기본 소 Granulosa 에스트로겐 생산의 조직 문화 모델 세포

이 세포 배양 모델을 통해 갑상선 요인 또는 상태와 같은 에스트라디올 생산 소 과립층 세포의 체외 특성을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 세포 배양이 직접적인 조직 공급과 독립적으로 작동하도록 하는 동결 보존 기술입니다. 이 절차는 제 연구실의 기술자인 Veronica Schreiter가 시연할 것입니다.

세포 분리 절차를 시작하기 전에 비커에 항생제가 첨가된 1X PBS로 소 난소를 세척하여 표면에서 혈액을 제거합니다. PBS를 버리고 난소에 남아 있는 혈액이 깨끗해질 때까지 3-4회 세척을 반복합니다. 70% 에탄올에 적신 실험실 물티슈를 사용하여 한쪽 난소를 닦습니다.

18게이지 바늘이 달린 3밀리리터 주사기를 사용하여 중소형 난포를 뚫습니다. 그런 다음 과립층 세포를 포함하는 난포액을 흡인합니다. 여포액을 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

여러 개의 모낭에 구멍을 뚫은 후 1X PBS 하나를 사용하여 주사기와 바늘을 헹구고 중간 세척을 통해 바늘이 세포로 막히는 것을 방지합니다. 여포액으로 가능한 한 많은 세포를 얻기 위해 여포에 구멍을 뚫고 흡인하는 것을 반복합니다. RNA, DNA 및 단백질 분석을 위한 참조 샘플로 적절한 수의 새로 분리된 GC를 확보하려면 참조 세포의 여러 부분 표본을 새로운 1.5ml 튜브에 배치합니다.

12, 실온에서 000 번 G에서 1 분 동안 원심 분리기. 상등액을 버리고 액체 질소에 펠릿을 충격을 주지 않고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 냉동 보존을 시작하려면 실온에서 3분 동안 500배 G로 원심분리하여 GC를 부드럽게 펠릿

상층액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 100% 태아 송아지 혈청 또는 FCS에 부드럽게 다시 매달아 눈에 보이는 모든 덩어리를 제거합니다. 그런 다음 미리 제조된 동결 매체 1부피를 추가하고 부드럽게 혼합한 다음 혼합물을 극저온 바이알에 옮깁니다. 냉각 속도가 분당 섭씨 영하 1도를 초과하지 않도록 급속 동결을 방지하는 특수 냉동 용기에 바이알을 넣습니다.

그런 다음 용기를 섭씨 영하 80도에서 최소 4시간 동안 얼립니다. 37도 수조에서 3-4분 동안 극저온 바이알의 세포를 빠르게 해동하고 세포 현탁액을 호르몬 보충제 없이 37도 예열 알파 MEM으로 옮겨 10ml의 최종 부피를 달성합니다. 실온에서 500배 G로 3분 동안 세포를 원심분리합니다.

상층액을 버리고 예열된 보충된 알파 MEM을 세포 펠릿에 첨가하고 조심스럽게 다시 현탁시킵니다. 웰당 500마이크로리터의 최종 부피로 24웰 플레이트에 GC를 시딩하고, 조건당 최소 3개의 웰의 반복을 포함해야 합니다. 마지막으로, 섭씨 37도에서 5% CO2로 8일 동안 세포를 배양한 다음 세포 분석을 진행합니다.

웰당 5번째 세포에서 10의 1배의 정상 밀도에서 GC를 배양한 후, 세포는 GC에 전형적인 표현형과 같은 섬유아세포를 나타냈습니다. 1배에서 10배에서 6배의 높은 도금 밀도에서 배양된 세포는 형태가 변하지 않았지만 더 자주 큰 세포 클러스터를 형성했습니다. 1 x 10에서 5번째의 밀도로 세포를 배양한 후, 평가된 여러 마커 전사체의 유전자 발현은 초기 동결 보존이 있거나 없는 배양된 세포 간에 차이를 나타내지 않았습니다.

GC가 높은 세포 밀도에서 배양되었을 때, 에스트라디올 농도는 현저히 감소한 반면, 프로게스테론 농도는 정상 밀도에서 성장한 세포와 비교했을 때 증가했다. 8일 동안 무혈청 조건에서 배양된 소 GC는 QPCR로 측정한 바와 같이 고밀도 배양과 정상 밀도 배양에서 몇 가지 선택된 마커 유전자의 조절에 상당한 차이를 보여주었습니다. 에스트라디올을 생산하는 소 과립층 세포의 세포 배양 모델을 사용하는 동안 세포 밀도와 같은 세포 생리학에 영향을 미친 요인을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 어떤 분자 또는 신호 경로가 소 과립층 세포 분화에 관여하는지와 같은 질문에 답하기 위해 다른 치료 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 냉동 보존 기술은 보다 구조화되고 조직화된 세포 배양 작업을 위한 길을 열었으며 다른 종으로 쉽게 이전할 수 있었습니다.