호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

이 방법은 종양 면역학에서 호중구 하위 집단의 역할, 특히 종양 전이에서 호중구 세포 외 트랩(NET)의 기계적 관여에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 세포의 접착 상호 작용을 손상되지 않은 NET에 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 암 치료로 확장됩니다.

특정 호중영양 하위 집합에서 파생된 NET은 종양 전이를 촉진할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Junko Shoniohara가 맡을 것입니다. 호중구를 얻기 위해서는 먼저 위장관 악성 종양으로 인해 복부 수술을 받은 환자의 복강에 상처 봉합 직전에 일반 멸균 식염수 1리터를 직접 주입하고 최소 1분 동안 복강을 광범위하게 세척합니다.

그런 다음 캐비티 내에서 식염수를 저어주고 50ml 주사기 4개로 세척된 유체 200ml를 회수합니다. 실험실에서 원심분리를 위해 100마이크로미터 나일론 필터를 통해 복막 세척액을 개별 50ml 튜브로 옮깁니다. 0.02% EDTA가 보충된 5ml의 PBS에 펠릿을 다시 현탁시키고 각 세포 현탁액을 3ml의 밀도 구배 용액에 조심스럽게 오버레이합니다.

밀도 구배 분리 후 각 튜브에서 2-3ml의 중간층을 수확하고 튜브당 10ml의 새 PBS와 EDTA로 복막액 샘플을 세척합니다. 펠릿을 10밀리리터의 신선한 PBS와 EDTA에 섞어 추가로 세척하고 셀을 자기 활성화 세포 분류(MACS) 완충액 농도 60마이크로리터당 10배에서 7번째 세포로 희석합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 20마이크로리터의 Fc 블록으로 비특이적 결합을 차단한 다음 20마이크로리터의 항-CD66b 마그네틱 비드를 추가합니다.

섭씨 4도에서 10분 후 500마이크로리터의 MACS 버퍼에서 셀을 세척 및 다시 현탁시키고 적절한 자기 분리기의 자기장 내에서 적절한 크기의 자기 컬럼에 셀을 추가합니다. 모든 CD66b negative cell이 컬럼을 통과하면 15ml의 새로운 MACS 버퍼를 컬럼 저장소에 추가하고 자기 분리기에서 새로운 원뿔형 튜브로 컬럼을 옮깁니다. 그런 다음 즉시 컬럼을 밀어 자기 라벨이 붙은 CD66b 양극을 튜브로 플러시합니다.

원심분리 후, FBS 농도가 보충된 배지의 1밀리리터당 6번째 세포에 분리된 저밀도 호중구를 5배 10 RPMI1640 재현탁하고 6개의 웰 폴리-L-라이신 코팅된 플레이트에 웰당 1밀리리터의 호중구를 시드합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2시간 후 제조업체의 지침에 따라 각 웰의 세포를 적절한 형광막, 불투과성 핵 및 염색체 염료로 염색하고 즉시 형광 현미경으로 NET의 형태를 관찰합니다. NET에 대한 종양 세포의 접착력을 평가하기 위해 대조 형광 염료로 염색된 위 종양 세포를 0.1% 소 혈청 알부민 농도가 보충된 RPMI1640 10-1밀리리터당 6배로 다시 현탁시키고 저밀도 호중구 배양물의 각 웰에 1밀리리터의 종양 세포를 추가합니다.

섭씨 37도에서 5분 후 각 웰에서 상층액을 제거하고 세척당 BSA가 보충된 2ml의 예열 RPMI1640 배지로 세포를 두 번 부드럽게 세척합니다. 5분의 배양은 NET 특정 바인딩을 감지하기에 충분한 시간입니다. 따뜻해진 배지를 각 웰의 측면에 추가하고 플레이트를 천천히 부드럽게 휘젓고 흡입기로 상층액을 제거합니다.

그런 다음 NET과 부착된 종양 세포를 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 갇힌 종양 세포의 타임 랩스 비디오 분석을 위해 35mm 접시, 폴리-L-라이신 코팅 접시에서 복막 저밀도 호중구를 배양하고 염색한 후 0.1%BSA와 RPMI1640을 2밀리리터로 간단히 세척합니다. 배지를 실온에서 5분 배양을 위해 BSA가 보충된 2밀리리터의 RPMI에 현탁된 염색되지 않은 위 종양 세포의 10배에서 6배로 교체합니다.

배양이 끝나면 BSA가 보충된 2ml의 신선한 RPMI로 세포를 실온에서 5분 동안 헹군 다음 부드럽게 소용돌이쳐 부착되지 않은 종양 세포를 제거합니다. 그런 다음 상층액을 FBS와 항생제가 보충된 DMEM으로 교체하고 접시를 전체 보기 세포 관찰 시스템에 장착하여 NET에 의한 종양 세포 포획의 타임 랩스 분석을 수행합니다. 2시간의 배양 후 복막 세척액에서 유래한 CD66b 양성 저밀도 호중구는 녹색 형광 핵 및 염색체 염색에 의한 끈 구조를 나타내는 반면 CD66b 음성 단핵 세포는 그렇지 않습니다.

그러나 저밀도 호중구 배양물을 1밀리리터당 100단위의 DNAse I으로 전처리하면 형질 구조가 파괴되어 구조가 호중구에서 배출된 세포외 DNA로 구성되어 있음을 나타냅니다. 저밀도 호중구를 코팅되지 않은 플라스틱 플레이트에서 배양할 때, 접시 바닥에 부착된 몇 개의 그물 덩어리와 함께 배지 내에서 많은 그물 클러스터가 떠다니는 것을 관찰할 수 있습니다. 형광 표지된 위 종양 세포주를 5분 동안 배양한 후 많은 종양 세포가 NET 내의 호중구에 부착하는데, 이는 DNAse I으로 전처리 후 관찰되지 않는 현상입니다. 다른 종양 세포에서도 유사한 접착 패턴이 관찰됩니다.

OKUM-1 및 NUGC-4. 흥미롭게도, NET은 확장된 종양 세포 공동 배양 후 몇 시간 이내에 점차적으로 사라지는 반면, NET에 갇힌 종양 세포는 NET 방출 후 활발하게 증식하기 시작합니다. 이 절차를 수행하는 동안 그물이 접시에 약하게 달라붙기 때문에 세척 및 식기 옮기기 과정을 특히 신중한 방식으로 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후 이 기술은 다양한 생물 의학 분야의 연구자들이 혈전증, 전신 염증 반응 증후군 및 자가면역 질환과 같은 다양한 질병과 NET의 인과 관계를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.