Name: 선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 배우세요 유동 조건에서 면역 세포의 동적 접착을 분석하는 방법을 통해 장 질환 연구에 활용하세요. 이 기술은 항-인테그린 항체와 화학유인체의 효과를 평가하여 염증성 장 질환 치료 전략 개발에 기여합니다.

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CN, 아이오와, MFN, SZ의 연구 지원 협 센터 임상 연구 (IZKF)와 대학 에를랑겐 뉘른베르크, 독일 크 론 다른 Kröner-Fresenius-재단, 프리츠-벤더-재단의 앨런 프로그램 및 Colitis 재단 (DCCV), 임상 연구 그룹 CEDER의 독일 연구 위원회 (DFG), Microbiota, 신흥 분야 이니셔티브는 DFG 공동 연구 센터 643, 796와 1181에 DFG 주제 프로그램.

다음 섹션에서 설명 하는 연구 윤리 위원회 프리드리히 알렉산더 대학교 에를랑겐 뉘른베르크의의 승인에 따라 수행 되었습니다.
1입니다. 모세 혈관의 준비
<ol><li>작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 하 고 신중 하 게 (약 0.5 c m) 모 세관 튜브에 삽입 하 여 사각형 모세 혈관 고무 튜브를 연결 합니다. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인.</li>
	<li>Addressin (재조합 Fc 키메라, addressin, 예를 들면 MAdCAM-1 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES) 코팅 버퍼에서 5 µ g/mL) 또는 p20 피 펫을 사용 하 여 적절 한 isotype 제어 솔루션의 20 µ L와 모 세관 코트 (유체 적 실 것 이다 자체는 모 세관으로). 다음, 플라스틱 파라핀 영화 튜브에 연결 되지 않은 측면을 밀봉 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어 코팅 버퍼 또는 부정적인 제어로 적절 한 isotype 제어만 채워진 모 세관을 사용 합니다.</li>
	<li>모 세관의 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거, 코팅의 차단 솔루션 (5 %BSA 1 x PBS) 37 ° c.에 20 µ L로 적어도 1 시간에 대 한 종이 타월 및 블록 모세 혈관에 모 세관에서 액체 담가 놓아 빈 플라스틱 파라핀 영화와 모 세관의 열린 측면을 봉인. 현미경을 진행 하기 전에 차단 솔루션을 제거 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 세포 격리, 치료 및 현미경 검사 법에 대 한 준비
참고:이 단계 수행할 수 있습니다는 인큐베이션 기간 동안 모 세관 준비에 필요한 기간.
<ol><li>지역 규정에 따라 정보 서 면된 동의 후 무 균 혈액 컬렉션 (예: IBD 환자 및 건강 한 컨트롤) 명 자원 봉사 cubital 정 맥에서 설정 anticoagulated 사람의 혈액의 18 mL를 수집 윤리 위원회입니다. 참고:이 단계만 국가 및 지역 규정에 따라 훈련 하 고 경험이 풍부한 의료진에 의해 수행 되어야 한다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 피를 1 x PBS와 35 mL의 볼륨을 희석. 다음 언더레이 밀도 그라데이션 매체의 10 mL와 함께 혈액 PBS 혼합물까지.</li>
	<li>800 x g 15 분 및 세포를 분리 하는 브레이크 없이 24 ° C에 대 한 밀도 그라데이션 원심 분리를 수행 합니다.</li>
	<li>화이트 셀 레이어 오른쪽 상단에 밀도 그라데이션 중간 레이어 (분명 중간 계층)의 발음에 의해 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs)를 수집 합니다. 신선한 50 mL 튜브에 PBMCs 전송, 채우기 최대 50 mL 1 x PBS 그리고 g 와 10 ° C x 300에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>삭제는 상쾌한, 1 x PBS의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend 및 이후 셀 숫자, 예를 들어, Neubauer 셀 계산 챔버를 사용 하 여.</li>
	<li>선택 사항: 공부 granulocytes의 접착은 다음 절차를 수행 합니다. 그렇지 않으면, 단계 2.7 또는 2.8 진행.
	<ol>
<li>Granulocyte 레이어 (맨 아래 레이어 밀도 그라데이션 원심 분리는 적혈구 또한 포함 된 후)를 수집 합니다. 1 x PBS의 40 mL에 셀 resuspend 8 mL 6%의 추가 1 x PBS에서 Dextran 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 셀 앙금. 참고:는 적혈구 됩니다 싱크대는 튜브의 하단에는 granulocytes에에서 남아 있을 것입니다 하는 동안.</li>
		<li>30 분 후에 상쾌한 수집, 전송 신선한 50 mL 튜브 및 원심 분리기 g 와 4 ° C x 300에서 6 분으로 삭제는 상쾌한 고 0.2%의 5 mL을 추가 하 여 나머지 적혈구를 lyse NaCl ddH2오 품 1 분 동안에.</li>
		<li>1.4%의 5 mL을 추가 ddH2O NaCl 및 다른 분 품 어. 1 x PBS와 300 x g 6 분 및 4 ° c.에 대 한 원심 분리기의 20 mL를 추가 하 여 침투성 세포를 중지</li>
		<li>1 x PBS의 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 다음, Neubauer 셀 계산 챔버를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>옵션: 공부 하 고 PBMC 하위 집합의 접착, 정화 다른 세포 유형 또는 하위 집합 (예를 들어, CD4+ 와 CD8+ T 세포 또는 CD19+ B 세포) 제조 업체의 프로토콜 또는 형광 활성화 하 여 microbeads를 사용 하 여 셀 정렬 (FACS). 그렇지 않으면, 단계 2.8 진행.</li>
	<li>G 와 10 ° C x 300에서 10 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 삭제는 상쾌한 고 셀 제조업체의 지침에 따라 (예를 들어, CFSE) 염료를 추적 셀 얼룩.</li>
	<li>그 후, 셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고 상쾌한 삭제. 1 x PBS에 resuspend, 휴대폰 번호와 다시 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를 결정 합니다.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 접착 버퍼 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 m m MgCl2 + 1 m m CaCl2)의 적절 한 금액에 얼룩진된 셀 펠 릿 106 셀/mL x 1.5의 정지를 resuspend. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl2 의 적절 한 금액을 추가 합니다. 참고:이 세포는 현미경 검사 법에 대 한 준비.</li>
	<li>선택 사항: cytokines, 중화 항 체 또는 다른 화합물을 세포 치료. 그렇지 않으면 3 단계로 진행 합니다.
	<ol>
<li>2.10 단계를 생략 하 고 resuspend 단계 2.9 RPMI 매체에서에서 스테인드 셀 펠 릿 (10 %FBS 1% 페니실린/스) 1.5 x 106 셀/mL의 농도를.</li>
		<li>분석 조건으로 48-잘 접시의 많은 우물으로이 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 플라스틱. 항상 부정적인 컨트롤로 uncoated 모 세관을 통해 끼얹는다 치료 셀 하나 잘와 긍정적인 컨트롤로 addressin 코팅 모 세관을 통해 끼얹는다 치료 셀 하나 잘 준비 합니다.</li>
		<li>안티 integrin 항 체와 치료를 위해 세포 현 탁 액에 항 체 (예, 10 µ g/mL vedolizumab)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 1 h 37 ° c.에 품 어 Cytokines와 치료를 위해 세포 현 탁 액을 재조합 사이토카인 (예를 들어, 10 ng/mL CXCL10)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</li>
		<li>부 화, 이후 resuspending 여러 번 p1000 피 펫을 사용 하 여 셀에 의해 세포를 수확. 2 mL 튜브에 세포를 전송, 1 x PBS의 1 mL와 함께 다시 잘 헹 구 고 2 mL 튜브에 추가. 휴대폰 번호를 확인 합니다. 참고: 부착 세포 인구 (예를 들어, monocytes)의 외피 추가 조치가 필요할 수 있습니다 (예., 트립 신으로 처리) 접시에서 세포를 분리.</li>
	</ol></li>
	<li>10 ° c.에 300 x g 에서 10 분 원심 분리기 셀 삭제는 상쾌한 고 1.5 x 106 셀/mL의 정지를 접착 버퍼의 적절 한 금액에 셀 펠 릿 resuspend. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl2 의 적절 한 금액을 추가 합니다. 발산을 pretreating 때 셀 서 스 펜 션에 MnCl2 을 추가 하지 마십시오. 이 세포는 현미경 검사 법에 대 한 준비가 지금. 참고: 최소 볼륨 분석 결과 대 한 사용 하는 펌프와 튜브 사용에 따라 달라 집니다. 연동 펌프와 재료의 테이블에에서 지정 된 튜브를 사용 하 여이 연구에서 400 µ L의 최소 볼륨 필요 했다. 경우 원하는 (셀 유형 및 수익률)에 따라 적용 가능한, 시간의 짧은 기간에 높은 접착 력을 측정 하 현 탁 액에서 세포 농도 늘릴 수 있습니다.</li>
	<li>잠재적인 수정: 경쟁 동적 접착 시험
	<ol>
<li>서로 다른 (예를 들어, 규제 및 효과 기 T 세포 단계 2.7 당 제조업체의 지침에 따라 자석 구슬 격리를 통해 격리) 비교 하기 다른 세포 인구와 위에서 언급 한 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>단계 동안 현미경 세포 인구를 차별화 수 2.8-2.9에서에서 설명한 대로 다른 염료 (예를 들어, CFSE와 FarRed)와 각 인구를 얼룩.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 접착 버퍼 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 m m MgCl2 + 1 m m CaCl2)의 적절 한 금액에 얼룩진된 셀 알 약 1.5 x 106 셀/mL의 정지를 resuspend.</li>
		<li>동등한 양의 세포 정지 (규정 하는 T 세포의예를 들어, 500 µ L) 및 효과 기 T 세포의 500 µ L를 혼합 혼합 셀 1.5 x 106 셀/mL의 농도를 최종. 그런 다음, 100 m m 1 m m의 최종 농도를 MnCl2 의 적절 한 금액을 추가 합니다. 그러한 정지 이후 동일한 모 세관을 통해 다른 세포 인구 perfusing에 의해 접착 과정의 경쟁력 분석을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 라이브 셀 이미징 동적 접착의
<ol><li>현미경 하 고 적절 한 필터 선택 또는 자극 dye(s) (예: 488 nm 레이저 CFSE), 적절 한 목표 (예를 들어, 40 X)는 인수 모드 활성화 시간 경과 영상 추적 셀 레이저.</li>
	<li>모 세관의 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거 하 고 모 세관 작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 조심 스럽게 모 세관 (약 0.5 c m)을 삽입 하 여 (약 5cm 길이의) 배관의 짧은 조각으로 연결 에 관. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인.</li>
	<li>고정 트레이 (예를 들어, 는 사각형 컷-아웃으로 모 세관의 길이 보다 약간 짧은 6 잘 플레이트에서 뚜껑)에 모 세관을 탑재 하 고 초점 및 준비에는 모 세관에는 현미경의 트레이 홀더 고정된 모 세관을 배치 입니다.</li>
	<li>고무 튜브 연동 펌프의 해당 노치에 삽입 하 고 배치에 따라 샘플 튜브 세포 현 탁 액을 포함 하는 모 세관에 연결 되지 않은 끝. 흐름을 통해 수집 하는 15 mL 튜브에 모 세관의 반대편에 짧은 튜브를 삽입 합니다.</li>
	<li>튜빙 채우기 하자 셀 서 스 펜 션은 거의 모 세관에 도달할 때까지 분당 500 µ L의 유량과. 100 µ L/min의 유량과 모 세관 채우기를 시키십시오. 참고: 모 세관 내부 세포 현 탁 액의 일반 분배를 보장 한 빠른 오르고 모 세관의.</li>
	<li>모 세관 세포 현 탁 액으로 채워질 때 10 µ L/분의 유량을 조정 합니다. 참고: 이러한 흐름 속도 달라질 수 있습니다, 다른 크기 또는 다른 연동 펌프의 모 세관을 사용 하는 경우. 이 연구에서 10 µ L/분의 유량은 펌프와 모세 혈관 혈 vivo에서 모방 하 최적화 되었다.</li>
	<li>모든 2는 addressin 코팅 벽 안쪽을 따라 모 세관을 통해 천천히 이동 하는 셀의 시간 경과 이미지 3 분의 총에 대 한 s. 참고: 간격 및 총 시간 세포 유형 및 질문 해결에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>모 세관을 삭제 하기 전에 화면을 전체 모 세관 비디오에 표시 된 섹션 담당자는 되도록 현미경의 눈 조각을 통해. 필요한 경우 두 번째 녹음을 확인 합니다.</li>
	<li>펌프에서 튜브 무료 고 나머지 액 2 mL 관으로 다시 실행 다음 고정 용지함에서 모 세관와 튜브를 분리 하 고 모 세관을 계속 하자.</li>
</ol>4. 평가 셀 계산
<ol><li>적절 한 소프트웨어와 함께 시간 경과 시퀀스를 열고 처음 세 개의 이미지 ("시작")와 마지막 3 이미지 ("끝") Tiff 파일로 내보냅니다.</li>
	<li>32 비트 오픈 ImageJ, 3 "시작" 이미지 변환 ('이미지 | 유형 | 32 비트 ') 및 사진을 병합 (' 이미지 | 컬러 | 병합 채널; 빨강, 녹색 및 파랑 색상을 할당할 다른 그림). 합성 이미지를 RGB로 변환 (' 이미지 | Type-RGB') 및 Tiff 파일로 저장. "끝" 이미지를 반복 합니다. 참고: 셀에 서로 다른 색상으로 얼룩진 경쟁 동적 접착 분석 실험, 먼저 다른 세포 인구의 접착을 별도로 분석 하 이미지의 채널 분할.</li>
	<li>"시작" 및 "끝" 복합에 화이트 셀의 개수와 화이트 셀 "끝"에서 "시작"에 백혈구의 수를 뺍니다. 참고: 새로 준수의 수는 3 분 시간 간격에서 세포는 차이 나타냅니다. 합성 이미지에서 셀 이동 때문에 그들은 이전 및 다음 프레임에서 다른 자리에 지역화 각각 프레임에 할당 된 특정 색상에 표시 됩니다. 셀에 대 한 부착, 흰색 같은 자리 오버랩에 빨강, 녹색 및 파랑 신호입니다.</li>
	<li>더 나은 결과 시각화 하려면 시간 경과 시퀀스에서 비디오를 예를 들어, ImageJ를 사용 하 여 컴파일하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

M.F.N.는 펜탁스, 줄리아니, MSD, Abbvie, 얀 센, 다케다와 Boehringer 고문 역임 했다. M.F.N. 및 S.Z. 다케다와 로슈 연구 지원을 받았다.

위의 프로토콜 인간의 면역 세포를 내 피 ligands의 동적 접착을 공부 하는 유용한 기법을 설명 합니다. 통해 코팅된 ligands, 끼얹는다 세포 유형 또는 하위 집합, 추가 자극이 나 다른 중화 항 체를 가진 외피의 변화, 그것은 거의 무제한 잠재적인 응용 프로그램. 따라서, 이러한 동적 접착 분석 변환 쿼리를 개발 하 고 접착 과정을 방해 하는 약물으로 임상 치료를 최적화 하는 데 도움이 될 뿐 아니라 기초 연구의 두 기본적인 질문에 대답을 유용할 수 있습니다.
임상 방지 접착 치료의 효과 조사 분석 결과의 유틸리티 최근 증명 되었습니다. 또한, 다른 세포 인구 종류와 양의 integrins23분석 결과 타당성을 지 원하는 각 addressins에 동적 접착의 일관 된 수준을 표시 합니다.
온, 프로토콜의 완성 작품의 약 6 시간을 필요로 하 고 중간 기술 도전을 선물 한다. 모...

셀 모션 단단히 규제 프로세스 개발 및 멀티 셀룰러 생물의 기능에 대 한 필수 이지만, 또한 다양 한 질병1의 병 인에 관련 된. 최근, 주변 조직에 혈 류에서 면역 세포의 유도 과정 주목 하고있다 증가, 때문에 그것은 보충 및 면역학 중재 질병2에에서 염증된 조직에 병원 성 세포의 확장에 기여 ,3. 특히, 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)에 변환 관련성을가지고 표시 되었습니다. 창 추적 방해 치료 안티-α4β7 integrin 항 체 vedolizumab 큰 임상 시험4,5 에 효능을 보이고 있다 고 실제 임상 실습6,7 에 성공적으로 사용 되었습니다. , 8. 추가 화합물9,10에 따라 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 치료 안티-α4 integrin 항 체, natalizumab, 다 발성 경화 증 (MS)11의 치료를 위해 사용 됩니다.
그러나, 우리의 기능 유도 과정의 일반적 이해와 같은 치료 항 체의 행동의 메커니즘에 특히 아직도 제한 된다. 잘 설립 추적 셀 밧줄 등 압 트랜스 내 피 마이그레이션12,13다음 회사 마비로 이어지는 후속 세포 접착와 여러 단계의 구성 됩니다. 위에서 언급 한 항 체에 혈관 벽의 endothelium에 addressins와의 상호 작용을 방지 하는 세포 표면 integrins 무력화. 이 회사 세포 접착14,15방해 하 생각 된다. 그러나, 우리는 고유 셀 하위 집합의 셀 추적에 대 한 특정 integrins의 차동 관련성 이해만 시작 합니다. 또한, 다른에 안티 integrin 항 체의 효과 셀 하위 집합 그리고 복용량 응답 협회는 크게 알려진 많은 IBD에 직감 추적 및 방지 접착 치료의 분야에서 관련 질문을 선도.
따라서, 이러한 질문을 해결 하기 위해 편리한 도구 필사적으로 필요 합니다. Integrin addressin 상호 작용에 안티 integrin 항 체의 효과 주로 바인딩 효능/바인딩 금지 cytometry 또는 정적 접착 분석 실험16,17 를 평가 하 여 평가 18,,1920, 명백한 단순화와 생리 적 상황에서 편차에 따라서. 우리는 최근에 integrin 종속 접착 addressins 인간 세포의 전단 응력2안티 integrin 항 체의 효과 공부 하 고 동적 접착 분석 결과 설립. 기술의 원리 이전 마우스 셀21,22로 입증 되었습니다. 여기, 그것은 적응 되 고 위에서 언급 한 변환 질문을 해결 하기 위해 개발 되었다, 오프닝 소설 길 더 나은 치료와 안티 integrin 항 체에서 생체 내에서의 메커니즘을 이해.

<table><tbody><tr><td>48웰 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>833,923</td><td></td></tr><tr><td>접착 완충액: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차단 용액: ddH2O + 5 % BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td>에서 1x PBS <td>Applichem</td><td>A1391,0100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm</td><td>길이 CM Scientific</td><td>3520-050</td><td></td></tr><tr><td>CCL-2, human</td><td>Immunotools</td><td>11343384</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; CFSE 세포 증식 키트</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 (Rotixa 50 RS)</td><td>Hettrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>코팅 완충액: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 (TCS SP8)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CXCL-10, 인간</td><td>면역도구</td><td>11343884</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 500</td><td>Roth</td><td>9219.3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA KE/9 mL 모노벳</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcons (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td></td></tr><tr><td>Fc 키메라 이소타입 컨트롤</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG</td><td></td></tr><tr><td>유량 연동 펌프(LabV1)</td><td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848-100ML</td><td></td></tr><tr><td>인간 IgG 이소타입 제어</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31154</td><td></td></tr><tr><td>세포간 접착 분자 1(ICAM-1) Fc 키메라</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>LS-Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG isotype control</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-545</td><td></td></tr><tr><td>점막 혈관 주소 세포 접착 분자 1 (MAdCAM-1) Fc 키메라</td><td>R& D Systems</td><td>6056-MC</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Natalizumab</td><td>Biogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 계수 챔버</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, human</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-601000</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 식염수 (PBS)&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>L 182-10</td><td>w/o Mg 및 Ca</td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름: Parafilm (PM-996)</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>정제된 항인간 CD18</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>고무 튜브: SC0059T 3-Stop LMT-55 튜빙, 1.02mm ID, 406.4mm 길이</td><td>Ismatec</td><td>SC0059</td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipetts</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc 키메라</td><td>Biolegend</td><td>553706</td><td></td></tr><tr><td>Vedolizumab (Entyvio)</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

면역 세포의 본질적인 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)의 병 인에 대 한 중요 하다. Integrin 종속 셀 접착 addressins이 과정에서 중요 한 단계 이며 접착을 방해 하는 치료 전략 성공적으로 설립 되었습니다. 궤 양성 대 장 염 (UC) 더 화합물 들을 따라 및 안티 α4β7 integrin 항 체, vedolizumab, Crohn의 질병 (CD)의 임상 치료를 위해 사용 됩니다.
접착 절차의 세부 사항 및 작업 메커니즘 안티 integrin 항 체의이 분야에서 기능 연구에 대 한 제한 된 사용 가능한 기술 때문에 많은 관계에서 여전히 명확 하지 않다.
여기, 우리는 IBD의 맥락에서 흐름 조건 하에서 인간의 세포 접착의 기능 분석 및 안티 integrin 치료의 영향에 대 한 동적 접착 분석 결과 제시. 그것은 실시간 현미경 분석 addressin 코팅 ultrathin 유리 모 세관을 통해 기본 인간 세포의 재 관류를 기반으로 합니다. 분석 결과 다양 한 수정 및 수정에 대 한 기회를 제공 하 고 기계적 발견 및 변환 응용 프로그램에 대 한 잠재력을 보유 하 고.

제시 하는 방법이이 원고에 최대한을 기능적으로 내 피 벽에 인간의 세포 접착의 과정 vivo에서 시뮬레이션 하는 것을 목표로 평가 세포 접착 및 간섭 항 체의 역할. 따라서, ultrathin 모 세관 addressins 코팅 되며 관심 관류 펌프를 사용 하 여 붙일 레이블된 인간의 세포와 끼얹는다. 라이브 셀 이미징는 addressins에 인간 세포의 접착을 사용 하 여 실시간으로 (그림 1)에서 볼 수 있습니다.
이 방법은 특히 IBD 치료 요법 안티-접착의 메커니즘을 명료 하 게 적당 하다. 그림 2A같이 ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 및 인간 PBMCs와 Isotype Fc 키메라로 코팅 하는 모세 혈관의 관류 3 add...

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

이 방법은 말초 기관에 호밍에 필요한 면역 세포의 접착 폭포에 관한 기본적인 면역 생물학 및 염증성 장 질환 연구의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 흐름 조건 하에서 세포 접착의 맥락에서 기능적 질문에 대답하기위한 편리하고 간단한 접근 법이라는 것입니다. 이 방법은 염증성 장 질환에서 세포 푸아화 항-인테그린 항체의 메커니즘을 탐구하기 위해 개발되었지만, 다른 염증성 질환 설정에서 유사한 문제를 분석하도록 수정될 수 있다.튜브에 약 0.5센티미터 직사각형 모세관의 삽입을 허용하기 위해 작은 가위로 한쪽에 고무 튜브 조각을 스트레칭하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 파라핀 필름과의 연결을 봉인합니다. 관심있는 주소의 20 마이크로 리터로 모세관을 코팅하고 37섭씨에서 적어도 한 시간 동안 플라스틱 파라핀 필름으로 튜브에 연결되지 않은 측면을 밀봉하십시오.인큐베이션이 끝나면 플라스틱 파라핀 필름을 제거하고 액체가 모세관을 종이 타월에 담그고 튜브를 비웁니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 적어도 한 시간 동안 20 마이크로리터의 블로킹 용액으로 모세관을 차단합니다. 코딩된 단백질의 기능을 손상시킬 수 있으므로 모세관의 건조를 피하기 위해 코팅을 제거한 후 모세관에 직접 차단을 적용하는 것이 매우 중요합니다.모세관이 막히는 동안, 50 밀리리터 튜브에서 항응성 전체 인간의 혈액 18 밀리리터를 추가하고 PBS를 가진 35 밀리리터의 총 부피로 혈액을 희석시십시오. 층 10 혈액 용액 하에서 밀도 그라데이션 배지의 밀리리터와 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 혈액 세포를 분리한다. 분리의 끝에서, 새로운 50 밀리리터 튜브에 밀도 그라데이션 매체의 인터페이스에서 말초 혈액 단핵 세포를 전송.그리고 신선한 PBS와 함께 튜브에 최대 50 밀리리터까지 튜브의 총 볼륨을 가져. 원심 분리 후 제조업체의 지침에 따라 적절한 세포 추적 염료로 세포를 계산하고 얼룩지게하기 위해 신선한 PBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 염색 배큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 완전한 RPMI 중간 농도의 밀리리터 당 6 개의 세포에 1.5 배 10에서 펠릿을 재중단.그런 다음 조건이있는 48 웰 플레이트의 많은 우물로 세포의 1 밀리리터를 시드합니다. 그리고 섭씨 37도에서 1시간 동안 적절한 우물에 항-인테그린 항체의 적절한 부피를 첨가한다. 다음으로 P1

dynamic-adhesion-assay-for-functional-analysis-anti-adhesion

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

염증성 장 질환에서 항접착 요법의 기능 분석을 위한 동적 접착 분석 분석

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

염증성 장 질환의 실험적 모델은 우리가 pathogenesis와 관련된 복잡한 본래과 적응 면역 반응을 조사 수 있습니다. histological 채점, 프로 - 염증 크린 시토킨 및 myeloperoxidase 활동 부량 사용하여, 하나는 염증성 장 질환에서 볼 이러한 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다.

IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

여기에서는 추정 세포 접착 분자의 고유 접착 특성을 특성화하기 위한 간단하고 빠른 방법을 제시합니다.  세포 접착 분자의 분비된 에피토프 태그가 붙은 엑토도메인(ectodomain)은 작고 균일한 기능화된 비드의 배양 배지에서 캡처됩니다.  그런 다음 이러한 beads를 간단한 bead aggregation assay에 즉시 사용할 수 있습니다.

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

염증성 장 질환 (IBD)의 현재 치료는 질병의 증상을 완화 목표로하지만 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 대안 전략은 동물 대장염 모델에서 연구되고있다. 여기서 우리는 임상 IBD 표지판에 다이어트 보조제의 유익한 효과는 이러한 대장염 모델에서 분석 방법에 대해 설명합니다.

실험 성 대장염 동안 장내 상피 장벽 기능에 영양 보조 식품의 유익한 효과 분석

무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

본 연구에서, 플루오레세인-이소티오시아네이트 표지(FITC) 덱스트란을 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여하여 생체 내 및 혈장 및 대변 샘플 모두에서 장 투과성을 평가합니다. 장 장벽 기능은 많은 질병 과정에서 영향을 받기 때문에 이 직접적이고 정량적인 분석은 다양한 연구 분야에서 사용될 수 있습니다.

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

조정 가능한 밀도를 가진 RGD 기능화된 avidin-biotin tethers를 사용하여 단일 이동 혈소판을 이미징하기 위한 자세한 프로토콜이 제공되어 혈소판이 avidin-biotin 결합을 파열하기에 충분한 힘을 생성한다는 것을 밝혔습니다.

RGD 기능성 Avidin-Biotin 테더를 사용한 혈소판 이동을 연구하기 위한 In vitro 분석

이 프로토콜은 크론병(CD) 유사 회장 염증 및 섬유증의 Src 상동성 2 도메인 함유 5'-이노시톨 포스파타제(SHIP) 결핍 마우스 모델을 사용하여 CD에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

크론병 유사 회장염 및 섬유증의 SHIP 결핍 마우스 모델에서 치료 개입 평가

배우세요 유동 조건에서 면역 세포의 동적 접착을 분석하는 방법을 통해 장 질환 연구에 활용하세요. 이 기술은 항-인테그린 항체와 화학유인체의 효과를 평가하여 염증성 장 질환 치료 전략 개발에 기여합니다.

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

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