Name: CRISPR/Cas9와 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 편집 진 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9와 Cre-Lox 시스템을 활용한 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 방법입니다. 이 기술은 다가백신 개발을 위한 효율적인 항원 도입과 GFP 기반 세포 분류를 통해 신속한 백신 개발이 가능합니다.

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저자 피파 Hawes confocal 영상 도움 감사 합니다. 이 프로젝트는 생명 공학에 의해 지원 되었다 고 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC) 부여 게시판/E/I/00007034 및 BB/L014262/1.

1. Cas9/gRNA 식 및 기증자 구성 준비
<ol><li>
Cas9/gRNA 식 플라스 미드의 건설
	<ol>
<li>GRNA 시퀀스 HVT22위에서 설명한 대로의 UL45 및 UL46 유전자 사이 intergenic 지역 대상으로 디자인. 배제 HVT 게놈에서 어떤 잠재적인 오프 대상 시퀀스 HVT 게놈에 대 한 가이드 RNA 대상 시퀀스를 정렬 합니다. 합성 하 고 UL45/46 지역 및 pX459 v 222이전에 설명 된 대로 게시 된 데이터23 에서 sg-A 시퀀스를 대상으로 하는 gRNA 시퀀스를 복제. 생어 시퀀싱 U6 Fwd 뇌관24를 사용 하 여 복제 gRNA 시퀀스를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기증자 플라스 미드의 건설
	<ol>
<li>VP2 식 카세트 이동식 GFP 기자 카세트와 태그를 포함 하는 기증자 플라스 미드를 생성 하려면 oligos 기증자-F와 기증자-R (그림 1A 와 그림 3A)는 다음과 같은 요소가 포함 된 디자인: sg-A 대상 시퀀스 끝, GFP 기자 카세트 복제 및 절단, 두 LoxP 시퀀스와 형벌 PacI 사이트와 VP2 식 카세트의 복제에 대 한 두 개의 SfiI 사이트에서.</li>
		<li>PGEM-T-쉬운 벡터에 시퀀스를 복제 하 고, 다음, pGEM-sgA-GFP-VP222로 지정 된 기증자 플라스 미드를 생성 하는 결과 벡터에 GFP와 VP2 유전자 카세트를 복제. 참고: 모든 복제 벡터 기증자 플라스 미드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플라스 미드 DNA 준비
	<ol>
<li>기증자 플라스 미드와 Cas9/gRNA 식 플라스 미드 DNAs 제조업체의 지침에 따라 상업 DNA 추출 키트를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9-중재 노크-에서: Transfection 및 감염
<ol><li>Transfection, 전날 transfection/감염, 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 %tryptose 인산 염 국물, 스-100 U/mL 페니실린, 보충 M199 매체에서 10 일 된 배아를 사용 하 여 병아리 태아 섬유 아 세포 (CEFs)을 준비 하 고 0.25 µ g/mL fungizone입니다. 매체의 2.5 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 잘 당 종자 1.3 x 106 셀. 참고: CEF 세포 보관 하실 수 있습니다 3 d 4 ° c.에</li>
	<li>CEF 셀 (2.1에서 준비 단계) UL45/46-gRNA의 0.5 µ g, sg-a, 0.5 µ g와 pGEM-sgA-GFP-VP2 제조업체의 지침에 따라 적절 한 transfection 시 약을 사용 하 여의 1 µ g transfect (5% CO238.5 ° C)에 인큐베이터에 12 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>Cas9/gRNA 및 기증자 플라스 미드의 12 h posttransfection 1 x 105 pfu/mL에 M199 문화 매체와 HVT 바이러스 재고 희석. Transfected 세포의 각 음에 희석된 바이러스의 130 µ L을 추가 하 고 바이러스의 동일한 수량으로 부정적인 컨트롤로 untransfected 셀의 한 우물을 설정. 5% CO238.5 ° C에서 3 d 페/감염 된 세포를 품 어. 모든 절차는 공동 코드의 연습 (JCoPR)는 funders에 의해 승인를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
</ol>3. 수확 및 HVT 재조합 바이러스의 정화
<ol><li>
형광 활성화 된 세포 분류
	<ol>
<li>정렬 하기 전에 잘 일 당 2 × 104 CEF 셀 미리 두 96 잘 접시를 준비 합니다.</li>
		<li>CEFs 3 d 바람직합니다 페/감염 trypsinize 각 우물에서 매체를 발음 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 셀 시트를 헹 굴. Trypsinize 약 5 분 동안 38.5 ° C 배양 기에서 세포를 트립 신-EDTA (0.48 m m) 0.05%의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Resuspend와 microcentrifuge 튜브 1.5 mL FBS의 50 µ L로 세포를 전송. 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기.</li>
		<li>1%와 PBS의 1 mL에 셀 resuspend FBS. hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 1 x 106 셀/mL을 셀 수를 조정 합니다. 참고: 셀 1-2 h에 대 한 얼음에 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>폴리스 티 렌 그것의 여과기 모자를 통해 튜브를 정렬 하는 셀을 전송 합니다. 제조업체의 지시에 따라 셀 정렬을 사용 하 여 CEFs로 시드 96 잘 접시에 GFP를 표현 하는 단일 셀을 정렬 합니다. 5 d 5% CO238.5 ° C에서 정렬된 셀을 품 어. 참고: 재조합 형 바이러스에의 한 통로 경우 너무 많은 단일 GFP 식 세포와 원래 잘에서 몇 GFP-긍정적인 플 라크를 정렬 하기 전에 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재조합 형 바이러스 뿌리고
	<ol>
<li>1.3 통과 하기 전에 잘 하루 106 CEF 셀 x와 시드 6-잘 접시를 준비 합니다. 5 d postsorting, 형광 현미경 96 잘 접시를 확인 합니다. 단일 GFP-긍정적인 패를 포함 하는 우물을 표시 합니다. 참고: 그림 2A 대표 GFP-긍정적인 플 라크에 대 한 참조.</li>
		<li>트립 신-EDTA 3 분의 50 µ L로 잘 각 GFP-긍정적인 trypsinize 추가 문화 매체의 50 µ L, resuspend 하 고 CEFs와 6 잘 플레이트 한 우물으로 셀을 전송. 이 1 세대 재조합 HVT의 될 것입니다.</li>
		<li>재조합 형 바이러스 3 d 나중의 1 세대를 수확, 중간 포함 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 80% 문화 매체, 동결의 1 mL에 각 한 유리병 아래로 고정 하 고 액체 질소에 바이러스를 저장 합니다. 참고: 바이러스의 확산 및 용량에 따라 2-4 d에서 수확 시간이 달라 집니다.</li>
		<li>바이러스의 각 1 세대의 1 x 105 셀을 수집 하 고, 원심은 상쾌한 삭제. 세포 DNA 추출-20 ° C에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
연쇄 반응에 의해 게놈 삽입의 검출
	<ol>
<li>DNA 추출에 대 한 서 리 없애다과 단계 3.2.4 버퍼를 첨 벙 첨 벙의 50 µ L에서에서 셀 펠 릿 resuspend (10 mM Tris HCl [pH 8], 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, 그리고 200 µ g/mL 가수분해 K) 30 분 동안 65 ° C에서 샘플을 lyse 고 고 다음, 가수분해 K. 비활성화를 2 분 동안 95 ° C에</li>
		<li>중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 3' 접합 뇌관으로 (표 1) DNA 샘플의 1 µ L를 사용 하 여 수행 합니다. 각 샘플에 대 한 준비 얼음에 다음 20 µ L 반응 혼합: PCR 주인 혼합 x 2 (10 µ L), 10 µ M 업스트림 뇌관 (0.5 µ L), 10 µ M 다운스트림 뇌관 (0.5 µ L), DNA (1 µ L), 템플릿과 nuclease 무료 물 (8 µ L). 증폭 프로그램은: 95 ° C 2 분; 95 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 그리고 40 72 ° C s 35 주기; 72 ° C 1 %agarose 젤 젤 전기 이동 법에의 한 음을 증폭 제품의 7 분 부하 2 µ L에 대 한. 참고: 그림 2A 3' 접합 PCR의 대표적인 결과 대 한 참조.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 시스템 통해 Cre lox 형광 성 취재 원 유전자의 절단
<ol><li>재조합 형 바이러스에서 GFP 유전자를 제거, Cre recombinase 식 플라스 미드의 2 µ g 6 잘 플레이트에 transfect CEF 셀, 제조업체의 지시에 따라 transfection 시 약을 사용 하 여 미리.</li>
	<li>12 h posttransfection, 액체 질소에서 재조합 형 바이러스에의 한 유리병에 서 리 없애다, 부드럽게 resuspend, transfected 세포의 각 음에 50 µ L 씨 고 하나 잘 바이러스의 동일한 금액으로 부정적인 컨트롤로 설정 합니다. 5% CO238.5 ° C에서 3 d에서 품 어.</li>
</ol>5. 플 라크 정화
<ol><li>
형광 활성화 된 세포 분류
	<ol>
<li>정렬 하기 전에 잘 일 당 2 × 104 CEF 셀 씨 두 96 잘 접시.</li>
		<li>정렬에 감염 된 세포를 준비 (4 단계)에서 단계 3.1 72 h 바람직합니다에 설명 된 절차를 따릅니다. CEFs와 시드 96 잘 접시로 단일 nonfluorescence 셀을 정렬 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재조합 형 바이러스 및 PCR 확인 뿌리고
	<ol>
<li>5-10 단일 nonfluorescence 패 5 d postsorting, 트립 신-EDTA 3 분, 38.5 ° C에서의 50 µ L 함께 trypsinize와 resuspend 셀 문화 매체의 50 µ L를 추가 선택 합니다. 참고: 그림 2B 대표 GFP 네거티브 플 라크에 대 한 참조.</li>
		<li>2 세대로 CEFs와 미리 6 잘 플레이트의 각 음에 셀의 절반을 전달 합니다.</li>
		<li>5 분 동안 200 x g 에서 각 클론의 나머지 세포를 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 셀 DNA 추출에 대 한 버퍼를 첨 벙 첨 벙의 50 µ L resuspend.</li>
		<li>3.3.2 단계에서 설명한 대로 동일한 PCR 반응 조건으로 DNA 템플렛의 1 µ L를 사용 하 여 5' 접합 뇌관 (표 1)으로 PCR을 수행 합니다. 참고: 그림 2B 5' 접합 PCR의 대표적인 결과 참조 하십시오.</li>
		<li>PCR 결과에 따라 달라 집니다, 추가 구절 및 검증을 위한 재조합 형 HVT의 3 ~ 5 긍정적인 클론을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 재조합 형 HVT의 확인
<ol><li>
간접 면역 형광 분석 결과
	<ol>
<li>재조합 HVT 감염 전날 105 CEFs x 2.5 시드 24-잘 접시에 단계 5.2에서에서 얻은의 두 번째 세대와 함께 CEFs를 감염. 세포 배양 매체 48 h 바람직합니다 제거 하 고 셀을 해결 하기 위해 PBS에 4 %paraformaldehyde 500 µ L를 추가. 30 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어,는 정착 액을 제거 하 고 세척 셀 레이어 3 x PBS. 참고: 셀 저장할 수 있습니다이 단계에서 4 ° C에서 몇 주 동안.</li>
		<li>PBS를 제거 하 고 추가 500 µ L 0.1%의 15 분 세척 셀에 대 한 세포를 permeabilize에 Triton X-100 레이어 PBS 가진 3 배.</li>
		<li>블로킹 버퍼 (PBS에 5% 소 세럼) 1 시간을 추가 하 여 블록 일반적인 바인딩.</li>
		<li>1 차적인 항 체 안티 VP2 단일 클론 항 체 차단 버퍼에서 1: 200에서 닭 혈 청 HH7 또는 HVT 감염을 묽 게 하십시오, 잘, 당 200 µ L을 추가 하 고 1 h. 세척 셀 레이어 PBS 가진 3 배 대 한 실 온에서 품 어.</li>
		<li>이차 항 체 염소 반대로 마우스 IgG 알 렉 사 568 또는 염소 항 치킨 IgG 알 렉 사 488 블로킹 버퍼에서 1: 200 희석, 잘 당 200 µ L을 추가, 1 시간, 실 온에서 품 어와 셀 3 세척 PBS와 x. 형광 현미경에서 단백질 발현을 확인 하십시오. 주: 결과 얼룩이 지기 대표 VP2 그림 4 를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VP2 유전자의 시퀀싱
	<ol>
<li>고 충실도 DNA 중 합 효소와 뇌관 UL45-f 1와 UL46-R1 (표 1) 전체 삽입 감지 UL45 및 UL46 intergenic 지역에 걸친 DNA 순서를 증폭.</li>
		<li>다음 50 µ L 반응 혼합 준비: 5 µ L 10의 x Pfx 반응 혼합, 10 µ M 상류의 1.5 µ L 및 다운스트림 뇌관 믹스, 10mm dNTP 믹스의 1 µ L, 50 mM MgSO4의 1 µ L, DNA 템플렛의 1 µ L 그리고 Pfx DNA 중 합 효소의 0.5 µ L 50 µ L nuclease 무료 물 추가. 증폭 프로그램은: 95 ° C 2 분; 95 ° C 15에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 그리고 35 사이클에 대 일 분 68 ° C. 젤 전기 이동 법에 대 한 1 %agarose 젤에 PCR 제품의 모든 로드.</li>
		<li>명령 다음에 DNA 젤 정화 키트의 PCR 제품을 정화. PCR 제품 (30 ng / µ L)의 10 µ L VP2 유전자의 노크에서 확인 하는 시퀀싱 회사에 보내기.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7입니다. 재조합 바이러스의 안정성
<ol><li>각 T25 플라스 크 바이러스 확장 하기 전에 하루에 씨 2.6 x 106 CEF 셀.</li>
	<li>5.2; 단계에서 적어도 3 개의 긍정적인 클론을 녹여 각 T25 플라스 크에 세포/바이러스에의 한 병을 추가 합니다. 50 %cytopathic 효과 관찰 될 때까지 5% CO2 38.5 ° C에서 품 어.</li>
	<li>세포 배양; 2 mL에 수확 다음 세대를 위해 CEF 셀 미리 새로운 T25 플라스 크를 50 µ L를 감염. 적어도 15 세대를 위한 재조합 형 바이러스를 뿌리고 계속. 각 세대 바이러스 VP2 시퀀스의 존재에 대 한 PCR 및 재조합 형 바이러스의 안정성을 평가 하기 위해 VP2 식 간접 면역 형광 분석 결과 (IFA)의 분석.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

CRISPR/Cas9 시스템 유전자 편집 하는 유용한 도구가 되고있다. 재조합 동종 재결합13 등 BAC mutagenesis 기술25, HVT 벡터 개발에 대 한 전통적인 기술 일반적으로 벡터 클로닝 및 선택으로 대규모 심사의 여러 라운드를 포함 몇 개월 걸릴 수 있습니다. Cre Lox 시스템 및 단일 세포 분류는 NHEJ-CRISPR/Cas9-기반 전략을 사용 하 여 여기 설명 된 프로토콜은 재조합 백신 세대에 더 편리 하 고 효율적 하 고 빠른 접근 이다. 이 파이프라인을 사용 하 여, 재조합 바이러스만 1-2 주24에서 얻어질 수 있다 그리고 플 라크 정화 단계17정렬 형광 활성화 된 세포를 사용 하 여 단일 라운드 분리도 줄일 수 있다. 1 개월 이내 취득 순화 된 재조합 형 HVT 바이러스 gRNA 디자인 및 기증자 건설에서 전체 프로세스를 구현할 수 있습니다. 성공적인 재조합 형 HVT 세대를 위한 중요 한 단계 포함 외국 유전자 삽입, Cas9에 대 한 기회를 최대화 하기 위해 높은 transfection 효율에 대 한 효율적인 분열을 보장 하기 위해 바이러스 성 게놈을 대상에 대 한 높은 효율 gRNA 선택 / gRNAs 고 편집, 동일한 셀에 기증자 및 gRNA 플라스 미드의 transfection 그리고 Cas9와 gRNA는 바이러스 세포에 도달 하기 전에 합리적인 수준에서 표현 될 수 있도록 바이러스 감염 12 시간 간격에 맞게 바이러스.
HVT 재조합 세대에 대 한 한계는 GFP-긍정적인 식별의 복잡성 접합 PCR에 의해 클론 이다. GFP VP2 카세트 어느 방향에 삽입 될 수 있습니다. PCR는 여기에 설명 된 접합 감각 방향에서 삽입의 식별은 이다. 센스 방향으로 삽입 하는 경우 PCR 설명 뇌관 쌍을 사용 하 여 작동 하지 않을, 그리고 내부 뇌관이이 목적을 위해 교환할 수 있는. 또 다른 잠재적인 문제는 기증자 구성만 사용할 수 있습니다 GFP 제거 후 나머지 LoxP 시퀀스의 존재 때문에 동일한 바이러스에 하나의 유전자 삽입에 대 한 Cre 치료 이다. 변종 LoxP 시퀀스 새로운 기증자 구문은 여러 삽입 목적을 위해 대신 사용 될 수 있습니다.
NHEJ와 HDR (homology 감독 수리) Cas926,27에 의해 만들어진 더블-좌초 틈 (DSBs) 복구 두 경로입니다. NHEJ는 HDR 덜 효율적 이며, S g 2 단계6,,2930중에 발생 하는 반면 세포 주기28일에 걸쳐 발생으로 더 효율적입니다. 우리는 대상된 위치에 외래 유전자를 도입 하 여기 더 효율적인 NHEJ 복구 통로 악용. 비록는 NHEJ 복구 소개 indels 쪼개진된 기증자 시퀀스와 게놈 DNA는 indels 사이 homology 독립적인 mechanistically 유연한 프로세스31,32 noncompatible 또는 손상 된 DNA 끝에 가입 하 여 sgA, 분열 사이트에서에 발생 하 고 외국 유전자 발현 카세트에 영향을 받지 않습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 NHEJ는 homology 팔 공사의 제한에서 무료로 매우 간단 단계 복제 만들기입니다. 이 외래 유전자 삽입을 위한 NHEJ의 응용 프로그램에 대 한 좋은 잠재력을 표시합니다. 둘 다 유니버설 gRNA 대상 사이트의 소개는 외국 유전자 카세트의 기증자 템플릿을 특정 gRNA 선택에 대 한 필요 없이 바로 생성 수 더 빠른 프로세스를 끝납니다. SgA 대상 사이트, LoxP 사이트 및 PacI SfiI 사이트를 포함 하는 기증자 플라스 미드의 백본 또한 간에 공유할 수 있습니다 광범위 하 게 다른 기자 유전자, 외래 유전자 발현 카세트, 그리고이 새로운 접근의 이점을 주는 다른 바이러스 벡터 사용자 지정입니다.
VP2 HVT 은닉 삽입이 원고; 프로토콜을 설명 하기 위해 사용 되었다 그러나, 동일한 접근 multivalent 재조합 형 HVT 벡터화 백신의 개발에 대 한 원하는 해당 시퀀스를 대상으로 하는 gRNA를 사용 하 여 HVT 게놈의 다른 genomic 위치의 더 바이러스 성 유전자를 삽입 하려면 사용할 수 있습니다. SB-1, CVI988, 전염 성 laryngotracheitis 바이러스, 오리 장 염 바이러스, 및 또한 다른 조류 DNA 바이러스, 수 두 바이러스, adenoviruses, 등 등 다른 조류 herpesviruses 등 다른 MDV 백신 긴장 또한 설계 될 수 있다 동일을 사용 하 여 multivalent 재조합 백신 개발을 위한 접근입니다. 여기 설명 된 CRISPR/Cas9 시스템 플랫폼을 사용 하 여 새로운 multivalent 벡터화 된 백신의 개발은 여러 가금류 질병 으로부터 보호 하기 위해가 금 산업에 대 한 매우 유리할 것 이다.

마렉의 질병 (MD)에 Alphaherpesvirinae의 인도의 속 Mardivirus serotype 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2])에 의해 유도 된 닭의 lymphoproliferative 질병이 이다. Mardivirus 는 또한 두 nonpathogenic serotypes 포함: serotype 2 (GaHV-3) 및 3 (MeHV-1, 역사적으로 HVT로 알려진) serotype 메릴랜드주에 대 한 백신으로 사용 되는 라이브 HVT 백신 (FC-126 스트레인) 1970 년대 초반에 사용 하는 MD 백신의 첫 번째 세대는 여전히 사용 되 고 널리가 고 다 원자가 백신 정립에 메릴랜드주에 대 한 향상 된 보호 기능을 제공 HVT은 다양성 및 모두 에서 비켜 피하 화장 관리 및 평생 면역을 제공 하는 기능에 대 한 안전 조류 질병의 숫자에 대 한 보호를 유도 하는 백신 벡터로 또한 널리 사용 됩니다. 재조합 형 HVT 백신을 생성 하는 전략 중 기존의 동종 재조합 바이러스에 감염 된 세포, 겹치는 cosmid DNAs, 또는 BAC mutagenesis2를 기반으로 합니다. 그러나, 이러한 메서드는 일반적으로 시간과 전송 벡터의 건설, 대장균, 플 라크 purifications에서 바이러스 성 게놈의 유지 보수 및 BAC 시퀀스와 선택의 제거를 요구 하는 노동 집약 편집된 바이러스3,4에서 표식입니다.
CRISPR/연결 (Cas9)은 최근 몇 년 동안 그것의 다양성 및 특이성 때문에 도구를 편집 하는 가장 인기 있는 유전자 이다. CRISPR/Cas9 시스템은 성공적으로 유전자 변형된 세포 및 동물 모델5,6,7,,89,10, 효율적인 세대에로 사용 뿐만 아니라 여러 큰 DNA 바이러스 게놈11,12,13,14,15,,1617, 조작 18,,1920. HVT 게놈21편집 CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 간단 하 고 효율적인 방법을 보고 후 우리는 신속 하 고 효율적인 재조합 HVT22세대에 대 한 파이프라인을 개발 했다.
이 방법의 잠재적인 응용 프로그램을 확장 하기 위하여 재조합 HVT 백신이이 보고서에서 UL45/46 로커 스에서 IBDV의 VP2 유전자 표현 형의 세대에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 접근 결합 NHEJ-CRISPR/Cas9 GFP 취재 원 유전자와 나중 GFP 식 카세트 제거 하 Cre LoxP 시스템 태그 VP2 유전자를 삽입 합니다. 전통적인 재결합와 BAC recombineering 기술에 비해, Cre Lox 시스템 함께 NHEJ-CRISPR/Cas9는 재조합 형 HVT 백신을 생성 하는 신속 하 고 효율적인 접근 방식을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>M199 배지, Earle's Salts</td><td>Life 기술</td><td>11150059</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신 15140148</td><td></td><td>항생제</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Sigma</td><td>1397-89-3</td><td>항진균제</td></tr><tr><td>Tryptose Phosphate Broth</td><td>Sigma</td><td>T8782</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>HVT Fc126 균주</td><td>조류 질병 및 종양학 실험실</td><td></td><td>야생형 HVT 바이러스</td></tr><tr><td>pX459-v2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #62988</td><td>Cas9 및 gRNA 발현 벡터</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector Systems</td><td>promega</td><td>A1360</td><td>공여체 벡터 클로닝</td></tr><tr><td>서브클로닝 효율 DH5&alpha; 유능한 세포</td>: <td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td>transformation</td></tr><tr><td>PacI</td><td>NEB</td><td>rR0547S</td><td>donor vector cloning</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>NEB</td><td>R0123S</td><td>donor vector cloning</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>cloning</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN</td><td></td><td>27106</td><td>plasmid extraction</td></tr><tr><td>TransIT-X2</td><td>Mirus</td><td>MIR 6004</td><td>형질주입</td></tr><tr><td>세포 배양 6-웰 플레이트</td><td>써모피셔 140675</td><td></td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>접합 PCR 증폭</td></tr><tr><td>플래티넘 PFX DNA 중합효소</td><td>Thermofisher</td><td>11708021</td><td>전체 삽입</td></tr><tr><td>염소 안티 닭 IgY (H+L) 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td>의 PCR 증폭면역형광 염색,</td></tr><tr><td>염소, 항생쥐, IgG 항체, Alexa Fluor 568</td>, <td>Invitrogen</td><td>A-11004</td>, <td>면역형광 염색,</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td>, <td>Leica Microsystems, Leica</td><td>TCS SP5, LASAF</td>, 면역<td>형광</td></tr><tr><td>FACS 세포 분류기</td>, <td>BD biosciences,</td><td>BD, FACSAria</td><td>단일 세포 분류</td></tr>, <tr><td>파라포름알데히드(PBS 중 4%)</td><td>Santa cruz 생명공학</td><td>SC-281692</td><td>세포 고정</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>GeneTex</td><td>GTX30960</td><td>투과화</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9와 재조합 조류 herpesvirus 벡터 생성 편집 진

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

칠면조 (HVT)의 herpesvirus가 이다는 이상적인 바이러스 성 벡터 bursal 전염병 (IBD) 등 조류 인플루엔자 (AI), 뉴캐슬 질병 (ND), 조류 질병의 숫자에 대 한 재조합 백신의 세대를 위한 세균성 인공적인 염색체 (를 사용 하 여 BAC) mutagenesis 또는 기존의 재조합 방법입니다. 클러스터는 정기적으로 회문 반복 (CRISPR) interspaced / Cas9 시스템 성공적으로 사용 되었습니다 많은 설정에서 유전자 편집에 대 한 몇 가지 큰 DNA 바이러스 게놈의 조작을 포함 한. 우리는 신속 하 고 효율적인 CRISPR/Cas9-중재 게놈 편집 파이프라인 재조합 HVT를 생성 하기 위해 개발 했습니다. 이 방법의 사용 가능성을 극대화 하기 위해 선물이 여기 IBDV의 VP2 단백질을 표현 하는 재조합 형 HVT를 생성의 방법론에 대 한 자세한 정보. VP2 식 카세트 삽입은 HVT 게놈 을 통해 (nonhomologous 끝-가입)는 NHEJ에-의존 수리 통로. 녹색 형광 단백질 (GFP) 식 카세트 쉽게 시각화에 대 한 삽입에 처음 연결 하 고 통해 Cre LoxP 시스템 제거. 이 방법은 다른 바이러스 성 항 원 재조합 백신의 급속 한 발전에 대 한 HVT 게놈으로 소개 하는 효율적인 방법을 제공 합니다.

그림 1어떻게 기증자 플라스 미드는 재조합 HVT (그림 1B 를 생성 하는 생성된 (그림 1A) 및 절차를 포함 재조합 형 HVT 백신의 생성에 사용 되는 전략을 설명 하는 ). 야생-타입 플 라크에 의해 포위 하는 5 ~ 30 GFP-긍정적인 패 유전자 웰 스 노크에 형광 현미경 3 d posttransfection 및-감염에서에서 관찰할 수 있습니다. 3' 접합 (그림 2A, 하단 패널) 예상 되는 크기의 PCR 제품을 보여주는 PCR 분석은 단일 셀 정렬 (그림 2A) 후 얻은 정제 바이러스. Cre recombinase 여 GFP 기자 절단 후 이상는 플 라크의 50% 그들의 GFP 식을 잃었다. GFP 절단 (그림 2B) 단일 셀 정렬 후 정화 패 추가 5' 접합 오른쪽 크기의 PCR 제품 (그림 2B, 하단 패널)를 보여주는 PCR에 의해 확인 되었다. 그림 3 에서 PCR 제품 다른 색된 요소와 두 접점의 시퀀싱 결과 보여준다. 그림 4에서 단백질 표정 VP2 특정 단일 클론 항 체와 안티 HVT 닭 혈 청 IFA에 의해 확인 되었다. 예상 했던 대로, 부모의 HVT 감염 세포 수만 얼룩이 질 안티 HVT 혈 청에 의해 (녹색), 재조합 형 HVT 감염 세포 명확 하 게 보여 잠시 VP2 유전자의 표현 (빨간색).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> 그림 1: 재조합 백신 HVT 벡터화의 세대에 대 한 전략. (A)이이 패널 표시 도식 기증자에 대 한 복제 전략의 플라스 미드 건설. 핵심 요소 삽입, 기자 GFP 카세트 LoxP 시퀀스, GFP의 절단에 대 한 형벌 및 VP2 식 카세트 방출에 대 한 두 개의 Cas9 대상 사이트 (sgA)를 포함 합니다. (B)이이 패널 2 단계 유전자 노크에서 전략의 개요를 보여 줍니다. GFP와 VP2 식 카세트 삽입 조각 Cas9/sgA 분열에 의해 발표 하 고 UL45/46 loci 통해 NHEJ-CRISPR/Cas9에서 HVT 게놈에 삽입. GFP-긍정적인 재조합 바이러스는 다음 정렬 하 고 정렬 (FACS) 단일 셀 형광 활성화 된 세포에 의해 정화. 그 후, GFP 취재 원 유전자 Cre recombinase에 의해 excised 그리고 재조합 형 바이러스 정화 및 특징. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> 그림 2 : 재조합 형 HVT 확인. (A)이이 패널 GFP-긍정적인 패 (HVT-GFP-VP2) 형광 현미경 (위 패널) 및 PCR 확인 HVT GFP VP2의 뇌관 VP2 F &amp; UL46-R1 3' 접합에 대 한 시각을 보여줍니다. (B)이이 패널에서는 시각 HVT-GFP-VP2, GFP 절단 후 패 (HVT VP2) 사용 하 여 Cre recombinase 및 HVT VP2의 PCR 확인 UL45-F1 및 VP2 R1 뇌관으로 접속점 5'에 대 한. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> 그림 3 : 재조합 형 HVT 바이러스의 분석 순서. (A)이이 패널에 있는 다른 색상에 핵심 요소의 시퀀스는 밑줄이 gRNA 대상 시퀀스와 UL45/46 사이 HVT intergenic 지역 및 Cas9 분열 사이트를 보여주는 화살 끝 VP2 식 카세트에 시퀀스 기울임꼴 소문자, Cas9 분열 사이트, LoxP 사이트 시퀀스 녹색, 파란색에서 두 SfiI 사이트 시퀀스를 보여주는 화살표와 빨간색에서 sg-A 대상 시퀀스 (B)이이 패널 시퀀스에 해당 색상으로 5'과 3' 접합 및 핵심 요소와 HVT VP2의 도식 프레 젠 테이 션의 시퀀싱 결과 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> 그림 4 : 재조합 형 HVT VP2의. 이 패널을 보여 줍니다 VP2 감염된 CEFs에서의 성공적인 식의 확인 간접 면역 형광 분석 결과 (IFA)에 의해 안티 VP2 단일 클론 항 체 HH7 (빨간색). HVT 감염 HVT 감염 닭 혈 청 (녹색)으로 IFA에 의해 확인 된다. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

칠면조 (HVT)의 herpesvirus 조류 질병의 숫자에 대 한 재조합 백신의 세대에 대 한 벡터 플랫폼으로 널리 사용 됩니다. 이 문서는 통합된 NHEJ-CRISPR/Cas9 및 Cre Lox 시스템을 사용 하 여 재조합 형 HVT 벡터화 백신의 세대에 대 한 간단 하 고 빠른 접근을 설명 합니다.

CRISPR/Cas9와 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 편집 진

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

이 접근법은 재조합 백신의 급속한 발달을 위해 HVT 게놈에 다른 바이러스 성 항원들을 소개하는 효율적인 방법을 제공합니다. 이 기술의 장점은 GFP 발현 카세트가 먼저 삽입에 부착되어 쉽게 시각화한 다음 Cre-LoxP 시스템에서 제거된다는 것입니다. 동일한 접근법은 다세대 재조합 백신의 개발을 위해 HVT 게놈또는 다른 조류 헤르페스 바이러스의 다른 위치에 더 많은 바이러스 유전자를 삽입하는 데 사용할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 세포 선별 전문가인 케이티 모퍼트(Katy Moffat)가 될 것입니다. 나탕, 야오요 장, 광강 쿠, 내 실험실에서 과학자. 이식 전날은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 병아리 배아 섬유아를 준비합니다.6 개의 웰 플레이트의 각 우물에 중간의 2.5 밀리리터에 130 만 개의 세포를 종자. CEF 세포를 각각 0.5 마이크로그램씩 트랜스펙트하여 두 Cas9 가이드 RNA 플라스미드, 및 제조업체의 지침에 따라 적절한 트랜스포이션 시약을 사용하여 기증자 플라스미드의 1마이크로그램이 있다. 12시간 동안 5%의 이산화탄소로 38.5도의 세포를 배양합니다.12시간 후 형질전환은 M199 배양 배지로 HVT 바이러스 육수를 밀리리터당 100, 000플라크 형성 단위로 희석한다. 희석된 바이러스의 130마이크로리터를 각 유전자감염 세포에 추가합니다. 감염되지 않은 세포의 우물 을 음수 대조군으로 설정하고 동일한 양의 바이러스를 추가합니다.3일 동안 5%의 이산화탄소로 38.5도의 세포를 배양합니다. 정렬 전날 각 우물에 20, 000 세포를 시드하여 두 개의 96 개의 우물 판을 준비합니다. 3 일 감염 후 전감염및 감염된 CEF를 포함하는 6개의 우물 판을 회수합니다.각 우물에서 배지를 흡인하고 PBS로 셀 시트를 헹구는 다. 각 우물에 0.05%의 트립신-EDTA의 1 밀리리터를 추가하고 약 5 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 38.5도에서 세포를 배양. 그런 다음, FBS의 50 마이크로 리터로 세포를 다시 중단하고 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로이 현탁액을 전송합니다.원심분리기는 5분 동안 200배의 중력으로. 1%FBS를 포함하는 PBS의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 혈종계를 사용하여 세포를 계산하고 셀 밀도를 밀리리터당 백만 세포로 조정합니다.다음으로, 스트레이너 캡을 통해 폴리스티렌 선별 튜브로 세포를 옮기십시오. 셀 선별기를 사용하여 GFP를 발현하는 단일 세포를 미리 시드된 96 웰 플레이트로 정렬한다. 5일 동안 5%의 이산화탄소로 분류된 세포로 플레이트를 배양합니다.5 일 후에 형광 현미경을 사용하여 96 개의 우물 판을 확인하고 단일 GFP 양성 플라크를 포함하는 우물을 표시합니다. 트립신-EDTA 의 50 마이크로 리터와 함께 잘 각 GFP 긍정적인 3 분. 그런 다음, 50 마이크로리터의 배양 배지를 추가하여 세포를 재일시 중단하고 이 현탁액을 CEF를 사용하여 6개의 웰 플레이트 중 하나의 우물로 옮킨다.3 일 후 동결 매체에 재조합 바이러스의 1 세대 각각의 하나의 유리병을 동결. 액체 질소에 이러한 수확 된 바이러스를 저장합니다. 바이러스의 1 차 세대의 각각에서 100, 000 세포를 수집합니다.세포를 2, 000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상체부를 폐기합니다. DNA 추출을 수행할 준비가 될 때까지 세포를 음의 섭씨 20도에 저장합니다. DNA 추출을 수행할 준비가 되면 50마이크로리터의 스퀴싱 버퍼를 사용하여 세포 펠릿을 해동하고 재보힙시다.30분 동안 섭씨 65도에서 샘플을 lyse한 다음 2분 동안 섭씨 95도에서 Proteinase K.를 비활성화하여 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 각 DNA 샘플의 마이크로리터 1개를 사용하여 3개의 프라임 접합 프라이머로 PCR 반응을 수행합니다. 증폭 제품의 마이크로리터 2개를 젤 전기포고증용 1%아가로즈 젤 1개웰에 적재합니다. 재조합 바이러스로부터 GFP 유전자를 제거하기 위해, CEF 세포로 미리 시드된 6개의 우물 판으로 Cre 재조합식 플라스미드의 2개의 마이크로리터를 트랜스펙트하기 위해 트랜스페션 시약을 사용한다.12 시간 후 연동 해동 액체 질소에서 재조합 바이러스의 하나의 유리병. 바이러스를 부드럽게 억제하고 50 마이크로리터를 전염된 세포의 각 우물로 부드럽게 재보종하여 동일한 양의 바이러스를 가진 음수 대조군을 설정합니다. 3일 동안 섭씨 38.5도에서 배양합니다.72 시간 감염 후 이전에 설명 된 대로 정렬을 위한 세포를 준비. 단일 비형광 세포를 CEF로 미리 시드된 96개의 웰 플레이트로 정렬합니다. 다음으로 선택한 플라크를 트립시화하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 해당 셀을 다시 일시 중지합니다.세포의 절반을 96개의 우물로 전달하여 2세대로 CEF와 미리 시드되었습니다. 각 클론의 나머지 셀을 5분 동안 200배 의 중력으로 원심분리합니다. 상체를 버리고 DNA 추출을 위한 50마이크로리터의 스퀴싱 버퍼로 세포를 다시 중단합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 템플릿의 마이크로리터 1개를 사용하여 5개의 프라임 접합 프라이머로 PCR을 수행합니다. PCR 결과에 따라 추가 통로 및 검증을 위해 재조합 HVT의 3~5개의 양성 클론을 선택합니다. 첫째, 2세대 재조합 HVT를 전시드 24웰 플레이트에 감염시다.감염 후 48시간 동안 배양 배지를 제거하고 PBS에 4%파라포름알데히드의 500마이크로리터를 추가하여 세포를 고치게 한다. 실온에서 30분 동안 배양하세요. 다음으로, PBS로 고정을 제거하고 세포 층을 세 번 세척한다.PBS를 제거하고 세포를 침투하기 위해 0.1% Triton X-100의 500 마이크로리터를 추가합니다. 15 분 후 PBS로 세포 층을 세 번 씻습니다. 비특이적 바인딩을 차단하기 위해 1시간 동안 차단 버퍼를 추가합니다.이어서, 1차 항체 항체 항체 인 VP2 단클론 항체 HH7 또는 HVT 에 감염된 닭 혈청을 블로킹 버퍼에서 1~200에서 희석한다. 희석된 1차 항체 200마이크로리터를 각 우물에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS로 셀 층을 세 번 씻으시면 됩니다.이차 항체 염소 안티 마우스 IgG 알렉사 568 또는 염소 안티 치킨 IgG 알렉사 488 차단 버퍼에 1 ~ 200에 희석. 희석된 이차 항체 200마이크로리터를 각 우물에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다.형광 현미경을 사용하여 단백질 발현을 확인하십시오. 바이러스 팽창 전날 각 T25 플라스크로 260만 개의 CEF 세포를 시드하였다. 적어도 3개의 양성 클론을 해동하고 각 플라스크에 세포 또는 바이러스의 1개의 유리병을 추가합니다.플라스크를 섭씨 38.5도에서 5%의 이산화탄소로 배양하여 50%의 세포병증 효과가 관찰될 때까지 배양합니다. 다음으로 배양 배지의 2밀리리터에서 세포를 수확한다. 다음 세대를 위해 CEF 세포로 미리 시드된 새로운 T25 플라스크에 50마이크로리터를 감염시다.적어도 15 세대에 대한 재조합 바이러스를 통과 유지. PCR을 사용하여 VP2 시퀀스가 존재하기 위해 각 바이러스 생성을 분석합니다. 간접 면역 불발 성 분석을 사용하여 VP2 발현의 바이러스의 각 세대를 분석합니다.단일 세포 분류 후 정제된 바이러스는 3개의 주요 접합 PCR에 의해 분석되며, 이는 예상되는 크기의 PCR 생성물을 나타낸다. Cre recombinase에 의해 GFP 기자의 절제 후 50% 이상의 플라크그들의 GFP 표현을 분실했습니다. GFP 절제 후 정제 플라크는 단일 셀 정렬에 의해 얻어지고 예상 된 크기의 제품을 보여주는 5 개의 주요 접합 PCR에 의해 추가로 확인된다.단백질 발현은 VP2 특정 단일클론 항체 및 항HVT 닭 혈청을 사용하여 간접 면역 형광 분석에 의해 확인된다. 예상대로, 부모 HVT에 감염된 세포는 안티 HVT 혈청에 의해서만 염색될 수 있습니다. 재조합 HVT 감염된 세포는 VP2 유전자의 발현을 명확하게 보여준다.재조합 바이러스를 생성하기 위해서는 바이러스와 삽입이 동일한 세포에서 만나게 될 가능성을 최대화하기 위해서는 재조합 바이러스가 발생하도록 한다. 이러한 절차에 따라 동물 실험은 재조합 백신의 면역원성 및 효능을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 여기에 설명 된 CRISPR / Cas9 시스템 플랫폼을 사용하여 새로운 다발성 벡터 백신의 개발은 여러 가금류 질병으로부터 보호하기 위해 가금류 산업에 매우 도움이 될 것입니다.

generating-recombinant-avian-herpesvirus-vectors-with-crisprcas9-gene

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

백시 니아 바이러스 (VV)가 널리 생물 의학 연구 및 인간 건강의 개선에 이용되고있다. 이 문서에서는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 VV 게놈을 편집 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

이 원고에서는 마우스 심장에서 유전자 발현을 조작하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 9(rAAV9) 벡터를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

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여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

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두경부암 환자에서 돌연변이된 특정 유전자를 가진 뮤린 모델의 개발은 신생물의 이해를 위해 요구된다. 여기서, 우리는 특정 게놈 변경을 가진 뮤린 HNC 세포주를 생성하기 위하여 아데노 관련 바이러스 Cas9 시스템을 사용하여 1 차적인 뮤린 혀 세포의 시험관 내 형형변환을 위한 프로토콜을 제시한다.

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조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

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