R0191</td></tr><tr><td>SYBR Green qPCR 마스터 믹스 (2X)</td><td>Thermo scientific</td><td>K0251</td><td>25 &micro의 200 회 반응; L</td></tr><tr><td>PikoReal</td><td>Thermo scientific</td><td>2.2</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>페놀, pH 8.0, 평형, 분자 생물학 등급, 초순수</td><td>USB</td><td>J75829</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>Karal</td><td>2040</td><td>1 L</td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>SIGMA</td><td>64175</td><td>1 L</td></tr><tr><td>디에틸 피로카보네이</td>트 <td>SIGMA</td><td>D5758</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>실험실 회전자</td><td>LW 사이언티픽</td><td>Mod. LW210</td><td></td></tr></tbody></table>

카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 synthase의 유전자 발현

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

카페인 (1,3,7-trimethylxanthine)은 커피와 차 등 인기 있는 음료에는 퓨 린 알칼로이드 이다. 항균 성 활동은 자연 살충제로 간주 됩니다 때문에이 2 차 대사 산물 화학 방어로 간주 됩니다. 카페인 또한 주변 식물의 성장을 방지 하는 부정적인 allelopathic 효과 생성할 수 있습니다. 또한, 전 세계의 사람들이 그것의 진통 및 stimulatory 효과 대 한 카페인 소비. 때문에 카페인의 기술 응용 프로그램에 대 한 관심,이 화합물의 생 합성 통로 대 한 연구는 성장 했다. 이러한 연구는 카페인의 생 합성을 조절 하는 생 화 학적 및 분자 메커니즘을 이해에 주로 집중 했다. 조직 문화를 체 외에서 이 생 합성 통로 공부에 대 한 유용한 시스템 되고있다. 이 문서는 C. arabica L. 그것의 활동의 셀 정지에 카페인 synthase (CS) 인코딩 유전자 (CCS1)의 증명서 수준 측정에 대 한 카페인의 정량화에 대 한 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

여기에 제시 된 과정을 통해 얻은 카페인 추출 쓰는 그림 1에 표시 된 스키마에 따라 착 색 인쇄기 격판덮개를 샘플 하 여 TLC densitometry에 의해 분석 되었다. 이 화합물은 상업 표준의 다양 한 농도와 세포 추출 물에는 카페인, 곡선의 수준을 계량 (그림 2A)를 사용 합니다. 카페인에 대 한 흡 광도의 패턴 가시 광선 스펙트럼 (UV-VI) 273에서 최대 흡수 피크를 사용 하 여 분석 되었다 (그림 2B), 및 TLC 판에 카페인의 피크 분리 0.34 0.39 (그림 2C) 사이의 Rf 보였다.
이 프로토콜을 사용 하 여 평가 하는 카...

이 프로토콜 추출 및 C. arabica L.의 셀 정지에 카페인의 정량화에 대 한 효율적인 방법론과 식 수준으로 카페인 synthase의 효소 활동을 평가 하기 위한 실험 과정에 설명 합니다. 이 효소를 인코딩하는 유전자.

카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 Synthase의 유전자 발현

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

이 방법은 분석 화학, 생화학 및 생명 공학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 카페인 생합성에서 발생하는 변화는 무엇입니까. 이 기술의 주요 장점은 카페인을 생산하는 인비트로 식물 모델에 적용 될 수 있다는 것입니다.시작하려면, lyophilized 세포에 아세톤의 10 밀리리터를 추가하고 30 초 동안 소용돌이 믹서와 혼합하기 전에 플라스크를 밀봉. 그런 다음 100 rpm에서 실온에서 5 시간 동안 회전기와 샘플을 혼합합니다. 그 후, 아세톤의 25 마이크로리터로 샘플을 다시 중단한다.먼저 이전에 준비된 카페인 추출물의 마이크로리터 1개를 실리카 젤 플레이트에 바부합니다. 이어서, 발동상, 사이클로헥산 아세톤의 10밀리리터를 가진 크로마토그래피 챔버에서 TLC를 개발한다. 컴팩트한 UV 램프로 짧은 파장 자외선으로 카페인 밴드를 시각화합니다.그 후, 273 나노미터에서 밀도에 의해 카페인 수준을 정량화. 필터 용지를 사용하여 이전에 준비된 셀 서스펜션을 진공 필터로 사용합니다. 이어서, 도자기 박격포를 사용하여 액체 질소 및 RNA 격리 시약으로 세포 샘플을 균질화할 때까지 메이케레이트한다.다음으로, 시료의 500마이크로리터를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 이송한다. 그런 다음 클로로폼 이소아밀 알코올 300 마이크로리터와 평형 페놀의 마이크로리터 300을 추가합니다. 샘플을 섭류 믹서와 원심분리기와 혼합하여 섭씨 4도에서 15분간 20, 000G로 섞습니다.그 후, 상부상 마이크로리터 300마이크로리터를 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 이송한다. 그런 다음 200 마이크로리터의 이소프로판올을 추가하고 음의 섭씨 20도에서 1 시간 동안 튜브를 배양합니다. 펠릿에 에탄올 1밀리리터를 넣습니다.이어서, 12, 000G에서 튜브를 원심분리하고 10분 동안 액체 상을 감소시한다. 다음으로 실온에서 1.5시간 동안 시료를 건조시합니다. 이어서, DEPC 처리된 물의 25마이크로리터로 RNA 추출물을 다시 중단한다.먼저 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 총 RNA 추출물 2마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 10X 반응 버퍼의 마이크로리터 1개와 DNase의 마이크로리터 1개를 추가합니다. DEPC 처리 된 물로 10 마이크로 리터에 반응의 최종 볼륨을 가져옵니다.그런 다음 시료와 원심분리기를 2, 000G에서 1분간 섞는다. 다음으로 샘플을 섭씨 37도에서 30분간 배양합니다. 그 후, 50 마이크로몰라 디소이소르 에틸렌 디아민 테트라아세테이트의 1개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중단합니다.샘플을 섭씨 65도에서 10분간 배양합니다. 그런 다음 아가로즈 젤에 100 나노그램의 RNA를 적용하고 젤을 실행합니다. 젤 사진 문서화 시스템을 사용하여 RNA의 무결성을 시각화합니다.첫째, 마이크로 원심분리기 튜브에 총 RNA 2.5 마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 올리고 데옥시티미드 프라이머의 마이크로리터 1개를 추가하고 뉴클레아제 없는 물로 13마이크로리터의 최종 부피에 튜브를 채웁니다. 샘플을 혼합하고 원심분리기를 2, 000G에서 1분간 섞습니다.샘플을 섭씨 65도에서 5분간 배양합니다. 그리고 2 분 동안 섭씨 4도에서. 다음으로, 5X 반응 버퍼의 4개의 마이크로리터, dNTP 믹스의 2개의 마이크로리터 및 시료에 역 전사제 1개를 추가합니다.그런 다음 샘플을 2, 000G에서 1분 동안 부드럽게 섞습니다. 그 후 샘플을 섭씨 45도에서 50분간 배양한 다음 섭씨 70도에서 10분간 배양합니다. PCR 마이크로 원심분리기 튜브에 2X Taq DNA 폴리머라제 7.5 마이크로리터와 RAX 0.1 마이크로몰레를 추가합니다.그런 다음 CCS1 유전자를 증폭시키기 위해 각각 0.75 마이크로리터를 앞뒤로 프라이머를 첨가합니다. 이 후, 추가 600 CDNA 템플릿의 나노 그램. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실시간으로 증폭 반응을 preform.그런 다음 PCR 소프트웨어로 데이터를 분석합니다. 셀룰러 재료 1 그램을 계량하고 알루미늄 호일에 포장하십시오. 샘플을 추출한 후 유리 바이알로 옮기고 2.5 밀리리터의 추출 버퍼를 추가합니다.다음으로, 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 20, 000G에서 원심분리합니다. 500 개의 마이크로 리터 알리쿼트를 극저온 바이알로 옮기. 분광광계를 사용하여, 소 세릭 알부민을 표준으로 사용하여 562 나노미터에서 시료의 단백질 농도를 측정합니다.먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 마이크로 원심분리기 튜브에서 반응 혼합물을 준비한다. 그런 다음 총 부피를 100 밀리머 트리 HCL로 200 마이크로리터로 늘립니다. 방사성 물질과의 반응 혼합물을 준비하는 동안 자신의 안전이 적절한 예방 조치를 따르는 것이 필수적이라는 것을 기억하십시오.마이크로 원심 분리기 튜브를 얼음에 보관하고 7~9밀리그램의 단백질을 함유한 수용성 분획의 양을 추가합니다. 그런 다음 혼합물을 소용돌이쳐 30°C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 샘플을 11, 000G에서 5분간 원심분리합니다.이어서, 900 마이크로리터의 부피를 조심스럽게 회수하고, 샘플을 신자극 병으로 옮는다. 다음으로, 실온에서 후드의 건조를 완료하기 위해 클로로폼을 증발시다. 바이알에 5밀리리터의 신경유를 추가합니다.마지막으로, 신경화 카운터를 사용하여 카페인에 통합된 방사능을 분석합니다. 이 프로토콜에서, 카페인에 대한 흡광도의 패턴은 TLC 밀도를 통해, 가시광 스펙트럼을 통해, 273 나노미터에서 최대 흡수로 판독되었다. TLC 플레이트에 카페인의 분리 곡선은 0.34에서 0.39 사이의 RF를 보였다.중단된 세포에서 유래된 RNA는 28s, 18s 및 5s RRNA 서브유닛의 명확한 분리를 나타내며, 이는 샘플이 고품질임을 나타낸다. 마지막으로, 카페인 신체 유전자에 대한 단일 증폭 생성물을 보여주는 QPCR 분석에서 용융 곡선을 얻었다. 개발 후, 이 기술은 커피, 차 및 코코에서 이차 대사 조직 문화를 탐구하는 생명 공학 및 생화학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.방사능 및 분자 병리학을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 방사성 물질에 대한 장갑, 고글 및 특수 장비의 사용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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