단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

이 방법은 단백질 상호 작용에서 단일 단백질이 얼마나 강한지와 같은 생물물리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 생체 분자를 고정시키는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 원자력 현미경 캔틸레버 프로브의 취급과 원자력 현미경 자체의 작동이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

시작하려면 내산성 장갑, 보안경 및 실험실 가운을 착용하십시오. 흄 후드 아래에서 보푸라기가 없는 정밀 물티슈에 이소프로판올을 사용하십시오. 여러 유리 슬라이드에서 거친 먼지와 오염 물질을 제거하십시오.

깨끗한 슬라이드를 이중 증류수로 희석한 염산으로 채워진 스탠딩 용기로 옮깁니다. 적절한 뚜껑으로 항아리를 밀봉하고 실온에서 90분 동안 초음파 수조에 넣습니다. 그런 다음 질화규소 AFM 캔틸레버 프로브를 팁이 위쪽을 향하도록 하여 깨끗한 유리 슬라이드로 옮깁니다.

슬라이드를 자외선 투과성 챔버로 옮기고 위에서 슬라이드에 자외선을 최소 90분 이상 조사합니다. 그런 다음 염색 용기의 염산을 이중 증류수로 교체하고 유리 표면이 건조되지 않도록 합니다. 뚜껑으로 항아리를 밀봉하고 초음파 수조에 다시 10분 더 넣습니다.

한편, 에톡시 실란 폴리에틸렌 글리콜 산을 에탄올과 이중 증류수의 혼합물에 용해시켜 밀리리터당 0.1밀리그램의 최종 농도로 만듭니다. 에탄올의 증발을 방지하기 위해 이 용액을 밀폐하십시오. 준비가 되면 실란 용액을 두 개의 개별 페트리 접시에 붓습니다.

깨끗한 유리 슬라이드를 한쪽 페트리 접시에 넣고 캔틸레버를 다른 접시에 넣습니다. 파라필름을 사용하여 에탄올이 증발하는 것을 방지하기 위해 두 플레이트를 모두 밀폐합니다. 고정 플레이트를 실온에서 90분 동안 배양합니다.

그런 다음 순수 에탄올이 함유된 3개의 연속 비커를 사용하여 캔틸레버와 유리 슬라이드를 모두 세척합니다. 세척된 캔틸레버를 깨끗한 유리 슬라이드에 놓습니다. 기능화된 유리 슬라이드를 염색 용기로 옮깁니다.

둘 다 섭씨 110도의 오븐에서 30분 동안 경화시킵니다. 그런 다음 실란화된 유리 샘플과 캔틸레버를 진공 건조기에 최대 1주일 동안 보관합니다. 단백질의 무작위 고정화를 시작할 준비가 되면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 인산염 완충 식염수에 EDC 및 NHS를 포함하는 용액을 준비합니다.

실란으로 코팅된 유리 슬라이드를 이 용액으로 덮습니다. 실란화된 캔틸레버 프로브를 ECD/NHS 용액 한 방울에 놓습니다. 둘 다 실온에서 10분 동안 배양합니다.

다음으로, 캔틸레버와 슬라이드를 세 개의 연속 비커로 헹구어 과도한 EDC/NHS를 완전히 씻어냅니다. 활성화된 유리 슬라이드를 젖은 티슈가 장착된 페트리 접시에 옮깁니다. 유리 슬라이드의 EDC/NHS 활성화 영역에 원하는 단백질 용액 한 방울을 추가하고 파라필름을 사용하여 페트리 접시를 밀봉하고 프로브를 실온에서 배양합니다.

젖은 티슈가 장착된 캔틸레버 상자에 원하는 단백질 용액 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 PBS로 캔틸레버 프로브를 철저히 세척합니다. 프로브를 상자의 방울에 넣고 상자를 닫습니다.

프로브를 실온에서 배양합니다. 그런 다음 유리 슬라이드 뒷면에 있는 단백질 방울의 영역을 표시합니다. PBS로 채워진 세 개의 연속 비커를 사용하여 유리 슬라이드와 캔틸레버 프로브를 모두 철저히 세척합니다.

세척된 프로브를 Tris-buffered saline이 들어 있는 용기에 실온에서 20분 동안 놓습니다. 그런 다음 유리 슬라이드와 캔틸레버 프로브를 PBS로 철저히 세척합니다. 사용할 준비가 될 때까지 PBS로 덮인 별도의 페트리 접시에 보관하십시오.

갓 세척한 유리 슬라이드를 AFM 샘플 홀더에 고정하고 PBS 버퍼로 덮습니다. 그런 다음 준비된 캔틸레버 프로브를 캔틸레버 홀더에 고정하고 AFM 헤드에 놓습니다. PBS 버퍼 한 방울로 캔틸레버를 조심스럽게 적십니다.

캔틸레버가 PBS 버퍼에 완전히 잠길 때까지 캘틸레버를 보정 표면 쪽으로 천천히 이동하되 보정 표면에서 여전히 멀어집니다. 평면을 사용하여 광학 현미경 또는 AFM의 도립 현미경을 사용하여 캔틸레버 뒷면에 레이저를 배치합니다. 캔틸레버 끝 근처에 레이저 스폿을 배치하고 팁이 있는 위치에 가깝게 레이저 스폿을 배치하고 반사된 레이저 빔이 포토다이오드의 중앙에 위치하도록 AFM의 4사분면 검출기 포토다이오드의 위치를 조정합니다.

그런 다음 AFM 소프트웨어에서 보정 관리자를 엽니다. 캔틸레버 감도와 스프링 상수 보정을 시작하려면 기판 표면에 조심스럽게 접근하고 힘 거리 곡선을 기록하십시오. 팁이 기판 표면과 접촉하는 후퇴력 곡선의 가장 가파른 부분에 직선을 맞추어 광학 레버 감도를 결정합니다.

샘플 표면에서 캔틸레버를 빼내고 표면에서 최소 100미크론 떨어진 캔틸레버로 여러 열 노이즈 스펙트럼을 기록하고 AFM 소프트웨어에서 제공하는 고조파 발진기를 열 노이즈 스펙트럼에 피팅하여 캔틸레버의 스프링 상수를 결정합니다. 그런 다음 캔틸레버를 천천히 집어넣고 용액에서 빼냅니다. 캔틸레버 보정에 사용된 유리 표면을 제거하고 고정화된 단백질이 포함된 샘플 표면으로 교체합니다.

캔틸레버가 PBS 버퍼로 완전히 덮일 때까지 축축한 캔틸레버를 샘플 표면 쪽으로 천천히 이동시키되 기판 표면에서 여전히 멀리 떨어뜨립니다. 표면에 접근하여 250피코네톤의 접촉력, 1초의 접촉 시간, 2마이크로미터의 후퇴 길이 및 초당 1마이크로미터의 후퇴 속도로 샘플 표면의 여러 위치에서 여러 힘 거리 곡선을 기록합니다. 데이터 처리 소프트웨어에서 Force Scan의 Open batch '아이콘을 선택하여 측정된 힘 곡선을 엽니다.

Recalibrate the V Diflection by Adjusting Sensitivity in Spring Constant(스프링 상수의 감도를 조정하여 V 회절 재보정) 아이콘을 선택하여 캔틸레버 회절을 정비례 힘으로 변환합니다. 그런 다음 Baseline Subtraction(기준선 빼기) 아이콘을 선택하여 표면에서 멀리 떨어진 힘 곡선 영역에서 후퇴 채널의 기준선을 빼고 0 힘 수준도 설정합니다. Contact Point Determination(접점 결정) 아이콘을 선택하여 팁이 샘플과 접촉하는 지점을 정의합니다.

Tip Sample Separation' 아이콘을 선택하여 높이 신호를 tip 샘플 분리로 변환합니다. 접점 위치를 빼는 것 외에도 캔틸레버 굽힘을 빼서 기판 표면과 AFM 팁 사이의 거리를 계산합니다. Fit a Polymer Chain Model(폴리머 체인 모델 맞추기) 아이콘을 선택하고 Extensible Worm-like Chain(확장 가능한 웜 유사 체인) 모델을 선택하여 70나노미터 이상의 파열 길이에서 발생하는 힘 피크에 대한 힘 거리 트레이스를 스크리닝합니다.

비특이적 상호 작용을 분류하고 확장 가능한 벌레 유사 사슬 모델을 선택한 피크에 적용합니다. 이 연구에서 단백질은 접근 가능한 1차 아민을 통해 무작위 방향으로 공유 고정됩니다. 실란화된 고분자 층의 AFM 이미지는 약 2나노미터에서 5나노미터 사이의 높이를 가진 작은 표면 주름만 보여줍니다.

그러나 피브로넥틴으로 기능화된 표면은 약 10나노미터 높이의 피브로넥틴 분자를 갖는 것으로 보입니다. 더 자세히 조사하면 분자의 이합체 구조를 인식할 수 있음을 알 수 있습니다. 이 분자는 PEG 표면 코팅 위로 4-5나노미터의 높이와 약 120나노미터의 길이를 가진 조밀한 것으로 보입니다.

그런 다음 RRGA와 피브로넥틴의 상호 작용력을 조사합니다. 초당 1미크론의 폴 속도로 기록된 대표적인 팁 샘플 분리 곡선은 낮은 백그라운드 상호 작용과 잘 형성된 상호 작용 이벤트를 보여주었으며, 이는 확장 가능한 웜과 같은 사슬 모델을 사용하여 장착됩니다. 이 적합의 결과를 플로팅하면 PEG 링커를 늘릴 때 비특이적 표면 상호 작용을 극복한 후 최대 19%의 힘 곡선에서 RRGA 피브로넥틴 상호 작용에 대한 평균 파열력이 52피코네톤이고 약 100나노미터의 팁 샘플 거리에서 파열 이벤트가 있음을 알 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 접촉 시간 또는 후퇴 속도와 같은 설정에 따라 단일 분자 힘 분광법 데이터에는 여러 정보가 포함되며 이 프로토콜은 완전한 데이터 분석을 위한 첫 번째 단계일 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 방법은 단일 분자 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 단일 세포 수준에서 상호 작용을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 단일 세포가 단백질로 코팅된 표면과 어떻게 상호 작용하는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 단일 세포 힘 분광법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

산과 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 내산성 장갑 및 자외선 불투과성 챔버와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.