Name: 합성 및 Placental 콘의 황산 (plCSA)-지질 타겟팅-고분자 나노 입자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 학습하세요 plCSA-지질-고분자 나노입자 합성법을 통해 약물 전달 시스템을 개선하는 방법을. 이 기술은 인간 종양 및 태반 영양세포에 대한 표적 치료제 전달에 활용됩니다.

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이 작품에는 자연 과학 재단의 광둥 성 (2016A030313178), 국가 자연과학 기초 (81571445 및 81771617)와 중국의 개발 프로그램 (2016YFC1000402), 국가 핵심 연구에서 교부 금에 의해 지원 되었다 X.F. 및 X.F.에 심천 기본 연구 기금 (JCYJ20170413165233512)

1입니다. 재고 솔루션의 준비
<ol><li>초순의 100 mL와 절대 에탄올의 4 mL를 희석 하 여 4% 에탄올 용액을 준비 합니다. 4 ° c.에 솔루션 저장 참고: 초순 박테리아, 입자, 이온, 또는 nucleases 등 오염 물질 없이 물으로 정의 됩니다. 초순 까지의 18.2 ㏁, 낮은 음이온 오염 즉 대상 저항력과 물 정화 시스템에서 얻은 했다.</li>
	<li>20 mg의 콩 레 시 틴 4% 에탄올 용액 20 mL에 용 해 하 여 1 mg/mL 콩 레 시 틴 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에는 콩 레 시 틴 재고 솔루션 저장</li>
	<li>100mg DSPE-말뚝-COOH의 4% 에탄올의 수성 해결책의 4 mL에 용 해 하 여 25 mg/mL DSPE 말뚝 (2000)-COOH 재고 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 재고 솔루션 저장</li>
	<li>초순의 5 mL에 DOX의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 10 mg/mL DOX 재고 솔루션을 준비 합니다. 어둠 속에서 4 ° C에 DOX 재고 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>20mg PLGA의 이기의 10 mL에 용 해 하 여 2 mg/mL PLGA 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에서 PLGA 재고 솔루션 저장 주의: 이기는 가연성 및 독성. 증기 두건에 주의 하며 적절 한 개인 장비, 실험실 코트, 안전 유리, 라텍스 장갑 등을 착용 한다.</li>
	<li>2.17 g MES의 초순 물 100 mL에 용 해 하 여 0.1 m M 2-(morpholino) ethanesulfonic 산 (MES, pH 6.0) 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 재고 솔루션 저장</li>
</ol>2입니다. DNPs의 합성
참고: DOX 광화학 저하를 방지 하려면 모든 작업 어둠 속에서 수행 했다. 나노 입자는 이전에 보고 된 단일 단계 쥡니다 방법11,13,14에 의해 합성 되었다.
<ol><li>살 균 10 mL 원심 관에 4% 에탄올 용액 3 mL를 추가 합니다. 다음, 콩 레 시 틴 재고 솔루션의 90 µ g, DSPE-말뚝-COOH 재고 솔루션의 210 µ g와 DOX 재고 솔루션의 750 µ g의 4% 에탄올 용액 3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>얼음 목욕으로 원심 분리기 튜브를 놓고 초음파 프로세서에 얼음 목욕을 배치 합니다.</li>
	<li>1 mL 주사기 원심 분리기 튜브에 dropwise PLGA 재고 솔루션의 2 mg (1 드롭/4-6 s) 플라스틱. 한편,는 DNPs 합성 20 kHz의 주파수 및 5 분에 대 한 30%의 출력 진폭에 초음파 프로세서를 사용 하 여 튜브 sonicate. 참고: 작은 크기와 균일 한 입자를 합성 하는 PLGA 솔루션은 틈에 다 떨어뜨린 튜브에 속도 느려질 수 필요가 및 거품 발생을 피해 야 한다.</li>
	<li>DNPs 0.1 M MES 버퍼 (pH 6.0)에 위의 솔루션을 세척 하 여 정화 3 번 사용 하 여 원심 분리기 필터 (MWCO, 10 kDa). 4 ° C에서 원심 분리기와 3 분 때마다 1000 × g 마지막으로, 약 1 mL MES 해결 나노 입자의 있어야 합니다. 참고:이 절차에서 허용 중지 지점입니다. 그렇지 않다면 켤레 펩 티 드에 사용 되는 나노 입자 수 정화 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 의해 고 정화 DNPs 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 될 수 있다.</li>
</ol>3입니다. DNPs에 펩 티 드의 활용
<ol><li>
에스테 르 활성화
	<ol>
<li>EDC의 0.4 mg을 추가 (최종 농도 2 m m) DNPs의 1 ml.</li>
		<li>반응에 NHS의 0.24 mg을 추가 (최종 농도 2 m m). 참고: 쉽게 추가 EDC와 보 건국의 정확한 수량, 재고 솔루션 수 있습니다 준비는 시 약은 녹이 고 즉시 사용 하는 경우.</li>
		<li>잘, 반응 구성 요소를 혼합 하 고 통;에 반응 장소 어둠 속에서 실 온에서 반응에 대 일 분-1 시간을 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
아민 반응
	<ol>
<li>증가 버퍼 pH 7.2-7.5를 사용 하 여를 PBS (20 ×, pH 7.4).</li>
		<li>반응 솔루션에는 plCSA을 대상으로 펩 티 드 (plCSA-혈압, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC)의 0.5 mg을 추가. 참고: 또한, 전에 20% 이기에 펩 티 드를 용 해. 펩 티 드를 분해할 수 없는 경우, 목욕 sonicator에 쥡니다 도움이 있습니다.</li>
		<li>혼합 솔루션을 잘, 그리고 통;에 장소 밤새 어둠 속에서에서 4 ° C에서 진행 하는 반응을 수 있습니다.</li>
		<li>투 석 가방 (MWCO, 3500 다) dialyze plCSA DNPs 정화 하 켤레 솔루션 장소 어둠 속에서 24 시간 실 온에서 PBS (pH 7.4) 버퍼를 사용 하 여. 참고: 또는, 정화 수 수행 단계 plCSA DNPs를 2.4에서.</li>
		<li>셀 문화 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 침전 제거 하 0.22 μ m 무 균 주사기 필터를 통해 재구성된 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. plCSA-타겟 지질 특성-고분자 나노 입자
<ol><li>
동적 산란 (DL)을 사용 하 여 유체 나노 크기의 측정
	<ol>
<li>초순 수 (50-fold 희석)와 나노 입자를 희석. DL 또는 제타 잠재적인 악기의 지시에 따라 멧에 500 µ L의 샘플을 로드 합니다. 참고: Zeta 잠재력과 DL 큐 벳 다 수 있습니다 악기의 사양에 따라.</li>
		<li>측정 완료 후 입자 직경, 증가할수록 인덱스 (PDI)와 제타 잠재적인 기록 합니다. 평균 4에서 얻은 결과 판독, 반복 하 고 표준 편차를 계산.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전송 전자 현미경 (TEM) 참고:는 나노 입자의 형태 부정적인 얼룩 방법으로 TEM으로 관찰 되었다. 24<ol>
<li>초순 수 (400-fold 희석)와 나노 입자를 희석. TEM grid에 샘플의 20 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 앉아 있게.</li>
		<li>2% (w/v) phosphotungstic 산의 100 µ L을 추가 하 고 2 분 윅 거리는 물방울 앉아 허용.</li>
		<li>실 온에서 가장 표를 건조.</li>
		<li>80 편 가속 전압 설정 kV, 100000 ×는 나노 입자를 시각화 하는 이미지를 확대.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
캡슐화 효율 (EE)의 결정 및 르
	<ol>
<li>표준 곡선 생성입니다. 5 다른 농도의 DOX 솔루션 준비 하 초순에 DOX 분해: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 및 100 µ g/mL. 480에 DOX 솔루션의 흡수 측정 nm UV 마주 분석기. DOX 농도에 따라 표준 곡선을 생성 합니다.</li>
		<li>초순의 500 µ L와 나노 입자의 25 µ L를 희석. 480에 흡수 측정 nm UV 마주 분석기. 표준 곡선에 의해 약물 농도 계산 합니다.</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여 르 계산: 르 = ((나노 입자에 약물의 양) / (총 재료의 무게)) × 100%.</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여 전자 계산: EE = ((나노 입자에 약물의 양) / (금액 추가 약)) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 사용 하 여 활용 효율의 측정 25 , 26 , 27<ol>
<li>중복에 미 판 우물에 표준 펩타이드 솔루션 (표 1) 또는 plCSA DNPs의 25 µ L 플라스틱. 각 잘 200 µ L 작업 시 약의 추가 하 고 혼합 30 판 통에 잘 접시 s.</li>
		<li>커버 플레이트, 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>562에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에 nm. PlCSA-DNPs의 plCSA 농도 계산 하는 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다.</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여 활용 효율을 계산: 활용 효율 = ((펩 티 드에 나노 입자의 양) / (금액 추가 펩 티 드)) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유리병</td>
			<td>희석제 (μ)의 볼륨</td>
			<td>볼륨 및 펩 티 드 (μ)의 소스</td>
			<td>마지막 펩 티 드 농도 (μ g/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>0</td>
			<td>재고의 300</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>250</td>
			<td>유리병 희석 250</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>250</td>
			<td>유리병 B 희석의 250</td>
			<td>250</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>250</td>
			<td>유리병 C 희석의 250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>300</td>
			<td>유리병 D 희석의 200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>250</td>
			<td>유리병 E 희석의 250</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>400</td>
			<td>유리병 F 희석의 100</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>500</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 표준 펩 티 드의 준비
5. 형광 현미경 검사 법 평가 Choriocarcinoma (JEG3) 세포에 나노 통풍 관 plCSA 대상
<ol><li>씨앗에서 1.0 × 10 살 균 12-잘 접시에 셀4 셀/잘 완전 한 DMEM/F12 (cDMEM/F12, 1% 페니실린/스와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함). 습 한 조건 하에서 37 ° C, 5% CO2 60% 합류에 성장 셀 수 있습니다.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 차가운 신선한 미디어 콘텐츠를 낮은 혈 청 1 mL을 추가 (5 %FBS) 및 DNPs 또는 plCSA-DNPs (DOX 상응의 5 µ g).</li>
	<li>셀과 1 시간에 4 ° C에서 나노 입자의 혼합물을 품 어.</li>
	<li>부 화, 이후 미디어를 제거 하 고 3 회 PBS로 세포 세척. 그런 다음, 신선한 cDMEM/F12의 1 개 mL를 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.</li>
	<li>CDMEM/F12, 제거 하 고 3 회 PBS로 세포 세척.</li>
	<li>찬 4 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 해결 하기 위해 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>PFA는 제거 합니다. 2 mL PBS의 셀을 한 번 세척. DAPI를 포함 하는 PBS의 1 mL를 추가 (1 µ g/mL) 얼룩, 핵에 대 일 분 동안 실내 온도에 품 어 고.</li>
	<li>PBS, 발음 하 고 세 번 PBS 가진 세포를 씻어.</li>
	<li>설치 매체를 추가 하 고 시각화 DOX와 핵, 각각 녹색 및 파랑 채널을 사용 하 여 형광 현미경으로 형광 이미지.</li>
</ol>

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X.F.와 B.Z.는 특허 PCT/CN2017/108646와 201710906587.6 님 민 plCSA 대상 나노 입자 합성 방법 및 응용 프로그램에 발명가. 잠재적인 충돌의 관심은 다른 작가 의해 공개 됐다.

이 프로토콜에는 plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 합성 한 효율적이 고 재현 가능한 방법을 제공 한다. 지질 고분자 나노 입자를 준비 하는 단일 단계 쥡니다 메서드는 재현할 수 빠르고 난방, vortexing, 또는 증발을 포함 하는 일반적인 nanoprecipitation 방법에서 다른. 따라서, 개발된 방법은 크게 합성 시간을 줄일 수 있습니다. 또한,이 프로토콜에 사용 된 EDC/NHS bioconjugate 켤레 펩 티 드 및 나노 입자에 항 체를 일반적으로 사용 하 고 편리한 기술입니다. 따라서, 조합 plCSA을 대상으로 지질-폴리머 합성 EDC/NHS bioconjugate 기술로 단일 단계 쥡니다 메서드의 나노 확장할 수 있습니다 임상 응용 프로그램에 대 한.
특정 절차는 성공적으로 합성 및 plCSA DNPs에 대 한 중요 합니다. 첫째, 레 시 틴, PLGA와 DSPE-말뚝-COOH의 상대 농도 지질 고분자 나노 입자 크기와 증가할수록 결정합니다...

효과적인 암 치료 방법 감소 하 고 최소한의 조직 독성으로 종양을 제거 합니다. 따라서, 선택적 종양을 대상으로 성공적인 치료 방법을 탐구 하는 열쇠입니다. 암 치료를 위한 유망한 기회를 제공 하는 나노 입자 그리고 다른 기능적인 그룹 분자 어셈블리 약물 효능을 강화 하 고 관련된 부작용1,2감소. 또한, 나노 시스템은 주로 수동 및 활성 대상 종양3연결할 대상 사용 합니다.
수동 타겟팅 나노 입자와 향상 된 침투성 및 종양 세포에 도달 하는 보존 (EPR) 효과의 타고 난 특성을 이용 한다. 양이온 리 종양 임상 응용4,,56에 다양 한 항 암 제 약물 전달에 성공적으로 사용 되었습니다. 잠재적인 효과적인 암 치료 효과도 불구 하 고 종양과 정상 조직에서 종양 세포를 구별 하는 무 능력에서 낮은 약물 농도 수동 타겟팅 나노7의 두 가지 주요 제한.
활성 타겟팅 전략 활용 항 원-항 체, 리간드-수용 체와 특히 종양8약물을 전달 하기 위해 다른 분자 인식 상호 작용. glycosaminoglycan placental chondroitin 황산 염 (plCSA)은 대부분 암 세포에 placental trophoblasts 광범위 하 게 표현 된다. 또한, 말라리아 단백질 VAR2CSA 바인딩할 수 있습니다 특히 plCSA9,10. 따라서, VAR2CSA는 인간의 암 세포를 대상으로 하는 도구 수 있습니다. 그러나, VAR2CSA은 나노 입자를 활용 때 전체 단백질 종양 세포에 나노 입자의 침투를 제한할 수 있습니다. 최근에, 우리는 plCSA 바인딩 펩 티 드 (BP plCSA), 말라리아 단백질 VAR2CSA에서에서 파생 된 발견. plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자는 급속 하 게 choriocarcinoma 세포와 크게 증가 독 소 루비 (DOX) 항 암 제 활동 vivo 에서11;에 보 세 이 입자는 또한 특별히 placental trophoblasts에 접착 하 고 태12약물의 타겟된 납품을 위한 도구가 될 수 있을.
지질 고분자 나노 입자는 지질 단층 셸 및 소수 성 고분자 코어의 구성 고 약물 전달에 대 한 새로운 캐리어를 대표 한다. 이러한 나노 리 및 제어할 수 있는 나노 입자 크기, 높은 생체 적합성, 지속적인된 약물 방출, 높은 마약 로드 (르), 효율과 우수한 안정성13등 고분자 nanocarriers의 장점을 결합합니다. 이 작품에서는, 우리는 지질 고분자 나노 입자를 합성 하 단일 단계 쥡니다 메서드를 사용. 이 방법은 빠르고, 편리 하 고 확장에 적합 및 널리 이용 되는 지질 고분자 나노 입자를 준비 우리의 그룹11,14 다른 사람에 의해15,,1617,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC) 아민 및 carboxylates19를 포함 하는 생체 변화에 대 한 교차 결합 시키는 대리인으로 사용 하는 인기 있는 carbodiimide 이다. EDC, 뿐만 아니라 N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)은 표면 및 나노 활용 반응20,21에서 가장 일반적인 활용 시 약 이다. 보 건국 측 반응의 수를 줄일 수 및 안정성을 향상 하 고 에스터의 수율 중개자22,23.
여기, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, DOX 로드 지질 고분자 나노 입자 (DNPs)의 단일 단계 쥡니다 합성 설명 되어 있습니다. 그런 다음, plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 생성 하기 위한 EDC/NHS bioconjugate 기술 도입. 이 bioconjugate 기술은 또한 다른 항 체와 펩 티 드 나노 입자를 켤레를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자의 특성을 사용 하는 물리 화학적 속성 및 생체 외에서 분석 결과 설명 합니다. 우리는 이러한 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자 가장 인간의 암과 태 반 장애 치료에 태 반에 페이로드의 대상된 배달 하는 약물의 타겟된 배달에 대 한 효과적인 시스템을 구성 수 있습니다 믿습니다.

<table><tbody><tr><td>plCSA 펩타이드</td><td>상하이 GL Biochem</td><td>펩타이드 합성을위한</td><td>573518</td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>Sinopharm 나</td><td>노 입자 합성을위한</td>화학 <td>10009218</td></tr><tr><td>대두 레시틴</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>나노 입자 합성을위한</td><td>441601</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>나</td><td>노 입자 합성</td></tr><tr><td>을위한 880125독소루비신</td> JK<td>나노 입자 합성을 위한</td><td>체미컬</td><td>113424</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>상하이 링펑</td><td>나</td><td>노 입자 합성을 위한</td></tr><tr><td>1008621 PLGA</td><td>시그마-알드리치</td><td>719897</td><td>나노 입자 합성을 위한</td></tr><tr><td>초음파 프로세서</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>나노 입자 합성을 위한</td></tr><tr><td>원심분리기 필터 (MWCO 10 kDa)</td><td>밀리포어</td><td></td><td>나노 입자 정제</td></tr><tr><td>원심분리기</td> UFC801024 나<td>노 입자 정제</td>용 <td>시그마</td><td>3-18KS</td> 2</tr><tr><td>-[모르폴리노]에탄술폰산(MES)펩</td><td>타이드 접합용</td> <td>시그마-알드리치</td><td>M3671</td></tr><tr><td>1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC)</td><td>펩타이드 접합용</td> <td>시그마-알드리치</td><td>3450</td></tr><tr><td>N-하이드록시숙신이미드(NHS)</td><td>펩타이드 접합용</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td></tr><tr><td>투석 백</td><td>나노 입자 정제용</td><td>Spectrum</td><td>132592T</td></tr>, <tr><td>세포 배양용</td><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td></tr>, <tr><td>10mL 원심분리 튜브, 폴리프로필렌</td>, <td>나노 입자 합성용</td><td>Aladdin</td><td>S-025</td></tr>, <tr><td>15mL 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌</td>, <td>Corning</td><td>430791</td><td>다양한 응용 분야용</td></tr><tr><td>0.22 &무; m 멸균 주사기 필터</td><td>나노 입자 정제 용</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td></tr><tr><td>1ml 주사기, 폴리 프로필렌</td><td>BD</td><td>328421</td><td>나노 입자 합성용</td></tr><tr><td>Malvern Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Nano ZS</td><td>입자 크기 분석기</td></tr><tr>용<td>포스 포 텅스텐 산</td><td></td><td></td><td>TEM</td></tr><tr><td>그리드</td><td>EMCN</td><td>BZ10024a</td><td>TEM</td></tr><tr><td>TEM용 UV-VIS 분광계</td><td>Leagene</td><td>DZ0035</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>JEOL</td><td>JEM-100CXII</td><td>입자 크기 분석기</td></tr><tr><td>BCA 시약 A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23228</td><td>BCA 분석용</td></tr><tr><td>BCA 시약 B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23224</td><td>BCA 분석용</td></tr><tr><td>96-Well Plate</td><td>Corning</td><td>3599</td><td> 어세이</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan &trade; </td> 세포 배양을 <td>위한 BCA 분석</td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td>를 위한 GO 세포 <td>배양을 위한</td><td>Corning</td><td>3513</td></tr><tr><td>JEG3 세포</td><td>TCHu195</td><td>인간 태반</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyclone</td><td>SH30272.01</td><td>페놀 레드-프리</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10100</td><td>세포 배양을 위한</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>GIBCO</td><td>세포 배양을 위한</td> <td>15070063</td></tr><tr><td>세포 흡수</td>를 위한<td>형광 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>CKK53</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>상하이 링펑</td><td>1372021</td><td>세포 흡수를 위한</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606584</td><td>세포 흡수를 위한</td></tr><tr><td>장착 매체 생명</td><td></td><td>P36961</td><td>셀룰라 흡수를 위한</td></tr></tbody></table>

합성 및 placental 콘의 황산 (plcsa)-지질 타겟팅-고분자 나노 입자

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

효과적인 암 치료 방법 감소 하 고 최소한의 조직 독성으로 종양을 제거 합니다. 적극적으로 대상 나노 암 치료 하는 유망한 접근 방식을 제공합니다. glycosaminoglycan placental chondroitin 황산 염 (plCSA)에 다양 한 암 세포와 태 반 trophoblasts 및 말라리아 단백질 VAR2CSA plCSA 바인딩할 수 있는 구체적으로 표현 된다. 암 세포와 태 반 trophoblasts plCSA 보고 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (BP plCSA), 말라리아 단백질 VAR2CSA에서 파생 또한 구체적으로 바인딩할 수 있습니다. 따라서, plCSA BP 활용 된 나노 입자는 인간의 암 및 placental trophoblasts 대상된 약물 전달에 대 한 도구로 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 독 소 루비 (plCSA-DNPs); 로드 plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 방법 단일 쥡니다 단계 및 bioconjugate 기술 방법에 의하여 이루어져 있다. 또한, plCSA-DNPs, 그들의 물리 화학적 특성 및 태 반 choriocarcinoma (JEG3) 셀에 의해 세포질 통풍 관을 결정 하는 포함 한 특성화를 위한 여러 가지 방법은 설명 합니다.

이 프로토콜에서 PLGA, DSPE-말뚝-COOH와 콩 레 시 틴은 대표적인 폴리머, 지질-말뚝-COOH 공액 및 지질, 각각. EDC/NHS 기술과 쥡니다 메서드 를 통해 단일 단계 plCSA 대상 지질-폴리머 나노 입자의 합성은 그림 1에 나와 있습니다. 첫째, 조건 하에서 쥡니다, 콩 레 시 틴, PLGA와 DSPE-말뚝-COOH 자기 조립 형태의 코어-쉘 구조 DNPs. 핵심 PLGA와 캡슐화 된 DOX 이루어져, 셸 구성 DSPE-말뚝-COOH, 그리고 껍질과 코어의 인터페이스에는 콩 레 시 틴 단층. 다음,-COOH 그룹 DNP 표면에 노출 되는 펩 티 드 를 통해 EDC/NHS 기술을 합성 plCSA DNPs의-NH2 그룹으로 활용 했다.
이 프로...

여기, 선물이 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP)의 합성에 대 한 프로토콜-지질 고분자 나노 입자를 통해 단일 단계 쥡니다 bioconjugate 기법을 활용. 이 입자는 가장 인간의 종양 및 암 및 태 반 장애 치료에 태 반 trophoblasts 치료제의 대상된 배달에 대 한 새로운 도구를 구성 합니다.

합성 및 Placental 콘의 황산 (plCSA)-지질 타겟팅-고분자 나노 입자

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

이 방법은 인간 암과 태반 낭포블라스트에 대한 치료 대상 전달과 같은 약물 전달 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 입자에 컨쥬게이트된 펩타이드를 합성하는 간단하고 재현 가능한 방법이라는 것입니다. 시작하려면 멸균 10 밀리리터 원심분리기 튜브에 4%의 에탄올3밀리미터를 추가합니다.그런 다음 대두 레시틴 스톡 솔루션 90마이크로그램, DSPE-PEG-carboxylic acid 스톡 솔루션 210마이크로그램, DOX 재고 용액 750마이크로그램을 추가합니다. PLGA 스톡 솔루션 2밀리그램을 피펫에 1밀리리터 주사기를 사용하십시오. 원심분리기 튜브를 얼음 욕조에 놓고 초음파 프로세서에 놓고 2분 동안 초음파 처리합니다.그런 다음 PLGA 스톡 솔루션을 원심분리기 튜브에 드롭 와이즈로 추가합니다. DNP를 정화하려면 원심분리기 필터를 사용하여 0.1 어금니 MES 버퍼로 용액을 세척합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 3분 동안 1000G의 원심분리합니다.에스테르 활성화를 시작하려면 0.4 밀리그램의 EDC를 DNP 1밀리리터에 추가하십시오. 그런 다음 반응에 NHS의 0.24 밀리그램을 추가합니다. 그런 다음, 어두운 실온에서 최대 1 시간 동안 반응이 발생하도록 허용하십시오.그 후 반응 성분을 철저히 섞어 셰이커에 반응합니다. 아민 반응을 시작하려면 PBS를 사용하여 완충pH를 7.2에서 7.5로 늘립니다. 그런 다음, 반응 용액에 펩티드를 대상으로 하는 pICSA의 0.5 밀리그램을 추가한다.솔루션을 잘 섞고 셰이커에 놓습니다. 그런 다음, 어둠 속에서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 반응을 진행할 수 있습니다. 다음 날, 컨쥬게이트 용액으로 투석 가방을 채웁니다.어두운 상황에서 24시간 동안 실온에서 PBS 버퍼로 pICSA DNP를 정화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 배양한 후 미디어를 제거하고 5%의 FBS 및 pICSA DNP 또는 DNP로 신선하고 차가운 미디어의 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 세포와 나노 입자 혼합물을 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.그 후, 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 세 번 세척한다. 그런 다음 신선한 매체의 1 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 그 후, 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 세 번 세척한다.그런 다음 2 밀리리터의 차가운 PFA를 추가하고 실온에서 10 분 동안 혼합물을 배양합니다. PFA를 제거하고 PBS의 두 밀리리터로 세포를 세척. 그런 다음 핵 염색을 위해 DAPI를 통해 PBS 의 1 밀리리터를 추가합니다.혼합물이 실온에서 10 분 동안 배양하도록 허용하십시오. 마지막으로, 형광 현미경으로 형광을 장착 배지와 이미지를 추가합니다. 이 프로토콜을 사용하여 DNP는 성공적으로 pICSA BP에 준비되고 공주되었습니다. 컨쥬게이션 후, 1차 DNPs의 직경은 약 109나노미터로 증가했습니다.DNP및 pICSA DNP의 TEM 이미지는 입자가 잘 분산되고 일반적으로 구형 형태를 입증했다는 것을 보여주었습니다. 나노 입자의 제타 전위는 음수 20.1 및 29.9 밀리볼트였으며, 이는 나노 입자가 매우 안정적이었다는 것을 나타낸다. JEG3 세포 조리 분석은 30분 이내에 JEG3 세포에 결합된 pICSA DNP를 나타냈다.따라서, pICSA BP는 표면으로 효율적으로 공주되었다. 이 절차를 시도하는 동안 PLGA를 추가하기 전에 혼합물을 1 ~ 2 분 동안 초음파 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 HPLC 분석과 같은 방법은 컨쥬게이션 효율을 보다 정확하게 결정하기 위해 수행 될 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 생식 생물학 분야의 연구원들이 임신 합병증에서 태반 표적 치료의 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa

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연구

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합성 및 Placental 콘의 황산 (plCSA)-지질 타겟팅-고분자 나노 입자

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