히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

이 방법은 교모세포종 종양에 대한 주요 질문과 세포외 기질이 치료 저항성을 촉진하는 방법에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 적응형 3D 세포 배양 플랫폼의 모듈식 구축을 가능하게 하며, 이는 네이티브 뇌에 더 근접한 환경에서 환자 유래 교모세포종 세포를 배양하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 깨끗하고 건조한 실리콘 고무 몰드를 비조직 배양 처리된 12웰 플레이트의 각 웰에 놓고 피펫 팁의 깨끗하고 뭉툭한 끝을 사용하여 몰드를 플레이트 바닥에 부착합니다.

주형과 웰 바닥 사이의 밀봉을 확인한 후, 원심분리를 통해 교모세포종 세포 배양에서 해리된 신경교종구를 수집하고 펠릿을 1ml의 세포 해리 효소에 다시 현탁시킵니다. 실온에서 5분 후 튜브를 가볍게 두드려 교반하고 4ml의 완전한 배지로 효소 반응을 멈춥니다. 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 1ml의 새로운 완전한 배지에 다시 현탁시킨 후 70마이크로미터 필터를 통해 세포를 걸러냅니다.

추가로 4ml의 완전한 배지로 스트레이너를 세척하고 현탁액을 8 곱하기 10의 두 부분 표본으로 네 번째 세포당 원심분리기 튜브에 분할합니다. 원심분리를 통해 세포를 수집하고 금형당 80마이크로리터의 갓 준비된 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 또는 PEG-Mal-RGD에 펠릿 1개를 다시 현탁시키고 곰팡이당 새로 준비된 PEG-Mal-CYS 용액 80마이크로리터에 펠릿 1개를 다시 현탁시킵니다. 200마이크로리터 너비의 오리피스 마이크로피펫 팁을 사용하여 각 고무 실리콘 몰드에 40마이크로리터의 히알루론산 용액을 첨가한 다음 40마이크로리터의 PEG-Mal-CYS 또는 PEG-Mal-RGD 셀 용액을 추가합니다.

빠르게 피펫팅을 위아래로 하여 금형당 10회 이상 혼합하지 마십시오. 겔화 시간이 빠르기 때문에 두 개의 하이드로겔 성분이 혼합되면 넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 용액을 빠르고 철저하게 혼합하는 것이 중요합니다. 이 단계는 연습이 필요합니다.

그런 다음 겔로 캡슐화된 세포를 섭씨 37도의 5%CO2 세포 배양 인큐베이터에 5-10분 동안 놓습니다. 배양이 끝나면 각 겔에 2-2.5ml의 배양 배지를 추가하고 멸균 2마이크로리터 피펫 팁과 집게를 사용하여 금형 측면에서 겔을 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 멸균된 집게를 사용하여 플레이트 웰에서 곰팡이를 제거하고 플레이트를 세포 배양기로 다시 넣습니다.

단일 세포 추출의 경우, 적절한 실험 종말점에서 웰에서 상층액을 제거하고 각 웰의 겔 배양액을 개별 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 500마이크로리터의 세포 해리 효소로 겔을 섭씨 37도에서 5분 동안 가끔 톡톡 치면서 배양한 다음 혼합물을 얼음 위의 튜브당 5밀리리터의 완전한 배지가 들어 있는 개별 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 20게이지 바늘이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 바늘 끝을 통해 각 세포 현탁액을 8회 부드럽게 흡인하고 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 혼합물을 여과하여 새로운 50ml 원심분리기 튜브로 만듭니다.

하이드로겔에서 세포를 해리할 때 세포막 무결성을 손상시킬 수 있는 깎아지기가 발생하지 않도록 주사기 플런저를 천천히 눌러야 합니다. 5ml의 신선한 배지로 스트레이너를 세척하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 염색 및 분류를 위해 적절한 유세포 분석 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

절단을 위해 하이드로겔을 동결 보존하려면 플레이트 웰에서 상등액을 제거하고 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 4% 파라포름알데히드 2ml로 겔 배양물을 배양합니다. 다음날 아침, PBS에서 고정제를 5% 자당 2ml로 교체하여 실온에서 1시간 배양합니다. 배양이 끝나면 PBS에서 5% 자당을 2밀리리터의 20% 자당으로 교체하여 실온에서 30분 동안 두 번 배양합니다.

두 번째 30분 배양 후 20% 자당을 한 번 더 새로 고쳐 하룻밤 동안 섭씨 4도의 배양을 합니다. 다음날 아침, PBS 용액의 자당을 최적의 절단 온도 또는 OCT 매체에서 20% 자당으로 부드럽게 교체하고 각 젤을 완전히 덮도록 주의하고 플레이트를 섭씨 4도에서 추가로 3시간 동안 놓습니다. 배양이 끝나면 크고 편평한 주걱을 사용하여 각 젤을 임베딩 몰드 중앙으로 조심스럽게 옮기고 몰드의 상단 가장자리 바로 아래에 순수한 OCT로 임베딩 몰드를 채웁니다.

그런 다음 냉각된 2-methylbutane에서 하이드로겔 샘플을 동결하고 표준 프로토콜에 따라 하이드로겔 샘플을 저온 유지 장치에서 절단합니다. 80마이크로리터 하이드로겔을 겔 밀도당 10에서 4번째 세포의 4배에 수용하면 신경교구 배양과 비슷하거나 더 나은 증식 속도가 일관되게 나타납니다. 예를 들어, 캡슐화 4일 후 하이드로겔을 함유한 RGD의 교모세포종 세포는 침습적 표현형을 나타내는 반면 PEG-Mal-CYS를 사용하여 하이드로겔에서 배양된 세포는 구형 형태를 나타냅니다.

이러한 강력한 배양을 통해 하이드로겔에 통합된 RGD와 세포의 상호 작용을 경쟁적으로 방해하는 용해성 cyclo RGD와 같은 시약의 효과를 평가할 수 있습니다. 생물 발광 이미징을 사용하면 예를 들어 12일 엘로티닙 치료 과정 동안 하이드로겔 배양에서 생존 가능한 세포의 상대적인 수를 관찰할 수 있습니다. 절단된 폴리 ADP 중합효소의 웨스턴 블롯 분석은 처리된 CD44 녹다운 세포의 상대적 세포사멸 정도가 0.5% 히알루론산 하이드로겔에서 배양된 야생형 교모세포종 세포에서 관찰된 것보다 높다는 것을 나타냅니다.

또한 하이드로겔 기반 3D 배양의 동결 절편은 배양된 세포에 의해 침착된 세포 외 기질을 보존합니다. 예를 들어, 엘로티닙 치료 시 4형 콜라겐 변화의 침착 패턴을 분석할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 히알루론산의 각 배치의 티올화 정도를 평가하는 것이 중요합니다.

세포 캡슐화 실험을 수행할 때마다 새로운 전구체 용액을 구성하는 것도 중요합니다. 이 기술의 개발은 암 연구자들이 생체 외 모델을 사용하여 신규 및 기존 치료법의 효능을 평가하고 치료 저항성 및 뇌암 진행 메커니즘을 탐구