Name: 호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 복막 세척액에서 저밀도 호중구를 분리하여 NETs가 종양 세포를 포착하는 과정을 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 종양 면역학과 전이 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리 기술 및 사무 작업에 대 한 양 제이 시노하라와 I. Nieda 감사합니다. 또한, 우리 감사 박사 시로 마 츠 모토, 則 Haruta, 켄 타로 쿠라 시, 그리고 카즈야 타카하시 수술 실에 샘플 수집에 대 한 그들의 협력에 대 한. 이 작품은 특정 교육 과학기술부, 과학, 스포츠, 그리고 일본 문화 및 일본 사회에서 과학적인 연구를 위한 과학 진흥 (17 K 10606)에 대 한 지원 했다.

LDN는 환자가이 연구에 등록에서 가져온 하 고 기관 검토 위원회의: Jichi 의학 대학에 의해 승인 했다.
1. 복 부 구멍 Lavages 및 NET 검출에서 LDN의 격리
<ol><li>샘플 수집<ol>
<li>위장 암 복 부 수술을 받은 환자에 상처 폐쇄 하기 전에 복 부 구멍에 직접 일반적인 살 균 염 분의 1000 mL를 달 이다. 참고: 샘플은 연령이 나 성별에 따라 바이어스 없이 위절제술, colectomy, 또는 esophagectomy를 수술 하는 환자에서 얻은 했다. 식 염 수는 컨테이너로 전송 되었고 1 분 이내 전체 복 부에 부 어. 이것은 환자에 중요 한 영향 없이 수술 후 복 막 세척으로 정기적으로 수행 됩니다.</li>
		<li>게 1 분 이상 동안 광범위 하 게 복 부 구멍. 참고: 예제는 균일 한 외과 의사의 손에 생긴된 액체 흔들 천천히 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>4 50 mL 주사기와 게의 200 mL를 복구 합니다. 참고: 때로는 고무 커넥터 체액을 데 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Granulocyte 특정 mAb, CD66b16를 사용 하 여 복 막 LDN의 정화를 수행 합니다. 참고: 많은 단 세포 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후 중간 계층에 포함 된 때문에 긍정적인 선택의 변이 호 중구 CD66b mAb를 사용 하 여 수행 되었다.<ol>
<li>50 mL 튜브에 복 막 게 유체를 전송. 참고:이 단계에서 불순물을 제거 하는 100 µ m 나일론 필터를 통해 액체를 전달 합니다.</li>
		<li>실시간에서 7 분 동안 270 x g에서 복 막 액체 원심</li>
		<li>0.02 %EDTA PBS의 5 mL에 산 탄을 resuspend.</li>
		<li>조심 스럽게 3 mL 밀도 그라데이션 솔루션에 세포 현 탁 액의 5 mL을 오버레이.</li>
		<li>휴식 없이 RT에서 15 분 동안 1700 x g에서 원심.</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여 중간 레이어 (그림 1A)를 포함 하는 솔루션의 2 ~ 3 mL를 수확 하 고 0.02 %EDTA PBS의 10 mL와 함께 그것을 혼합.</li>
		<li>RT에 7 분에 대 한 400 x g에서 복 막 액체 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>실시간 삭제는 상쾌한에 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리기와 0.02 %EDTA, PBS의 또 다른 10 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>마그네틱 셀 분리 키트에 대 한 버퍼의 60 µ L에 셀 펠 릿 (1 x 107)를 용 해.</li>
		<li>펠 릿을 Fc 블록의 20 µ L을 추가 하 고 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
		<li>20 µ L 안티-CD66b의 microbeads와 활용 및 4 ° c.에 추가 10 분 동안 품 어 추가</li>
		<li>세척 하 고 다시 맥 버퍼의 500 µ L에서 알 약을 중단.</li>
		<li>적당 한 자석 분리기의 자기장에서 자석 열에 세포 현 탁 액을 적용 하 고 버퍼의 15 mL과 열 세척 하 여 흐름을 통해 포함 된 CD66b(-) 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>마그네틱 구분 기호에서 열을 제거 하 고 즉시 단단히 열에 플런저를 밀어 여 자석으로 레이블이 지정 된 CD66b(+) 세포 밖으로 플러시. 참고: CD66b(+) 세포 인구 구성 되어 주로 호 중구 나타내는 FACS 분석에 의해 결정으로 > CD66(+) 분수의 95%는 CD11b, CD15, 및 CD16, 긍정적인 CD14에 대 한 부정적인.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그물의 세대<ol>
<li>RT에서 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리 후 다시 격리 LDN를 일시 중단 (5 x 106) 10 %FCS RPMI1640의 1 ml에서.</li>
		<li>5% CO237 ˚C에서 2 h 6-잘 폴 리-L-리 신 코팅된 접시 (직경에서 6 cm)에 LDN 문화.</li>
		<li>5 µ M의 최종 농도에서 녹색 형광 counterstain (핵과 염색체 얼룩 막 스며들 지 않는 염료)를 추가 합니다.</li>
		<li>즉시 그물 (extracellular DNA 구성 요소에서 형광 현미경 검사 법에서 LDN 추방)의 형태를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 붉은 형광 셀 링커 염료와 종양 세포의 얼룩
<ol><li>인간의 암 세포 라인 MKN45, NUGC, 및 OCUM-1 준비.</li>
	<li>1 x 107 셀 PBS + 0.02 %EDTA 15 mL와 실시간에 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리기 세척</li>
	<li>펠 릿, 얼룩 염료에 대 한 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 플라스틱.</li>
	<li>얼룩에 대 한 솔루션의 1 mL에 빨간색 형광 셀 링커 염료의 4 µ L를 녹이 고 세포 현 탁 액 단계 2.2에서에서 혼합.</li>
	<li>실시간에서 4 분 동안 쥐 똥을 품 어</li>
	<li>DMEM의 4 개 mL를 추가 (10 %FBS) 착 색 반응을 중지 하.</li>
	<li>270 x g 7 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>2.6-2.7 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 확인 (여기 551 = nm, 방출 = 567 nm) 종양 세포 붉은 얼룩이 있습니다.</li>
</ol>3. 그물에 종양 세포 접착의 분석
<ol><li>다시 0.1 %BSA 보충 RPMI 1640의 1 mL에 빨간색 형광 스테인드 종양 세포 (1 x 106) 일시 중단.</li>
	<li>1.3 단계에서 설명한 대로 그물을 생산 LDN 문화에 종양 세포를 추가 합니다.</li>
	<li>종양 세포는 그물에 연결할 수 있는 37 ˚C에서 5 분 동안 품 어. 참고: 긴 외피 종양 세포 접착 LDN 하거나 번호판을 유도합니다.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 부드럽게 prewarmed 미디어 (0.1 %BSA + RPMI 1640)의 2 개 mL를 추가 하 고 접시를 소용돌이 여 우물을 씻어.</li>
	<li>3.4 단계에서 세척 절차를 두 번 반복 합니다. 참고: 그물부터 약하게 플레이트에 부착, 세척 부드럽게 스스로 그물의 제거를 피하기 위해 가능한 이루어져야 합니다.</li>
	<li>핵 및 그물의 시각화를 위한 5 µ g/mL의 최종 농도에 염색체 얼룩이 지기에 대 한 녹색 형광 염료를 추가 합니다.</li>
	<li>그물을 관찰 하 고 적절 한 필터를 사용 하 여 종양 세포를 첨부 (녹색, 여기 = 504 nm, 방출 523 = nm; 레드, 여기 551 = nm, 방출 = 567 nm).</li>
	<li>종양 세포는 그물에 의해 갇혀 보여 인물을 병합 합니다. 참고: 일부 실험에서 DNA 분해 효소에 추가 되었습니다 LDN 문화 (최종 농도 100 U/ml) 5 분에 대 한 공동 부 화 하기 전에 5 분.</li>
</ol>4. 시간 경과 비디오 분석 갇혀 종양 세포의
<ol><li>문화 35 m m에서 복 LDN 라운드 접시 코팅 폴 리-L-리 신 1.3 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>핵 및 1.3 단계에서 설명한 대로 그물을 시각화 하는 염색체 얼룩이 지기에 대 한 녹색 형광 염료를 추가 합니다.</li>
	<li>외피의 1 분 후 미디어를 제거 하 고 0.1 %BSA + RPMI 1640의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 흠 없는 1 x 106 MKN45 세포 정지 0.1 %BSA + RPMI 1640 추가. 실시간에서 5 분 동안 품 어</li>
	<li>3.4 단계에서 설명한 대로 부드럽게 세척 하 여 모든 첨부 되지 않은 종양 세포를 제거 하 고 10% fcs 100 u/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 보충 DMEM 추가.</li>
	<li>문화 요리 전체 보기 셀 관측 시스템에 탑재 하 고는 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 있다. 적절 한 필드를 선택 합니다.</li>
	<li>계속 추가 대 한 공동 2 일 문화 하 고 정상적인 빛과 형광, MKN45 세포와 그물을 각각 감지에서 6 분 마다 필드의 연속 사진을 찍어.</li>
	<li>각 timepoint에 이미지를 첨가 하 고 시간 경과 비디오 이미지 뷰어 소프트웨어를 사용 하 여 구성.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
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<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이전 연구는 종양 세포를 순환 수 있습니다 갇혀 있을 NET 기판10, vivo에서11보고 있다. 전이성 유방암 세포 자극 하는 호 중구 및 대상 기관17에서 종양 세포 성장에는 그물의 대형을 유도 표시 되었습니다. 또한, 우리는 수술 후 게 액체에서 LDN의 단기 문화 수 효율적으로 더 자극15없이 종양 세포를 모 함 하는 거 대 한 그물을 생산 것을 발견. 이러한 관측 전이성 과정에서 그물의 기계적 참여에 대 한 가능한 역할을 제안합니다. 그러나, 그물과 종양 세포 사이 접착 상호 작용을 중재 하는 상세한 분자 메커니즘 아직 명확 하지 않습니다. 최근 연구는 integrin NET 주식 접착 기판12,13으로 활성화 ...

혈액 순환에 다형 핵 호 중구 밀도 그라데이션 준비 방법을 통해 단 세포에서 일반적으로 분리 된다. 그러나, CD11b(+), CD15(+), CD16(+), 그리고 CD14(-) 고기와 저밀도 neutrophils (LDN)로 알려진 일부 호 중구는 공동 단 세포로 순화. LDN의 상대 수 면역 질환1,2, 암4,5, 패 혈 증3, 등 다양 한 병 적인 조건에서 크게 증가 합니다. 이전 연구는 LDN의 호 중구6phenotypically 및 기능적으로 뚜렷한 클래스 나타났습니다. 그것은 혈액 순환에 LDN 더 정상적인 밀도 호 중구2,7보다 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산할 가능성이 있습니다 주목 해야한다. 그물 핵 산, 히스톤, 프로 테아 제, 그리고 세밀 하 고 cytosolic 단백질의 구성 하는 웹-같은 구조 이며, 그들은 효율적으로 모 함 하 고 병원 균8파괴.
최근, 그물 캡처 뿐만 아니라 미생물, 하지만 또한 혈소판 혈전 형성9 및 종양 전이10,11에 지원할 수 있는 종양 세포를 순환 표시 되었습니다. 그러나, 뒤에 그물과 혈소판 또는 종양 세포 사이 접착 상호 작용 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 더 최근에, 생체 외에서 접착 분석 결과 골수성 백혈병 세포 (K56212) 폐 암 세포 (A54913) 연결 및 그물을 β1와 β3 integrins를 통해 밝혔다. 저자 호 중구에서 고립 그리고 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 접착 기판14에 의해 활성화 인터넷 주식 사용. 이 분석 결과 호 중구의 부재에서 NET 구성 요소와 실제 상호 작용의 탐지를 허용, 그것은 arguable 여부 그물 생산 에서 동일한 분자 구조를 유지는 "셀-무료 인터넷 주식" 고속 원심 분리에 의해 분리 vivo. 최근에, 우리는 복 부 수술 포함 거 대 한 그물을 생성 하 고 복 막 전이15발생 하는 종양 세포에 연결 된 많은 성숙한 LDN 후 그 게 복 막 액체를 발견. 이 연구에서 우리는 성공적으로 어떤 물리적 조작 없이 그대로 그물에 종양 세포의 접착을 시험 했다. 여기, 우리는 그물과 무료 종양 세포 사이 접착 상호 작용을 검출 하는 기법의 세부 정보를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, 스웨덴</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightFrom&trade; Whole Blood CD66b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS 헹굼 솔루션</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>MACS Magnetic Separator</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 일반 세포막 라벨링용 적색 형광 세포 링커 키트</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, 미국</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>희석제 C</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국</td><td>CGLDIL RPMI1640</td><td></td></tr><tr><td>미디엄</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5mol/l-EDTA 용액(pH 8.0)</td><td>nacalai tesque, 일본</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 적격, USDA 승인 지역</td><td>gibco by life technologies, Mexico</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 동결건조 분말, &ge; 96% (아가로스 젤 전기영동)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Life Technologies Japan</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin Prophylactic</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well</td><td>IWAKI, Japan</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well</td><td>IWAKI, Japan</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>fluorescein stereomicroscope</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Japan</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>전경 세포 관찰 시스템</td><td>Nikon, Kanagawa, Japan</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 human gastric cancer cell line</td><td>Riken, Tukuba Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NUGC-4 인간 위암 세포주</td><td>Riken, Tukuba Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 인간 위암 세포주</td><td>일본 오사카 시립 대학</td><td>N/A</td><td>M.Yashiro 박사의 선물</td></tr></tbody></table>

호 중구 extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), 캡처 및 미생물을 파괴할 수 있는 활성화. 최근 연구 제안 그물 자가 면역 질환, 혈전 증, 및 종양 전이 등 다양 한 질병 과정에서 포함 된다. 여기, 우리는 그물을 부착 후 성장 무료 종양 세포의 트래핑 동안 NET 활동을 감지 하 상세한 생체 외에서 기술을 보여줍니다. 첫째, 우리는 laparotomies 수술 환자에서 수술 후 복 막 게 액체에서 낮은 밀도 neutrophils (LDN)를 수집. LDN의 단기 경작 녹색 형광 핵과 염색체 counterstain 가시화 했다 거 대 한 그물 형성 결과. 인간의 위 암 세포 라인 MKN45, OCUM-1 및 NUGC-4 그물의 공동 화, 후 많은 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 있었다. 그 후, 첨부 파일 DNase I. 계시 노출 인 비디오 공개 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 죽지 않 았와 그물의 저하에 의해 완전 하 게 폐지 했다 하지만 대신 적극적으로 지속적인 문화에서 성장 했다. 이러한 메서드는 그물과 다양 한 유형의 세포 및 물자 사이 접착 상호 작용의 탐지에 적용할 수 있습니다.

2 시간 문화에서 CD66b(+) LDN 복 막 게 유체 보였다 문자열 구조에서 파생 된에 대 한 녹색 형광 염료와 스테인드 핵 및 단 셀 하지 않았다 CD66b(-) 동안 염색체 (그림 1B), (그림 1C). 그러나 때 LDN 문화 했다 청소용으로 100 U/mL DNase 나, 특징적인 구조는 파괴 (그림 1D), 그들은 호 중구에서 추방 하는 extracellular DNA의 구성 했다 나타내는. LDN 코팅에 떠 있는 많은 NET 클러스터 없이 플라스틱 접시에 교양 있었다 때 (그림 1E) 하단에 몇 가지 그물을 가진 미디어 관찰 되었다.
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여기, 우리는 인간의 저밀도 호 중구 (LDN), 수술 후 복 막 게 액체에서 회복 대규모 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산 하 고 이후에 성장 하는 무료 종양 세포를 효율적으로 트랩 방법을 제시.

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

이 방법은 종양 면역학에서 호중구 하위 집단의 역할, 특히 종양 전이에서 호중구 세포 외 트랩(NET)의 기계적 관여에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 세포의 접착 상호 작용을 손상되지 않은 NET에 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 암 치료로 확장됩니다.특정 호중영양 하위 집합에서 파생된 NET은 종양 전이를 촉진할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Junko Shoniohara가 맡을 것입니다. 호중구를 얻기 위해서는 먼저 위장관 악성 종양으로 인해 복부 수술을 받은 환자의 복강에 상처 봉합 직전에 일반 멸균 식염수 1리터를 직접 주입하고 최소 1분 동안 복강을 광범위하게 세척합니다.그런 다음 캐비티 내에서 식염수를 저어주고 50ml 주사기 4개로 세척된 유체 200ml를 회수합니다. 실험실에서 원심분리를 위해 100마이크로미터 나일론 필터를 통해 복막 세척액을 개별 50ml 튜브로 옮깁니다. 0.02% EDTA가 보충된 5ml의 PBS에 펠릿을 다시 현탁시키고 각 세포 현탁액을 3ml의 밀도 구배 용액에 조심스럽게 오버레이합니다.밀도 구배 분리 후 각 튜브에서 2-3ml의 중간층을 수확하고 튜브당 10ml의 새 PBS와 EDTA로 복막액 샘플을 세척합니다. 펠릿을 10밀리리터의 신선한 PBS와 EDTA에 섞어 추가로 세척하고 셀을 자기 활성화 세포 분류(MACS) 완충액 농도 60마이크로리터당 10배에서 7번째 세포로 희석합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 20마이크로리터의 Fc 블록으로 비특이적 결합을 차단한 다음 20마이크로리터의 항-CD66b 마그네틱 비드를 추가합니다.섭씨 4도에서 10분 후 500마이크로리터의 MACS 버퍼에서 셀을 세척 및 다시 현탁시키고 적절한 자기 분리기의 자기장 내에서 적절한 크기의 자기 컬럼에 셀을 추가합니다. 모든 CD66b negative cell이 컬럼을 통과하면 15ml의 새로운 MACS 버퍼를 컬럼 저장소에 추가하고 자기 분리기에서 새로운 원뿔형 튜브로 컬럼을 옮깁니다. 그런 다음 즉시 컬럼을 밀어 자기 라벨이 붙은 CD66b 양극을 튜브로 플러시합니다.원심분리 후, FBS 농도가 보충된 배지의 1밀리리터당 6번째 세포에 분리된 저밀도 호중구를 5배 10 RPMI1640 재현탁하고 6개의 웰 폴리-L-라이신 코팅된 플레이트에 웰당 1밀리리터의 호중구를 시드합니다. 섭씨 37도, 이산화

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

이 비디오에서는 수술 후 인간 환자의 복막 세척액에서 저밀도 호중구(LDN)를 분리하는 절차를 설명합니다. 이렇게 얻은 LDN은 종양 성장 및 진행에 대한 LDN의 역할을 이해하기 위한 추가 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

Peritoneal Low-density Neutrophil Isolation: A Technique to Obtain Low-density Neutrophils from Peritoneal Lavage Fluid Using Magnetic Activated Cell Sorting(복막 저밀도 호중구 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 복막 세척액에서 저밀도 호중구를 얻는 기술)

이 비디오는 호중구가 배출하는 세포 외 DNA 구성 요소인 호중구 세포 외 트랩(NET)의 형광 염색을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 암세포와 NET 간의 접착 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

호중구 세포외 트랩 또는 NET의 형광 현미경: 암세포와 NET 간의 접착 상호 작용을 관찰하는 기술

이 비디오에서는 저밀도 호중구와 위암 세포를 공동 배양하여 호중구 세포외 트랩(NET)에 갇힌 암세포의 접착 후 거동을 분석합니다. 타임 랩스 비디오 분석은 다양한 세포 이벤트를 모니터링하고 병리학적 조건에서 NET의 역할을 연구하는 데 도움이 됩니다.

호중구 세포 외 트랩 또는 NET의 타임 랩스 형광 현미경 검사: 암세포와 NET 간의 접착 후 상호 작용을 분석하는 기술

이 비디오는 호중구 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 분리하는 시험관 기술을 보여줍니다. 호중구는 말초 혈액에서 분리되고 phorbol myristate acetate (PMA)로 자극되어 NET을 생성합니다. 배양 과정에서 호중구는 세포 사멸 과정(NETosis)을 거쳐 과립 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질로 구성된 NET을 방출합니다.

인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

이 비디오에서는 형광 현미경을 사용하여 암세포가 호중구 세포외 트랩(NET)에 부착되는 것을 감지하는 분석을 시연합니다. 테스트 웰에서는 NET에 부착된 형광 표지된 암세포의 수가 눈에 띄게 증가한 반면, DNase로 처리된 웰은 NET에 대한 암세포 부착력이 감소한 것으로 나타났습니다.

암세포가 호중구 세포외 트랩에 부착되는 것을 감지하기 위한 In vitro adhesion assay

호중구는 침입하는 미생물에 대한 숙주 방어뿐만 아니라 종양 세포의 면역 감시에도 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 항종양 특성을 가진 호중구의 분리와 관련된 기술과 in vitro 및 in vivo에서 항종양 호중구 기능을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

배우세요 복막 세척액에서 저밀도 호중구를 분리하여 NETs가 종양 세포를 포착하는 과정을 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 종양 면역학과 전이 메커니즘 연구에 활용됩니다.

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

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