Name: 히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 히알루론산 기반 하이드로겔을 이용해 환자 유래 교모세포종 세포를 3차원 배양하는 방법을. 이 기술은 종양 미세환경을 모사하여 치료 내성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH (R21NS093199)와 UCLA 아크 3R의 수상에서 자금을 지원 했다. 우리의 충심으로 감사 합니다는 HK301 및 HK157 셀 라인의 제공에 대 한 닥터 할리 로드의 실험실으로 이동합니다. 우리 또한 감사 UCLA 조직 병리학 코어 연구소 (TPCL) cryosectioning, 고급 조명 현미경/분광학 핵심 시설 (연금)에서 캘리포니아 Nanosystems 연구소 (CNSI) ucla confocal 현미경, UCLA Crump 연구소의 사용에 대 한 IVIS 이미징 시스템, UCLA 분자 계측 센터 (MIC) 흐름에 대 한 계측을 제공 하기 위한 자기 공명 분광학, 및 교류 Cytometry 코어에 Jonsson 종합 암 센터 (JCCC) UCLA에서 제공를 사용 하 여에 대 한 분자 영상 cytometry입니다.

모든 인간의 조직 컬렉션 단계 제도 승인된 프로토콜에서 실행 되었다.
1입니다. 히 알루 론 산의 Thiolation
참고: 어 금 니 비율 진술 된다 카복실산 그룹의 총 수와 관련 하 여 별도로 지정 하지 않는 한.
<ol><li>에 이온을 제거 된 증류수 (DiH2O) 압력솥 살 균, 250 mL 삼각 플라스 크에에서 10 mg/mL에서 나트륨 hyaluronate (HA, 500-750 kDa)의 500 mg을 디졸브. 완전히 분해 하 게 2 시간 동안 실내 온도에 솔루션 (~ 200 rpm)를 저 어. Thiolation 절차 동안 교 반 반응 계속 저 어 바와 자기 저 어 접시를 사용 합니다.</li>
	<li>0.1 m M를 사용 하 여 염 산 (HCl), 5.5 HA 솔루션의 pH를 조정 합니다. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)의 69.6 mg (어 금 니 비율 x 0.25)에 밖으로 나가는 거 야. 참고: 소화 EDC HA 솔루션에 직접 추가할 수 있습니다, 비록 그것은 일반적으로 쉽게 DiH2O의 1 mL에 먼저 EDC를 해산 하 고 다음 신속 하 게 추가할 EDC 솔루션 HA 솔루션을. 전 해산 DiH의 1 mL에2O 또한 할 수 있습니다 N-hydroxysuccinimide (NHS)와 cystamine dihydrocholoride 1.3 및 1.4 단계에서 반응에 추가 하기 전에.</li>
	<li>반응에 NHS의 17.9 mg (어 금 니 비율 x 0.125)를 추가 합니다. 5.5 0.1 M HCl을 사용 하 여 반응 용액의 pH를 조정 하 고 45 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어.</li>
	<li>Cystamine dihydrochloride 70.0 mg (어 금 니 비율 x 0.25) 반응 솔루션에 추가 합니다. 0.1 M 수산화 나트륨 (NaOH)를 사용 하 여 6.25에 pH를 조정. 교 반 하면서 하룻밤 실 온에서 반응을 품 어.</li>
	<li>다음 날에 1 M NaOH 사용 하 여 약 8 반응 해결책의 pH를 조정. 반응에 dithiothreitol (DTT)의 192 mg (어 금 니 비율 x 4)을 추가 합니다. DTT의 추가 후 다시 8로 pH를 조정 하 고 실 온에서 1-2 시간 동안 교를 떠나.</li>
	<li>1 M HCl을 사용 하 여 4로 pH를 조정. 미리 젖된 투 석 막 (주위 13 kDa 분자량 컷오프)로 전체 반응 혼합물을 전송 하 고 DiH에 대 한 dialyze2O pH 4에 사전 조정. 참고: DiH2O 투 석의 40 배 이상 반작용된 HA 솔루션 (예를 들어, 50 mL 샘플 DiH2O, pH 4의 2 L에)의 볼륨 이어야 합니다.</li>
	<li>대체 투 솔루션 (DiH2O, pH 4) 두번 매일 실 온에서 3 일 동안.</li>
	<li>Dialyzed 솔루션 0.22 μ m의 막, 진공 기반 필터를 통해 필터링. 플래시는 액체 질소에 thiolated HA 솔루션을 동결. lyophilizer를 사용 하 여 동결 건조 샘플 2 일 동안. Thiolated 하 건조 형태로 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 밀폐 desiccator에 6 개월 이상.</li>
	<li>Thiolation의 정도 확인, 덮어의 테스트 및 양성자 NMR 분광학30,31을 사용 합니다.</li>
</ol>2입니다. 가교 자료의 준비
<ol><li>주위 빛에 노출을 최소화 하기 위해 호박 유리병에서 HEPES 버퍼링 식 염 수 (20 mM HEPES 행 크의 균형된 소금 염 (HBSS) 버퍼, pH 8-9의 내 조정)에 (이 예제에서는 13.3 mg/mL)에서 원하는 농도에서 thiolated HA를 분해. 끊임없이 약동 하는 솔루션을 유지. 참고: thiols HA에 활용 된 사이 이황화 결합의 대형 pH는 8 위, 솔루션 농도 너무 높은, 또는 솔루션은 겔 화 하기 전에 너무 오래 대 한 교 반 남아 경우 발생할 수 있습니다. 이 문제를 방지 하려면 15 mg/mL thiolated HA의 아래 사용 하 고 thiolated HA hydrogels 형성의 2 시간 안에 해산.</li>
	<li>4-팔-말뚝-maleimide (말뚝-말, 20 kDa) 및 4-팔-말뚝-thiol (페그 thiol, 20 kDa) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.4, 50 mg/mL 못 말 및 못 thiol 재고 솔루션을 준비 하에 분해. 참고: 그것은 완전히 해산 못 시 약 1 시간 이상 걸립니다.</li>
	<li>ECM 파생 된 펩 티 드를 추가 하는 경우 재고 솔루션을 준비 하는 PBS에 시스테인-포함 펩 티 드를 분해. 참고: 2-4 m m의 재고 농도 사용 합니다.</li>
	<li>담가 실리콘 고무 주조한 다 깨끗 한 그들을 20 분 이상 그리고 압력솥에 대 한 에탄올에 그들 살 균에 대 한.</li>
</ol>3. 하이드로 겔 가교 및 세포 캡슐화
참고: 예를 들어 서 여기, 4 개인, 80 µ L hydrogels 0.5% (w/v) 하 고 1 kPa의 압축 계수의 캡슐화는 설명된3. 다양 한 속성 hydrogels 항복 예 조리법에 대 한 표 1을 참조 하십시오: 두 hydrogels integrin 바인딩 펩 티 드 RGD 통합 및 두 hydrogels 시스테인 모자 펩 티 드 활동에 대 한 부정적인 컨트롤로 통합. 환자 파생 GBM 세포의 농도 시드 500000 셀/mL입니다.
<ol><li>12.5 mg/mL을 못 말 재고 솔루션 (단계 2.2에서에서 50 mg/mL) 120 µ L PBS에 재고 솔루션의 40 µ L을 추가 하 여 희석. 각 튜브는 80 µ L 희석된 솔루션 두 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 분할.</li>
	<li>16 µ L 재고 RGD 솔루션 (2.8 m m, 단계 2.3에서에서) 1 개의 관을 및 재고 시스테인 솔루션 (2.8 m m, 단계 2.3에서에서) 두 번째 관의 16 µ L를 추가 합니다. 소용돌이를 섞어입니다. 단계 3.9에서에서 사용까지 얼음에 말뚝-말-RGD 또는 말뚝-말-CYS 솔루션을 놓습니다. 참고: 수익률 hydrogels 펩 티 드의 ~ 140 µ M와 함께 여기에 설명 된 대로 절차. 이것은 펩 티 드로 점유 되 고 모든 8 사용할 수 못 팔에서 약 1입니다. 이 시스테인 종료 사용할 수 maleimide 그룹에 펩 티 드의 어 금 니 비율을 변경 하 여 다양 한 될 수 있습니다. 일반적으로, 여전히 히드로 가교에 대 한 사용할 수 있는 maleimide 그룹의 충분 한 숫자를 떠나 있는 동안 펩 티 드의 280 μ M의 최대 농도 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>PBS의 36 µ L 재고 솔루션 4 µ L 50 mg/mL의 혼합 하 여 말뚝 thiol 재고 솔루션 (단계 2.2에서에서 50 mg/mL) 5 mg/ml를 희석. 2.1 단계에서 혼합물을 녹아, thiolated HA의 120 µ L를 추가 합니다. 참고: HMW 하의 솔루션은 아주 점성. 따라서, 넓은 구멍 micropipette 팁을 사용 하 여 솔루션을 전송 하는 것이 좋습니다. 피 펫 천천히 micropipette 팁의 벽에 집착 하는 솔루션을 방지 하 고 측정 정확도 향상</li>
	<li>(준비 단계 2.4에서에서) 깨끗 하 고 마른 형 조직 문화 치료 12-잘 접시의 각 음에 놓습니다. 피 펫 팁의 깨끗 하 고 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여, 젤 형과 금형과 잘 접시의 바닥 사이 더블 씰링을 누릅니다. 참고: 누설을 방지 하기 위해 캡슐화 하기 바로 전에 다시 인감을 확인 하십시오.</li>
	<li>교양된 GBM 셀을 통과 하 고 단일 셀에 해리 셀 농도 앞에서 설명한3결정 합니다. 참고: 일부 GBM 라인은 단일 셀에 해리 했다 수 수 없습니다. 이 경우에, 전체 gliomaspheres 캡슐화 될 수 있습니다. 그러나, 재현성을 개선 하기 위해 정확한 셀 계산 후 해리 단일 셀을 준비 합니다. Gliomasphere 뿌리고 위한 프로토콜 다른 실험실 사이에서 변화 하 고 이러한 많은 가능성이 호환 히드로 캡슐화.<ol>
<li>(권장) 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기 gliomaspheres 제거는 상쾌한 고 셀 펠 릿을 셀 분리 효소의 1 mL를 추가 합니다. 그런 다음, 부드럽게 도청 선동 튜브 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>셀에 완전 한 문화 매체 (50 ng/mL EGF, DMEM/f 12에 20 ng/mL FGF-2, 25 µ g/mL 헤 파 린, G21 보충 및 1% 페니실린/스)의 4 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>다시 5 분 동안 500 x g에서 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 마지막으로, 완전 한 매체의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend 고 70 µ m 셀 여과기 정지 세포를 통과. (권장된) 세척 세포의 수를 최대화 하려면 전체 매체의 추가 4 mL와 여과기를 복구.</li>
	</ol>
</li>
	<li>서 스 펜 션은 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 농도 추정 합니다. 2 원심 분리기 튜브 각 튜브 ~ 80000 셀을 포함 하는 곳에 세포 현 탁 액을 분할. 5 분;에 대 한 500 x g에서 원심 일반적으로, 80000 셀 2 80 µ L hydrogels를 만들 것입니다.</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 못 말 RGD 솔루션의 80 µ L에서 한 펠 릿과 (3.1 단계에서 준비 하는) 말뚝-말-CYS 솔루션의 80 µ L에 두 번째 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>각 고무 실리콘 금형 (으로 단계 3.4에서 준비)에 (위 단계 3.3)에서 HA 솔루션의 40 µ L를 분배 using 200 µ L, 넓은 구멍 micropipette 팁.</li>
	<li>200 µ L, 넓은 구멍 micropipette 팁 using, 페그-말-CYS 또는 금형에 HA 솔루션을 페그-말-RGD 셀 솔루션의 40 µ L 믹스. 플라스틱 아래로 신속 하 게 10 개 이상 시간. 준비 중인 각 젤 문화에 대 한 반복 합니다. 참고:이 단계는 연습, 신속 하 게 발생 하는 초기 겔 화 이후 (30 s). 팁도 혼합 되도록 금형에서 다른 위치로 이동 하는 동안 아래로 플라스틱. 항상 기포의 형성을 피하기 위해 액체 수준 아래 팁을 유지. 솔루션 젤은 micropipette 내부 형성 얻을 수 있습니다으로 너무 많은 시간 팁 혼합 하지 마십시오. 말뚝 말 CYS 및 말뚝-말-RGD 원하는 RGD 펩타이드 농도 달성 하기 위해 다양 한 비율에서 결합할 수 있습니다.</li>
	<li>반응의 완료를 보장 하기 위해 5-10 분 동안 37 ° C 세포 문화 인큐베이터로 젤 캡슐 셀을 포함 하는 잘 판 놓습니다.</li>
	<li>각 잘 구성 된 젤을 문화 매체의 2-2.5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 금형과 젤을 분리 하는 살 균, 2 µ L 피 펫 팁 또는 마이크로-주걱을 사용 합니다. 미리 소독된 집게를 사용 하 여 잘 플레이트에서 금형을 제거. 문화와 미래 실험 위한 셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 다시 잘 접시를 놓습니다. 참고: 젤 문화를 해치지 않으려면 형 수직으로 위쪽으로 당겨. 일반적으로 3-4 일 마다 젤 문화에서 매체에 대체 되어야 한다. 알아서 하지 매체를 제거할 때 hydrogels 발음. 이 문제는, 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 것이 좋습니다. 휴대폰 번호를 추적 하기 위해 이미징 생물 발광을 계획 하는 경우 GBM 셀 lentivirus luciferase 식을 캡슐화, 전에 앞에서 설명한3로 인코딩을 constitutively로 불리고 해야 합니다. 생물 발광 영상, 문화 매체 발광 영상 전에 1 h D-소의 1 mM를 추가 합니다.</li>
</ol>4. lysate 준비 부 럽
<ol><li>얼음 (젤 샘플 당 1)에 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 진정. 4 ° c.에 멋진 원심 분리기</li>
	<li>잘 플레이트에서 매체를 제거 합니다. Prechilled microcentrifuge 튜브 젤을 전송 합니다.</li>
	<li>1 x 효소/인산 가수분해 효소 억제제와 RIPA 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>20 번 이상 바늘을 통해 전체 혼합물을 추진 하 여 젤을 헤어 20 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여.</li>
	<li>플래시 스핀 벤치 가기 microcentrifuge 및 샘플 다시 얼음에 장소를 사용 하 여 샘플.</li>
	<li>소용돌이 간단히 모든 5 분 총 20 분의 샘플링.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 14000 x g에서 원심 분리기 샘플</li>
	<li>상쾌한 새, 미리 냉장 microcentrifuge 관에 전송 하 고 (단기)-20 ° C에서 저장 또는 (장기)-80 ° c. 젤 전기 이동 법 앞에서 설명한3표준 절차를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
</ol>5. 하이드로 겔 문화에서 단일 셀을 추출 Cytometry에 대 한
<ol><li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 매체 및 전송 젤 문화 (단계 3.11)를 제거 합니다.</li>
	<li>때때로 교 반 튜브를 flicking 5 분 동안 37 ° C에서 (예를 들어, TrypLE 익스프레스) 셀 분리 효소의 500 µ L 젤 품 어.</li>
	<li>완전 한 매체의 5 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 혼합물을 전송 합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>10 mL 주사기에 20 G 바늘을 연결 합니다. 부드럽게 당겨 셀 서 스 펜 션 아래로 바늘을 통해 8 번.</li>
	<li>새로운 50 mL 원심 분리기 관으로 혼합물 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 흐름. 나머지 셀을 수집에 스 트레이너를 통해 완전 한 매체의 추가적인 5 mL를 적용 합니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 제거는 상쾌한 cytometry (를 사용 하 여 표준 프로토콜3)에 대 한 원하는 버퍼에 펠 릿을 resuspend 400 x g에서 샘플을 원심.</li>
</ol>6입니다. cryopreservation Hydrogels 단면에 대 한의
<ol><li>(3.11 단계)에서 젤 문화에서 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>밤새 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL 젤 문화를 품 어. 주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.</li>
	<li>다음 날, PFA 제거 합니다. PBS에서 젤 5% 자당의 2 개 mL를 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>PBS에서 20% 자당의 2 mL와 5% 자당 해결책을 대체 하 고 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>자당 솔루션 2 mL PBS에서 신선한 20% 자당의 교체와 추가 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>세 번째 시간에 대 한 자당 솔루션을 2 mL PBS에서 신선한 20% 자당의 바꿉니다. 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 20% 자당을 준비 합니다. 참고: 10 월의 점성 때문에 자당의 해산 걸릴 수 있습니다 일부 시간 (하룻밤)까지. 동요를 유지 하기 위해 해체 동안 통에 혼합물을 저장 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>다음 날, 20% 자당 해결책을 제거 하 고 부드럽게 붓는 20% 자당 10 월 솔루션에서 젤. 전체 젤을 커버 있는지 확인 합니다. 3 h 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>젤 큰, 편평한 주걱;를 사용 하 여 포함 형의 센터에 전송 이 젤의 손상을 방지 하려면 신중 하 게 수행 되어야 합니다.</li>
	<li>드라이 아이스의 초과 cryochamber 안에 멋진 2-methylbutane.</li>
	<li>순수한 oct (자당) 포함 형을 채우십시오. 바로 형의 위쪽 가장자리 아래에 채우십시오.</li>
	<li>냉각된 2-methylbutane에 침수에 의해 하이드로 겔 샘플을 동결 하 고 단면 진행.</li>
	<li>섹션 cryostat;를 사용 하 여 샘플 10-18 µ m의 섹션 두께 및 단면 약-26 ° C의 온도 것이 좋습니다.</li>
	<li>앞에서 설명한3으로 sectioned 젤 문화에 표준 immunostaining 절차를 수행 합니다. 참고: PFA 자극 및 발암 물질 알려져 있습니다. 처리 하 고 PFA 로컬로 적용 가능한 표준 및 규정에 따라 처분 하십시오.</li>
</ol>7. 총 RNA 추출 하이드로 겔 샘플에서
참고: 여기, 우리는 광고를 사용 하 여 프로토콜 설명 (재료의 표 참조) 히드로 배양 세포에서 총 RNA 추출 키트. 버퍼 및 모든 자료 사용 키트에서 사용할 수 있습니다.
<ol><li>문화 매체를 제거 합니다. 넓은 구멍 팁 P1000 전송 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL microcentrifuge 관으로 히드로 문화를 전송.</li>
	<li>하이드로 겔 문화를 버퍼 실내의 350 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>20 번 이상 바늘을 통해 전체 혼합물을 추진 하 여 젤을 분쇄기 1 mL 주사기에 부착 된 20 G 바늘을 사용 하 여.</li>
	<li>2 mL 컬렉션 튜브에 균질 화기 열에 전체 혼합물을 전송 합니다. 2 분 13000 x g에서 원심.</li>
	<li>Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다. 수 맨 젤 침전을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>100% 에탄올의 350 µ L lysate 샘플 혼합. 2 mL 컬렉션 튜브에 스핀 (kit)에서 열 위치로 모든 샘플을 전송 합니다. 13000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기입니다.</li>
	<li>PCR 위한 RNA 정화에 대 한 이후 단계에 대 한 키트 제조 업체에서 제공 하는 일반적인 프로토콜을 따릅니다. 참고: RNA 추출 되 면 PCR 위한 표준 프로토콜 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 3D 문화 시스템을 사용 하 여 재현할 수 데이터의 생성이 필요 합니다: 1) 일관 된 배치-배치 thiolation HA, 효율적인 히드로 선구자의 혼합 및 히드로의 처리를 달성 하기 위해 연습 2)의 손상을 방지 하기 위해 문화 및 3) 최적화 된 시드 각 셀 라인 사용에 대 한 밀도입니다.
특정 무게 비율 하는 하이드로 겔에서 원할 때 하의 thiolation의 정도 crosslink 밀도를 결정 합니다. 각 thiolation 반응에 대 한 HA의 일관 된 금액을 사용 하 여 일괄 배치 변화를 최소화 하기 위해 하는 것이 좋습니다. 하의는 적어도 300 mg이 좋습니다 thiolated HA의 동일한 배치 여러 실험 반복에 사용할 수 있도록 각 thiolation 반응에 대 한 사용 될. 4 팔 못에 maleimide 그룹 thiols의 어 금 니 비율 항상 최대 가교 효율 1.1:1 될 해야 합니다. 따라서, thiolation의 정도, 변화 하는 경우 다음 못 말 ...

3 차원 (3D) 문화 시스템 기본 조직 그들의 2 차원 (2D) 대응1,2보다 더 나은에서 셀과 그들의 주변 세포 외 기질 (ECM) 간의 상호 작용을 정리. 조직 공학의 발전은 새로운 매트릭스 microenvironment 영향 셀 동작 및 2)의 효능의 1) 어떻게 화학 및 물리적 구성 요소에 대 한 제어 조사를 가능 하 게 하는 정교한, 3D 문화 플랫폼 굴복 했다 치료 질병, 암2등의 숫자에 대 한 전략. 생체 외에서 모델 조직 요인, 내 분 비 및 면역 신호, 등에 대 한 계정이 없습니다 따라서 완전히 vivo에서 모델을 대체할 수 없습니다 하는 동안 그들은 재현성, 실험 제어를 포함 하 여 몇 가지 장점을 제공합니다 경제성 그리고 속도입니다. 여기, 우리 두뇌 모방 hydrogels는 3d에서 환자 파생 뇌 종양 세포의 문화 종양 생리학, 특히, 치료 저항3취득의 역학의 여러 측면을 캡처를 사용 하 여를 설명 합니다. 체 외에 다른 방법에 비해, 이러한 문화는 더 나은 종양 모델 vivo에서 및 임상 관찰3을 나타냅니다.
세포종 (GBM)은 1-2 년4,5의 메디아 생존으로 뇌에서 가장 빈번 하 고 치명적인 암 이다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 GBM6,,78종양 매트릭스 환경의 영향에 집중 했다. 독특한 두뇌 ECM GBM 셀 이동, 확산, 그리고 치료 저항6,7,8,9,,1011 에 영향을 미칠 것으로 보고 되었습니다. , 12. 히 알루 론 산 (HA) 두뇌, 그것은 다른 개 그와 상호 작용 및 하이드로 겔 같은 한 형태로 proteoglycans 메쉬13에 풍부한 glycosaminoglycan (개 그)입니다. HA overexpression에 GBM 종양 및 암 진행8,9,13,,1415,16에 후속 효과 많은 연구 보고 ,17. 다른 ECM 구성 요소 GBM 종양 성장과 침공6,7,,1518에 영향을 줍니다. 예를 들어 fibronectin 및 vitronectin, GBM에 overexpressed 일반적으로, "RGD" 시퀀스에 대 한 바인딩을 통해 세포 표면 integrin 수용 체의 heterodimerization를 유발 하 고 종양 생존19 홍보 하는 복잡 한 신호 폭포를 시작 ,,2021. 생 화 학적 영향 외에 조직 매트릭스의 물리적 특성 GBM 진행22,23에 영향을 줍니다.
치료에 저항을의 지속적인 수집 GBM 치4의 주요 드라이버 중 하나입니다. 2D 또는 gliomasphere 모델에서 유망한 결과 보여주는 마약 이후 동물 연구와 임상 사례3, microenvironmental 요인의 효과 GBM 종양 응답1에 크게 기여 했다는 것을 나타내는 데 실패 했습니다. 동물 모델 3D를 제공할 수 있는, 순수 microenvironment xenografted 환자 세포에 적절 한 고 임상 관련 결과24,25, 두뇌 microenvironment에는 vivo에서 의 복잡성을 생성 기능, 세포-매트릭스 상호 작용을 포함 하 여 특정 핵심 생물 학적 결과 확인 하기 위해 도전 하기가. 새로운 치료 대상의 단순화 된 문화 플랫폼 생화학 및 생물 속성 정의 사용 하 여에서 도움이 됩니다.
GBM 종양 microenvironment26,27 의 이전에 보고 된 소재 모델과 달리는 달성 하지 않았습니다 진정한 직교 제어할 ECM, 소재 플랫폼의 개별 생 화 학적 및 물리적 특징 보고 여기 수 있습니다 여러 개의 독립적인 기능 GBM 세포 표현 형을 기여의 분리 하 고 여기, 선물이 환자 파생 GBM 셀의 3 차원 문화에 대 한 HA 기반, 기가 가변 하이드로 겔 시스템. Hydrogels 두 폴리머 구성 요소에서 형성 된다: 1) 생물학적으로 활성 하 고 2) 생물학으로 비활성 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG). 못은 낮은 단백질 흡착과 최소한의 immunogenicity28널리 생체 및 친수성 소재. 여기, 하 체인에 glucuronic 산 moieties의 약 5%는 기능성 가교를 상업적으로 사용할 수 있는 4-팔-못 maleimides 마이클 형 추가 통해 종료를 수 있도록 thiol 그룹. 가장 일반적인 형태로 본문에, 하 고 분자량 (HMW) 체인에 존재합니다. 여기, 낮은 정도의 HMW 하의 (500-750 kDa) 수정 하 고 CD4429를 포함 하 여 그것의 세포 수용 체의 기본 상호 작용을 유지 하기 위해 도움이 됩니다. Maleimides에 총 thiols의 일정 한 어 금 니 비율을 유지 하면서 하 thiol 위한 페그 thiol를 대체 하 여 하 농도 결과 hydrogels의 기계적 성질에서 분리 될 수 있습니다. 또한, 화학 량 론 컨트롤 시스테인 종료 펩 티 드의 maleimide로 끝나는 각 4-팔-말뚝에 정의 된 평균 수 켤레를 사용할 수 있습니다. ECM 파생, 접착제 펩 티 드의 integrins는 생화학 및 화학 신호는 불리고1경작된 한 세포에와 상호 작용 수 있습니다. Maleimide-thiol 추가 셀 캡슐화 및 환자에서 파생 된 세포의 생존을 극대화 하는 데 필요한 시간을 최소화 하는 생리 적 조건 하에서 매우 빠르게 발생 합니다. 또한, 히드로 문화 일반적인 조직 표본 처럼 취급 될 수 있으며 표준 특성화 기법 등 서 부 럽, cytometry, 면역 형광 염색 법와 호환. 다음 프로토콜 환자 파생 GBM 셀 및 생 화 확 적인 분석에 대 한 기술 3D 문화 수립 hydrogels 날조를 위한 절차를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>pH 측정기</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>pH 2-10 감도의 모든 pH 측정기</td></tr><tr><td>Stir plate</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>삼각 플라스크(125mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB-501-125</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-152-14</td><td></td></tr><tr><td>2L 폴리프로필렌 비커</td><td>Thermo Fisher</td><td>S01916</td><td></td></tr><tr><td>히알루론나트륨</td><td>Lifecore</td><td>HA700k-5</td><td>500-750 kDa 범위</td></tr><tr><td>1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)</td><td>써모 피셔</td><td>PI-22980</td><td></td></tr><tr><td>N-하이드록시숙신이미드(NHS)</td><td>시그마 알드리치</td><td>130672-5G</td><td></td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>Thermo Fisher</td><td>SA48-500</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Thermo Fisher</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>시스타민 디하이드로클로라이드</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC111770250</td><td></td></tr><tr><td>디티올트레이톨(DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Ellman의 테스트 시약(5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)디설파닐-2-니트로벤조산</td><td>, 시그마 알드리치</td><td>D218200-1G</td><td></td></tr><tr><td>중수소수(산화중수소)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC166301000</td><td></td></tr><tr><td>0.22&마이크로; m 진공 구동 필터</td><td>CellTreat</td><td>229706</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Saline(HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MT-21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>4-arm-PEG-maleimide</td><td>JenKem Technology</td><td>A7029-1</td><td>분자량 약 20kDa</td></tr><tr><td>4-arm-PEG-thiol</td><td>JenKem Technology</td><td>A7039-1</td><td>분자량 약 20kDa</td></tr><tr><td>L-시스테인&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>RGD ECM 모방 펩타이드</td><td>Genscript Biotech</td><td>N/A</td><td>"GCGYGRGDSPG" 시퀀스의 맞춤형 펩타이드, N-터미널은 아세틸화 실리콘 몰드여야 합니다</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL664201-25EA</td><td>면도날을 사용하여 단일 조각으로</td></tr><tr><td>절단 완전한 배양 배지</td><td>다양</td><td></td><td>비 혈청 보충 (GeminiBio의 G21), 표피 성장 인자 50ng / mL (Peprotech), 섬유 아세포 성장 인자 20ng / mL (Pepro Tech) 및 heprain 25 &micro를 사용한 DMEM / F12 (Thermofisher); g/mL(Sigma Aldrich), 배양 배지는 실험실마다 다릅니다.</td></tr><tr><td>환자 유래 GBM 세포</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>20G 바늘</td><td>BD 의료</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기 Thermo</td><td>Fisher</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>10mL 주사기</td><td>BD 의료</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI-89901</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제/ 인산가수분해효소 억제제 미니 정제</td><td>시그마 알드리치</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>보텍스 쉐이커</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-814-5Q</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE 익스프레스</td><td>써모 피셔</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>70&micro; m cell strainer</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC416785000</td><td>PBS에 4%(w/v)를 용해하고 pH 7.4</td></tr><tr><td>D-sucrose</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 온도(O.C.T.) 화합물</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9373881</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>일반 5 % CO2 및 37C</td></tr><tr><td>냉장고 / 냉동고</td><td>Thermo Fisher</td><td>N / A</td><td>-20C 및 -80C 용량의 일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>일회용 임베딩 금형</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-20</td><td></td></tr><tr><td>Lyapholizer</td><td>Labconco</td><td>N / A</td><td>Any -105C 동결 건조기</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>앰버 바이알</td><td>Kimble Chase</td><td>60912D-2</td><td></td></tr><tr><td>와이드 오리피스 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher</td><td>9405120</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutane</td><td>Thermo Fisher</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

히 알루 론 산 기반 hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

세포종 (GBM)은 가장 일반적인, 그러나 가장 치명적인, 중추 신 경계 암 이다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 어떻게는 세포 외 기질 (ECM) 히 알루 론 산 (HA) 등 독특한 두뇌 환경의 용이 GBM 진행 및 내 습에 집중 했다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 문화 모델 GBM 세포는 ECM의 컨텍스트 외부 포함. GBM 셀 murine xenografts 또한 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 모델 어렵게 종양 동작으로 복잡 한 종양 microenvironment의 개별 특징의 기여를 분리. 여기, 우리는 하 하이드로 겔-기반, 3 차원 (3D) 문화 플랫폼 연구원 하 농도 및 강성 독립적으로 변경할 수 있도록 설명 합니다. 높은 분자량 HA 및 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)는 마이클 형 추가 라이브 세포의 존재를 통해 가교 된 hydrogels를 구성 됩니다. 3D 하이드로 겔 문화 환자 파생 GBM 세포 전시 생존 및 확산의 속도 만큼 좋은, 또는 때 교양으로 표준 gliomaspheres 보다 더 있습니다. 하이드로 겔 시스템은 또한 특정 세포-ECM 상호 작용의 효과 분리 하는 ECM 모방 펩 티 드의 수 있습니다. Hydrogels 광학 투명는 라이브 셀 3D 문화에 몇 군데 있습니다. 마지막으로, 하 히드로 문화 분자 및 세포 분석, PCR, 등 서 부 럽 cryosectioning 뒤에 면역 형광 염색 법에 대 한 표준 기술로 호환 됩니다.

Thiolated 하의 각 배치에 대 한 thiolation 정도 H1-NMR 또는 덮어의 테스트를 사용 하 여 확인 한다. 하 수정 여기 일관 되 게 설명 하는 절차를 사용 하 여 생성 (정의 하과 thiols의 어 금 니 비율) ~ 5 %thiolation (그림 1).
이 새로운 문화 플랫폼 설정 대규모 실험을 구현 하기 전에 좋은 문화 생존을 보장 하기 위해 엄격한 테스트를 수행할 각 연구실을 요구할 것 이다. 우리의 80 µ L hydrogels는 시드 밀도 500000 셀/mL (40, 000 셀/젤)와 지속적으로 확산 속도 비교, 또는 gliomasphere 문화 (그림 2A-2 C...

여기, 우리 두뇌 매트릭스를 모방 하도록 설계 하는 기가 가변 생체 내의 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한 프로토콜을 제시. 이 접근 한 생체 외에서세포종 세포 vivo에서 일반적으로 문화에서 길을 잃 었의 많은 특성을 유지 하는 실험 플랫폼을 제공 합니다.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

이 방법은 교모세포종 종양에 대한 주요 질문과 세포외 기질이 치료 저항성을 촉진하는 방법에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 적응형 3D 세포 배양 플랫폼의 모듈식 구축을 가능하게 하며, 이는 네이티브 뇌에 더 근접한 환경에서 환자 유래 교모세포종 세포를 배양하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 깨끗하고 건조한 실리콘 고무 몰드를 비조직 배양 처리된 12웰 플레이트의 각 웰에 놓고 피펫 팁의 깨끗하고 뭉툭한 끝을 사용하여 몰드를 플레이트 바닥에 부착합니다.주형과 웰 바닥 사이의 밀봉을 확인한 후, 원심분리를 통해 교모세포종 세포 배양에서 해리된 신경교종구를 수집하고 펠릿을 1ml의 세포 해리 효소에 다시 현탁시킵니다. 실온에서 5분 후 튜브를 가볍게 두드려 교반하고 4ml의 완전한 배지로 효소 반응을 멈춥니다. 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 1ml의 새로운 완전한 배지에 다시 현탁시킨 후 70마이크로미터 필터를 통해 세포를 걸러냅니다.추가로 4ml의 완전한 배지로 스트레이너를 세척하고 현탁액을 8 곱하기 10의 두 부분 표본으로 네 번째 세포당 원심분리기 튜브에 분할합니다. 원심분리를 통해 세포를 수집하고 금형당 80마이크로리터의 갓 준비된 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 또는 PEG-Mal-RGD에 펠릿 1개를 다시 현탁시키고 곰팡이당 새로 준비된 PEG-Mal-CYS 용액 80마이크로리터에 펠릿 1개를 다시 현탁시킵니다. 200마이크로리터 너비의 오리피스 마이크로피펫 팁을 사용하여 각 고무 실리콘 몰드에 40마이크로리터의 히알루론산 용액을 첨가한 다음 40마이크로리터의 PEG-Mal-CYS 또는 PEG-Mal-RGD 셀 용액을 추가합니다.빠르게 피펫팅을 위아래로 하여 금형당 10회 이상 혼합하지 마십시오. 겔화 시간이 빠르기 때문에 두 개의 하이드로겔 성분이 혼합되면 넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 용액을 빠르고 철저하게 혼합하는 것이 중요합니다. 이 단계는 연습이 필요합니다.그런 다음 겔로 캡슐화된 세포를 섭씨 37도의 5%CO2 세포 배양 인큐베이터에 5-10분 동안 놓습니다. 배양이 끝나면 각 겔에 2-2.5ml의 배양 배지를 추가하고 멸균 2마이크로리터 피펫 팁과 집게를 사용하여 금형 측면에서 겔을 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 멸균된 집게를 사용하여 플레이트 웰에서 곰팡이를 제거하고 플레이트를 세포 배양기로 다시 넣습니다.단일 세포 추출의 경우, 적절한 실험 종말점에서 웰

hyaluronic-acid-based-hydrogels-for-3-dimensional-culture-patient

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 신경교세포의 3차원 배양을 확립하는 기술을 보여줍니다. 쥐 뇌 유래 신경교세포는 세포외 기질 성분을 포함하는 광가교결합 가능한 고분자 기질 내에 캡슐화되어 있습니다. 성장 배지에서 배양하면 신경교세포가 지지 매트릭스 내에서 증식하여 3차원 배양을 생성합니다.

쥐의 뇌 유래 신경교세포(Rat Brain-derived glial cell)의 3차원 배양 확립

이 동영상은 뇌종양에서 유래한 신경교종구(gliomasphere)가 어떻게 단세포로 분리되어 히알루론산 기반 하이드로겔에 캡슐화되는지 보여줍니다. 이 과정은 세포-세포 상호 작용을 촉진하여 구조화된 3차원 교모세포종 모델을 형성합니다.

교모세포종 세포의 3차원 배양을 위한 히알루론산 기반 하이드로겔

교모세포종 다형성의 환자 유래 이종이식편은 3D 인간 바이오겔 배양 시스템을 사용하여 살아있는 미세종양으로 소형화할 수 있습니다. 이 생체 내 유사 3D 종양 분석은 키노믹 분석을 포함한 약물 반응 검사 및 분자 프로파일링에 적합합니다.

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

여기에서는 종양 스페로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조한 후 하이드로겔 캡슐화를 수행할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 널리 적용 가능합니다. 스페로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하고 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축하는 데 특히 유용할 것입니다.

스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화

간질액 흐름을 포함하는 침습적 전면부에서 신경교종 종양 미세환경을 복제하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 유체 압력 헤드를 적용할 수 있는 조직 배양 삽입물에 포함된 히알루론산-콜라겐 I 하이드로겔입니다. 침입을 정량화할 수 있으며 세포를 분리하거나 용해할 수 있습니다.

간질 흐름이 있는 침습적 신경교종 미세환경의 광중합 가능한 히알루론산-콜라겐 모델

여기에서는 지방 유래 줄기 세포(ADSC) 배양을 위한 3차원(3D) 세포 배양 프레임워크로 하이드로겔을 사용하는 방법을 시연하고 3D 배양 환경 내에서 ADSC의 증식을 향상시키기 위해 광생물 조절(PBM)을 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

광생물조절 증강을 이용한 하이드로겔 내 지방 유래 줄기세포의 3차원 세포 배양

우리는 새로 진단되고 재발한 종양에서 생성된 환자 유도 자기 교모세포를 이용한 3D 교모세포종 이동 모델을 제시합니다. 이 플랫폼은 환자별 이동 역학을 시각화하고 치료 효과 평가를 가능하게 합니다. 이 분석법은 이동 후 다중화되어 단백질 위치와 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.

저산소 조건에서 자기 나노입자를 이용한 구형 위치 측정을 이용한 재현 가능한 3D 교모세포종 이동 검사

배우세요 히알루론산 기반 하이드로겔을 이용해 환자 유래 교모세포종 세포를 3차원 배양하는 방법을. 이 기술은 종양 미세환경을 모사하여 치료 내성 메커니즘 연구에 활용됩니다.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

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