Name: 단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 학습하세요 단일 분자 힘 분광학을 위한 단백질 화학적 고정 방법을. 이 기법은 원자력 현미경을 활용하여 단백질 상호작용을 정밀 측정하며 생물물리학 연구에 필수적인 도구입니다.

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TB와 HG 유럽 연구 위원회 "Cellufuel, 고급 보조금 번호 294438"를 통해 재정 지원을 인정 한다. SS 금융 인정 HCS 인정 교육 및 Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt)를 통해 연구에 대 한 연방 정부에서 재정 지원, 과학 교육에 대 한 바이에른 주 교육부에서 지원 통해 연구 초점 "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe-캔터". 우리는 기술 지원에 대 한 코니 Hasselberg-크리스토프와 마르티나 Hörig 감사

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저자는 공개 없다.

AFM의 도입 기반을 SMF, 그것을 직접 내 고 intermolecular 개별 단백질, 핵 산 및 다른 생체3,,45의 널리 사용된 기법으로 진화. 성공적인 SMF 실험에 대 한 전략을 결합 하는 적절 한 표면 필수입니다. 천연 및 합성 폴리머에 intramolecular 힘을, 중합체는 기판 표면 및 AFM 팁36,,3839,40,41직접 결합 될 수 있습니다. 그러나 분자 채권 등 간 분자 상호 작용의 수사를 위해, 그것입니다 이종 bifunctional 못 링커 등 polypeptide 사슬, 유연한 링커 분자 AFM 팁을 상호 파트너를 연결 하 고 수 있도록 바인딩 파트너의 올바른 방향에 대 한 단거리 표면 힘을 극복 하 고 변성 그리고 단백질21,,2223의 전개를 피하기 위해 기판 표면 24,25,26,,2742. 우리 따라서 이종 bifunctional 못 스페이서를 사용 하 여 그들의 접근 주 아민 통해 단백질의 화학식 동원 정지에 대 한 간단 하 고 곧장 앞으로 프로토콜을 설명 합니다.
우리가 그것의 적용을 보여주는 상호 작용의 수사 adhesin 미 균 에서 RrgA와 세포 외 기질 단백질 Fn, 사이 힘 최근에 자세히 설명 다른 곳13.
표면 화학 잘 설립 하 고 분석 하 고 유사한 접근 여러 SMF 실험19,,4243,44,45에서 성공적으로 사용 되었습니다. 표면에 폴리머 실 란 커플링 사용 하는 silylether는 가수분해. 가수분해의 정도 silanization 과정에서 통제 될 수 있다 형성된 된 실록 산 결합의 금액에 따라 달라 집니다. 높은 상호 작용 힘 (≥ 1000 pN)는 SMF 측정 하는 동안 예상 하는 경우는 silanization 수행 통해 -기상 증 착30 낮아집니다의 지속적인 층의 형성 귀착되는 해야 합니다. 많은 실험 (예를 들어, 많은 단백질-단백질 상호 작용), 상호 작용 힘 몇 백 pN 및 설명된 절차는 실록 형성 수성 단계에서 증 착에 의해 실시 및 언바운드의 범위에는 유기 실 에탄올 (단계 1.1.7) 열 (단계 1.1.8) 치료 다음 씻어 신중 하 게, 충분 하다.
또 다른 중요 한 단계 나머지 EDC를 세척 하 고 보 건국 분자 표면 (1.2.3 단계)에서 남은 단백질에 carboxyl 그룹의 활성화로 이어질 것입니다. 이 기능을 변경할 수 있습니다 동일한 표면에 단백질의 가교에서 어느 결과 또는 몇 반대 표면에 다른 단백질에 단백질을 활성화 하는 covalently. 이 단백질 표면 사이의 도메인 전개 동반 가능성이 높은 파열 힘 귀착되는 AFM 팁의 클램핑 이어질 수 있습니다 ( 그림 3b, 추적 1, 4 및 5 참조 Fn 도메인의 전개)46. 못 스페이서의 활성 NHS 에스테 르는 불포화 경우 같은 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서, Tris 버퍼 식 염 수를 가진 외피는 좋습니다 (단계 1.2.6), 트리 스의 1 차 아민 냉각 나머지 아미노 반응 그룹으로.
Silanized 유리에 Fn의 균일 분포를 리드 stepwise 프로토콜에 따라 표면 ( 그림 2참조), 단백질의 dimeric 형태를 떠나. 이 솔루션에서 Fn´s 구조를 닮 고 다른 샘플 표면37에 이전 AFM 데이터와 일치. 또한, AFM 팁에 RrgA의 적절 한 농도, 얻어진 다는 SMF 측정 (그림 3 및 그림 4) 동안 잘 정의 된 상호 작용 이벤트 ~ 20%의 대상 값을 생성. 또 다른 우아한 방법은 다양 한 단백질 농도 및 부 화 번 외 샘플 기판 및 캔틸레버 끝에 결합 하는 분자의 양을 제어 실-대리인 다른 보조 기능 그룹의 조합입니다. 못-폴리머에서 연장 하는 단백질 반응 그룹의 비율을 변경 하 여 고정된 단백질의 수는 제어15,16,,1718수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 또한 다른-NH2 포함 된 분자를 무력화 하거나 유리 및 실리콘 질 화물 외 다른 실리콘 산화물 표면에 몇 단백질 조정 사용할 수 있습니다. 단백질 디자인 따라 아민 반응 carboxyl 그룹으로 변경할 수 있습니다 통해 단백질 하 sulfhydryl 반응 그룹 (예를 들어, maleimide 또는 pyridyl 직교 이황화) 무료-SH 그룹. Fn,이 미리 정의 된 방향13,,1720결과.
요약 하자면,이 프로토콜 다른 요구 사항을 제공 하기 위해 조정 될 수 있다 고 단일 분자 힘 분광학 실험 외 다른 생물 응용 프로그램에 적합 합니다.

광학 및 자기 핀셋, 옆에 원자 힘 현미경 (AFM)1,2 유용한 도구를 분석 하 고 분자 조작으로 떠오르고 있다 및 그들의 속성 및 기능, 외부 힘3에 그들의 응답을 포함 하 여 조사 ,4. 반면 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 같은 방법, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 또는 석 영 크리스탈 중량 (QCM) 설정, AFM 수 단일 분자 (SMF)5 및 단일 셀 수준 (SCFS)6에 상호 작용을 측정 하 . 이러한 기술은 나왔고 캐치 채권 S. 구 균에서에서 Fn 바인딩 단백질에 의해 형성 된 대장균 pilus 단백질만 노 오 스7, 또는 협동 β-지퍼 FimH 반복의 상호 작용에 대 한 발견 처럼 바인딩 메커니즘에 대 한 값진 통찰력 바인딩 Fn8시. 최근 pilus-1 adhesin RrgA9,10 그람 양성 박테리아 구 균 (S. 균)11 에서 fibronectin12 에 바인딩할 수는 보여줄 수 있었습니다. 와 그것의 2 개의 터미널 도메인. 이 새로운 2-도메인 바인딩 메커니즘을 탠덤 β-지퍼에서 다른 고 수 있습니다 형성 하 고 유지 과도 fibronectin 포함 된 연락처 호스트 표면13piliated pneumococci는 밝혔다.
SMF 실험의 성공을 비판적으로 고체 표면 및 AFM 팁에 생체의 기능 및 기본 동원 정지에 따라 달라 집니다. 높은 힘 SMF 측정 하는 동안 발생할 수 있습니다, 단백질 해야 선호 covalently 결합 표면에. 많은 단백질 등의 생체는 물론 (무기) 고체 표면, 나노 입자와 문학14,15에서에서 설명 하는 다른 장치에 전체 셀의 동원 정지에 대 한 다른 연결 방법 ,16,17,18,19,20,,2122,23,24, 25,,2627. 이러한 프로토콜은 자주 확인 유해 물질의 사용, 수행 및 특수 장비 (예를 들어, 플라즈마 클리너)를 필요로 하기 어렵습니다. 한쪽에 silane 반응 그룹 및 그들의 다른 쪽에는 아민 반응 그룹 heterobifunctional crosslinkers의 두꺼운 폴리머 레이어를 연결할 몇 분자 유리를 하는 간단한 방법이입니다. 어플리케이션, 커플링 에이전트 가변 길이, 예의 유연한 하이드로-탄소 사슬을 함유 할 수 있다., polyethylenglycol (나무 못). 그들은 수정 된 표면 (예를 들어, 소수 성, 정전기 그리고 van der Waals 상호 작용)의 일반적인 상호 작용을 억제 하 고 결합 된 분자 회전 자유를 제공할 수 있습니다.
여기, 우리는 공유 결합을 포함 하는 하나 이상의 무료 아미노 그룹 단백질의 일반적인 프로토콜 설명 (-NH2) 유리를 표면 및 실리콘 나이트 라 이드 AFM 팁 통해 는 heterobifunctional ethoxy silane 못 carboxyl (-COOH). 이 프로토콜은 RrgA와 세포 외 기질 단백질 Fn의 상호 작용에 따라 궁 행 하는 SMF 실험, 사용할 수 있습니다 (에 대 한 개요 그림 1 참조).
첫 번째 단계는 표면28,29,,3031의 silanization 이다. 그것은 반응성이 매우 높은 SiOH 그룹을 형성 하기 위하여 커플링 에이전트의 ethoxy 그룹의 가수분해를 포함. 이 기판에 SiOH 그룹으로 반응 수 있습니다. 기본 응축에, 이러한 silanols 양식 수소 결합을 기판에 확산 있습니다. (요구 하는 일반적으로 열 또는 물을 제거 하는 진공) 보조 응축 반응, 실록 산 결합 형성 된다. Covalently 연결 된 유기 실 란 계층 결과.
두 번째 단계는 단백질 기능을 결합 (-COOH) 폴리머32에서 확장 하는 그룹. 첫째, 산 성은 반응 N-hydroxysuccinimid (NHS) 에스테 르 중간, 기초가 튼튼한 보 건국/EDC를 통해 얻은 변환 됩니다 (1-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid 화학33 및 대체를 겪 습 및 마지막으로 단백질에 1 차 아민과 아 미드 유대를 형성 한다.
이 방법에서는, 실리콘 질 화물 AFM 팁 및 무작위 방향에서 유리 기판에 인간의 Fn RrgA 결합 했다 그리고 그들의 상호 작용 힘 단일 분자 수준에서 분석 했다. 우리의 결과 설명된 표면 화학은 유리 표면에 균일 분포 Fn SMF 측정 중 상호 작용 이벤트의 최대 20%의 대상 값에 의해 명백한 끝에 RrgA의 적절 한 농도를 보여 줍니다. 이 화학 일반적인 배경 상호 작용을 감소, 데이터 수집 기간 동안 작은 변경 적용 이며 따라서 무척 정확한 SMF 실험에 적합.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100%; 분석적인 순수성</td></tr><tr><td>이중 증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td><td>&ge; 99.8 %; 분석 순도</td></tr><tr><td>Ethoxy 실란 폴리에틸렌 글리콜 산</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa; COOH-PEG-Si (OC2H5) 3</td></tr><tr><td>염산</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr> <tr><td>N-Hydroxysuccinimid</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; 합성 용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>프로브 분자 eg Fibronectin, human plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>프로브 분자 예 : RrgA</td><td></td><td></td><td>실험실에서 생산</td></tr><tr><td>Sodiumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris (hydroxymethyl) -aminomethan</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td> <td>&ge; 99,3 %; 트리스; 버퍼 등급</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beakers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass cutter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>불활성 가스 건조제</td><td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경 - Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard SPM 및 DP 소프트웨어</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 오븐</td><td>바인더</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자기 교반기</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 주걱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>브랜드</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 미터</td><td>닉스 파이</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펫</td><td>Starlab</td><td></td><td>10-100 & 마이크로; l, 50-200 &마이크로; 엘, 100-1000&nbsp; &마이크로; l</td></tr><tr><td>정밀 저울</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 질화물 캔틸레버 - MLCT</td><td>Bruker AXS SAS</td><td></td><td>스프링 상수 &le; 100 pN / nm</td></tr><tr><td>초음파 처리 욕조</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염색 항아리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경 - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss Stir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtech 과학 정밀 와이프</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twezzers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>수성 스펙트럼은 254&nbsp입니다. nm</td></tr><tr><td>진공 데시 케이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소용돌이 믹서</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>계량 종이</td><td>칼 로스</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

최근 몇 년 동안, 원자 힘 현미경 (AFM) 단일 분자 힘 분광학 (SMF) 분자 속성 및 기능에 대 한 우리의 이해를 확장을 기반으로. 그것은 우리에 게 자세히 호스트 표면 수용 체에 어떻게 세균 adhesins 바인딩 생물 메커니즘, 예를 들면의 다양성을 탐구 하는 기회를 주었다. 다른 요인 들 중 고체 표면 및 AFM 팁에 대 한 관심의 생체의 기능 및 기본 immobilization SMF 실험의 성공에 의하여 달려 있다. 여기, 우리가 순서로 silane-말뚝-carboxyls와 잘 설립 N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) 화학을 사용 하 여 실리콘 표면에 단백질의 공유 결합에 대 한 간단한 프로토콜 설명 에 세포 외 기질 단백질 fibronectin (Fn)와 그람 양성 박테리아 구 균 (S. 균)에서 pilus-1 adhesin RrgA의 상호 작용을 찾아보기. 우리의 결과 표면 기능화 리드 유리 표면에 균일 분포 Fn SMF 중 상호 작용 이벤트의 최대 20%의 대상 값에 의해 명백한 AFM 캔틸레버 끝에 RrgA의 적절 한 농도를 보여합니다 측정 계시 RrgA 52 pN의 평균 힘 Fn에 바인딩합니다. 프로토콜 몇 사이트를 통해 특정 무료 thiol 그룹을 조정할 수 있습니다. 이 미리 정의 된 단백질 또는 분자 방향 귀착되 고 SMF 외 다른 생물 응용 프로그램에 대 한 적합 합니다.

프로토콜 설명 여기 를 통해 단백질의 화학식 동원 정지에 결과 임의의 방향 (그림 1) 액세스할 수 있는 그들의 1 차 아민. 그림 2 (왼쪽)와 silanized 유리 표면의 AFM 이미지를 보여줍니다 그리고 질소의 부드러운 스트림 아래 샘플의 탈수 후 (오른쪽) Fn 움직일 수 없이 기록. Silane 폴리머 레이어 Fn와 기능성된 표면에만 작은 표면 파형 높이 약 2-5 nm (그림 2, 오른쪽), 동안, 약 10 nm 높은 Fn 분자는 명백한 (그림 2, 왼쪽). 클로즈업, Fn의 dimeric 구조를 인식할 수 있습니다. Fn 분자 말뚝 표면 코팅 위에 4-5 nm의 높이와 길이의 소형 것 같다 ~ 120 nm (삽입 참조).
조사는 최근 자세히 설명 우리의 그룹13, Fn와 RrgA의 상호 작용 힘에 RrgA 실리콘 질 화물 AFM 팁과 유리 기판 (그림 3a)에 인간의 Fn에 결합 했다. 그림 3 샘플 분리 곡선 Fn 1 µ m s-1의 당기 속도에서 기록 된 RrgA의 상호 작용의 대표적인 팁을 보여 줍니다. 사용 된 표면 화학 상호 작용을 낮은 배경 및 체인 (eWLC) 모델 (빨간 곡선) 같은 확장 가능한 벌레를 사용 하 여 장착 했다 (그림 3a), 잘 모양된 (또는 2) 상호 작용 이벤트에. AFM 팁과 기판, 스트레칭 못 링커 (&gt; 70 nm), 일반적인 표면 상호 작용까지 극복 후 보여줍니다 적합 (파열 힘 및-길이 그림 4참조)의 결과 플롯 ~ 19% 힘 곡선의 파열을 보여주었다 말은 파열 된 이벤트 RrgA-Fn의 상호 작용에 대 한 강제 ~ 약 100의 팁-샘플 거리에서 52 pN nm. 반면, 부적당 한 표면 화학 (여기, 염 분 그림 3b버퍼링 트리 스와 냉각 하는 생략) 여러 단백질 바인딩 (추적 2와 3) 난다 상호 작용으로 인해 단일 상호 작용 이벤트에 대 한 명확한 평가 방해 것 이다 / 샘플 표면 및 AFM 캔틸레버 끝 사이의 단백질의 카 하 플 공유 링 높은 파열 힘 (추적 1) 단백질 (Fn) 도메인 (추적 4와 5)의 전개와 함께 가능 하 게이 리드.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> 그림 1: 표면 화학을 통해 개요. Ethoxy silane-말뚝-carboxyl의 가수분해 실록 crosslinks의 형성과 수산화 유리 표면에서의 결로 옵니다. Carboxyl 그룹 EDC의 반응 반응 o-acylisourea, 수성 해결책 (가수분해) 매우 짧은 반감기를 가진 아민 반응 중간 결과. 중간을 겪 습 및 대체 마지막으로 단백질에 1 차 아민과 아 미드 유대를 형성 하는 NHS 에스테 르의 형성에 의해 안정 이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> 그림 2: 동원 정지의 한 유리 기판 통해 heterobifunctional ethoxy silane 말뚝에 fibronectin carboxyl 커플링 에이전트. 기능성된 유리의 AFM 이미지 (왼쪽)와 표면 및 (오른쪽) 없이 Fn. 숫자 (삽입) 기판 표면에 균질 분산 개별 Fn 분자를 나타냅니다. 분자는 말뚝 위에 4-5 nm의 높이 dimeric이 고 컴팩트한 구조 채택 코팅과의 길이 &gt; 100 nm. 이 솔루션에서 Fn의 구조를 닮 고 다른 표면, 예를 들어, 운 모에 이전 AFM 데이터와 일치 (눈금 막대의 상 = 500 nm)37. AFM 아래 이미지는 AFM 이미지에 표시 된 라인을 따라 높이 프로필. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> 그림 3: SMF 실험 및 대표 일러스트 힘 거리 곡선 RrgA-Fn 상호 작용의. (a) RrgA와 Fn covalently 연결을 통해 heterobifunctional ethoxy silane 못 했다 carboxyl 커플링 에이전트 실리콘 나이트 라 이드 AFM 외팔보 팁과 유리 표면, 각각. 대표 SMF 힘 거리 곡선 RrgA-Fn와 상호 작용 수 축력 속도에 1 µ m s-1 의 RrgA와 Fn의 설명된 동원 정지에 대 한 얻은 표시 됩니다. 빨간 곡선 파열 힘 및 길이에 적용 된 확장 가능한 웜 같은 체인 맞는 나타냅니다. 그림은 Becke, 그 외 여러분, ACSnano 201813에서 수정 되었습니다. (b) 대표 SMF 힘 거리 곡선 RrgA-Tris 버퍼와 냉각 없이 Fn 상호 작용에 대 한 얻은 염 분. 이 경우에, 트리 스의 1 차 아민은 결 석 활성 남아 있도록 NHS 에스테 르 남았다 불포화 실험 기간 동안. 이것은 다중 단백질 바인딩 (추적 2와 3) 하며 단백질 표면 사이의 높은 파열을 초래한 AFM 팁의 클램핑 (Fn-) 함께 도메인 전개 (추적 1, 4, 5; 다른 비늘을 참고). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> 그림 4: 단일 RrgA-Fn 상호 작용의 힘 및 길이 분포. 힘 및 RrgA-Fn SMF 상호 작용 측정에서에서 얻은 해당 파열 길이 히스토그램 파열 (n = 1400) 1 µ m s-1의 상승 속도에. 히스토그램 공개 51.6 pN (가우스 적합, 검은 선)의 가능성이 가장 높은 파열 힘 fMP 와 축적의 파열 길이 약 100 nm. 그림은 Becke 외., ACSnano, 201813에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

이 방법은 단백질 상호 작용에서 단일 단백질이 얼마나 강한지와 같은 생물물리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 생체 분자를 고정시키는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 원자력 현미경 캔틸레버 프로브의 취급과 원자력 현미경 자체의 작동이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.시작하려면 내산성 장갑, 보안경 및 실험실 가운을 착용하십시오. 흄 후드 아래에서 보푸라기가 없는 정밀 물티슈에 이소프로판올을 사용하십시오. 여러 유리 슬라이드에서 거친 먼지와 오염 물질을 제거하십시오.깨끗한 슬라이드를 이중 증류수로 희석한 염산으로 채워진 스탠딩 용기로 옮깁니다. 적절한 뚜껑으로 항아리를 밀봉하고 실온에서 90분 동안 초음파 수조에 넣습니다. 그런 다음 질화규소 AFM 캔틸레버 프로브를 팁이 위쪽을 향하도록 하여 깨끗한 유리 슬라이드로 옮깁니다.슬라이드를 자외선 투과성 챔버로 옮기고 위에서 슬라이드에 자외선을 최소 90분 이상 조사합니다. 그런 다음 염색 용기의 염산을 이중 증류수로 교체하고 유리 표면이 건조되지 않도록 합니다. 뚜껑으로 항아리를 밀봉하고 초음파 수조에 다시 10분 더 넣습니다.한편, 에톡시 실란 폴리에틸렌 글리콜 산을 에탄올과 이중 증류수의 혼합물에 용해시켜 밀리리터당 0.1밀리그램의 최종 농도로 만듭니다. 에탄올의 증발을 방지하기 위해 이 용액을 밀폐하십시오. 준비가 되면 실란 용액을 두 개의 개별 페트리 접시에 붓습니다.깨끗한 유리 슬라이드를 한쪽 페트리 접시에 넣고 캔틸레버를 다른 접시에 넣습니다. 파라필름을 사용하여 에탄올이 증발하는 것을 방지하기 위해 두 플레이트를 모두 밀폐합니다. 고정 플레이트를 실온에서 90분 동안 배양합니다.그런 다음 순수 에탄올이 함유된 3개의 연속 비커를 사용하여 캔틸레버와 유리 슬라이드를 모두 세척합니다. 세척된 캔틸레버를 깨끗한 유리 슬라이드에 놓습니다. 기능화된 유리 슬라이드를 염색 용기로 옮깁니다.둘 다 섭씨 110도의 오븐에서 30분 동안 경화시킵니다. 그런 다음 실란화된 유리 샘플과 캔틸레버를 진공 건조기에 최대 1주일 동안 보관합니다. 단백질의 무작위 고정화를 시작할 준비가 되면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 인산염 완충 식염수에 EDC 및 NHS를 포함하는 용액을 준비합니다.실란으로 코팅된 유리 슬라이드를 이 용액으로 덮습니다. 실란화된 캔틸레버 프로브를 ECD/NHS 용액 한 방울에 놓습니다. 둘 다 실온에서 10분 동안 배양합니다.다음으로, 캔틸레버와 슬라이드를 세 개의 연속 비커로 헹구어 과도한 EDC/NHS를 완전히 씻어냅니다. 활성화된 유리 슬라이드를 젖은 티슈가 장착된 페트리 접시에 옮깁니다. 유리 슬라이드의 EDC/NHS 활성화 영역에 원하는 단백질 용액 한 방울을 추가하고 파라필름을 사용하여 페트리 접시를 밀봉하고 프로브를 실온에서 배양합니다.젖은 티슈가 장착된 캔틸레버 상자에 원하는 단백질 용액 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 PBS로 캔틸레버 프로브를 철저히 세척합니다. 프로브를 상자의 방울에 넣고 상자를 닫습니다.프로브를 실온에서 배양합니다. 그런 다음 유리 슬라이드 뒷면에 있는 단백질 방울의 영역을 표시합니다. PBS로 채워진 세 개의 연속 비커를 사용하여 유리 슬라이드와 캔틸레버 프로브를 모두 철저히 세척합니다.세척된 프로브를 Tris-buffered saline이 들어 있는 용기에 실온에서 20분 동안 놓습니다. 그런 다음 유리 슬라이드와 캔틸레버 프로브를 PBS로 철저히 세척합니다. 사용할 준비가 될 때까지 PBS로 덮인 별도의 페트리 접시에 보관하십시오.갓 세척한 유리 슬라이드를 AFM 샘플 홀더에 고정하고 PBS 버퍼로 덮습니다. 그런 다음 준비된 캔틸레버 프로브를 캔틸레버 홀더에 고정하고 AFM 헤드에 놓습니다. PBS 버퍼 한 방울로 캔틸레버를 조심스럽게 적십니다.캔틸레버가 PBS 버퍼에 완전히 잠길 때까지 캘틸레버를 보정 표면 쪽으로 천천히 이동하되 보정 표면에서 여전히 멀어집니다. 평면을 사용하여 광학 현미경 또는 AFM의 도립 현미경을 사용하여 캔틸레버 뒷면에 레이저를 배치합니다. 캔틸레버 끝 근처에 레이저 스폿을 배치하고 팁이 있는 위치에 가깝게 레이저 스폿을 배치하고 반사된 레이저 빔이 포토다이오드의 중앙에 위치하도록 AFM의 4사분면 검출기 포토다이오드의 위치를 조정합니다.그런 다음 AFM 소프트웨어에서 보정 관리자를 엽니다. 캔틸레버 감도와 스프링 상수 보정을 시작하려면 기판 표면에 조심스럽게 접근하고 힘 거리 곡선을 기록하십시오. 팁이 기판 표면과 접촉하는 후퇴력 곡선의 가장 가파른 부분에 직선을 맞추어 광학 레버 감도를 결정합니다.샘플 표면에서 캔틸레버를 빼내고 표면에서 최소 100미크론 떨어진 캔틸레버로 여러 열 노이즈 스펙트럼을 기록하고 AFM 소프트웨어에서 제공하는 고조파 발진기를 열 노이즈 스펙트럼에 피팅하여 캔틸레버의 스프링 상수를 결정합니다. 그런 다음 캔틸레버를 천천히 집어넣고 용액에서 빼냅니다. 캔틸레버 보정에 사용된 유리 표면을 제거하고 고정화된 단백질이 포함된 샘플 표면으로 교체합니다.캔틸레버가 PBS 버퍼로 완전히 덮일 때까지 축축한 캔틸레버를 샘플 표면 쪽으로 천천히 이동시키되 기판 표면에서 여전히 멀리 떨어뜨립니다. 표면에 접근하여 250피코네톤의 접촉력, 1초의 접촉 시간, 2마이크로미터의 후퇴 길이 및 초당 1마이크로미터의 후퇴 속도로 샘플 표면의 여러 위치에서 여러 힘 거리 곡선을 기록합니다. 데이터 처리 소프트웨어에서 Force Scan의 Open batch '아이콘을 선택하여 측정된 힘 곡선을 엽니다.Recalibrate the V Diflection by Adjusting Sensitivity in Spring Constant(스프링 상수의 감도를 조정하여 V 회절 재보정) 아이콘을 선택하여 캔틸레버 회절을 정비례 힘으로 변환합니다. 그런 다음 Baseline Subtraction(기준선 빼기) 아이콘을 선택하여 표면에서 멀리 떨어진 힘 곡선 영역에서 후퇴 채널의 기준선을 빼고 0 힘 수준도 설정합니다. Contact Point Determination(접점 결정) 아이콘을 선택하여 팁이 샘플과 접촉하는 지점을 정의합니다.Tip Sample Separation' 아이콘을 선택하여 높이 신호를 tip 샘플 분리로 변환합니다. 접점 위치를 빼는 것 외에도 캔틸레버 굽힘을 빼서 기판 표면과 AFM 팁 사이의 거리를 계산합니다. Fit a Polymer Chain Model(폴리머 체인 모델 맞추기) 아이콘을 선택하고 Extensible Worm-like Chain(확장 가능한 웜 유사 체인) 모델을 선택하여 70나노미터 이상의 파열 길이에서 발생하는 힘 피크에 대한 힘 거리 트레이스를 스크리닝합니다.비특이적 상호 작용을 분류하고 확장 가능한 벌레 유사 사슬 모델을 선택한 피크에 적용합니다. 이 연구에서 단백질은 접근 가능한 1차 아민을 통해 무작위 방향으로 공유 고정됩니다. 실란화된 고분자 층의 AFM 이미지는 약 2나노미터에서 5나노미터 사이의 높이를 가진 작은 표면 주름만 보여줍니다.그러나 피브로넥틴으로 기능화된 표면은 약 10나노미터 높이의 피브로넥틴 분자를 갖는 것으로 보입니다. 더 자세히 조사하면 분자의 이합체 구조를 인식할 수 있음을 알 수 있습니다. 이 분자는 PEG 표면 코팅 위로 4-5나노미터의 높이와 약 120나노미터의 길이를 가진 조밀한 것으로 보입니다.그런 다음 RRGA와 피브로넥틴의 상호 작용력을 조사합니다. 초당 1미크론의 폴 속도로 기록된 대표적인 팁 샘플 분리 곡선은 낮은 백그라운드 상호 작용과 잘 형성된 상호 작용 이벤트를 보여주었으며, 이는 확장 가능한 웜과 같은 사슬 모델을 사용하여 장착됩니다. 이 적합의 결과를 플로팅하면 PEG 링커를 늘릴 때 비특이적 표면 상호 작용을 극복한 후 최대 19%의 힘 곡선에서 RRGA 피브로넥틴 상호 작용에 대한 평균 파열력이 52피코네톤이고 약 100나노미터의 팁 샘플 거리에서 파열 이벤트가 있음을 알 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 접촉 시간 또는 후퇴 속도와 같은 설정에 따라 단일 분자 힘 분광법 데이터에는 여러 정보가 포함되며 이 프로토콜은 완전한 데이터 분석을 위한 첫 번째 단계일 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 방법은 단일 분자 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 단일 세포 수준에서 상호 작용을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 단일 세포가 단백질로 코팅된 표면과 어떻게 상호 작용하는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 단일 세포 힘 분광법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.산과 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 내산성 장갑 및 자외선 불투과성 챔버와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

covalent-immobilization-proteins-for-single-molecule-force

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

이 비디오는 단일 분자 이미징을 사용하여 특정 유전자 자리에서 DNA 분자의 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이러한 응축물은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 형성되며, 이를 통해 RNA 중합효소 II를 동원하고 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다.

DNA 커튼에서 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하기 위한 단일 분자 이미징

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

학습하세요 단일 분자 힘 분광학을 위한 단백질 화학적 고정 방법을. 이 기법은 원자력 현미경을 활용하여 단백질 상호작용을 정밀 측정하며 생물물리학 연구에 필수적인 도구입니다.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

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