인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

이 방법은 in vivo에서 특별히 설계된 생체 공학 조직의 효능이 무엇인지와 같은 눈의 자가 치료에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리는 동물 모델에서 눈 이식을 위해 조직을 처리하기 위한 전략뿐만 아니라 망막 조직을 생성하고 윤곽을 그리는 방법을 제공합니다. 30 x 30mm 크기의 인간 양막(hAM) 1-4개를 세척하는 것으로 시작합니다.

셰이커에 250ml 병에 담긴 80ml의 PBS에 나일론 골격을 5분 동안 고속으로 두 번 고정합니다. 두 번째 세척 후 각 병에 작동하는 Thermolysin 용액 40ml를 넣고 450rpm으로 5분 동안 병을 두 번 흔든 다음 30초 동안 와류를 만듭니다. Thermolysin 처리의 두 번째 라운드 후, 시연된 바와 같이 세척당 80ml의 PBS로 조각을 두 번 더 세척합니다.

그런 다음 긴 멸균 집게를 사용하여 hAM을 PBS 10ml가 들어있는 10cm 배양 접시에 개별적으로 옮깁니다. 다음으로 PBS의 두 번째 10cm 배양 접시에 나일론이 아래를 향하도록 한 개의 멤브레인을 놓고 멤브레인을 나일론에 고정하는 4개의 클립 중 2개를 분리합니다. 나일론과 멤브레인 사이에 배양 인서트의 더 작은 링을 삽입하고 멤브레인이 더 작은 링을 완전히 덮도록 합니다.

배양 인서트의 두 번째 부분을 멤브레인 상단에 클립하여 hAM의 기저막이 배양 인서트의 오른쪽이 위를 향하도록 하고 마지막 두 클립을 분리합니다. 그런 다음 멸균 가위를 사용하여 필요에 따라 배양 삽입물 외부의 멤브레인을 다듬습니다. 그리고 겸자를 사용하여 멤브레인을 섭씨 37도 및 5%CO2에서 보관하기 위해 PBS가 포함된 12웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.

파종하기 전에 바이알당 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 3ml의 RPE 배지에 1배의 10-6번째 RPE 세포를 담은 따뜻한 cryo 바이알을 가열합니다. 세포가 해동되면 피펫을 사용하여 각 튜브에서 단일 세포 현탁액을 얻고 tri pan blue exclusion으로 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 신선한 RPE 배지에서 밀리리터당 5번째 세포 농도에서 7배 10으로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 제조된 12웰 플레이트의 각 웰에서 PBS를 흡인하고, 각 배양 인서트의 중앙에 500마이크로리터의 세포를 추가하고, 각 웰의 바닥에 1ml의 RPE 배지를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 30일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣고 배양이 끝날 때까지 일주일에 두 번 배지를 교체합니다. 배양일 30일에는 섭씨 37도의 수조에서 8% 젤라틴 용액을 30분 동안 데웁니다.

그리고 비브라톰의 내부 챔버를 섭씨 4도의 CO2 독립 매체로 채웁니다. 메스를 사용하여 섭씨 4도에서 보관된 20% 젤라틴 블록에서 5cm x 5cm 블록을 자릅니다. 적절한 접착제로 블록의 윗면을 지지대에 고정합니다.

그리고 비브라톰에 새 블레이드를 놓습니다. 면도날과 같은 높이가 될 때까지 블록을 조정하고 지지대 주변의 수조를 섭씨 4도의 새로운 CO2 독립 매체로 채웁니다. 블록이 매끄러운 선행 표면으로 균일하게 절단될 때까지 중간 속도로 블록을 자르고 위치를 0으로 설정합니다.

그런 다음 젤라틴이 완전히 마를 때까지 젤라틴 주변의 매체를 흡입합니다. 그리고 집게를 사용하여 블록 위에 있는 RPE 시드 배양 인서트를 조심스럽게 엽니다. 가위를 사용하여 인서트 링 외부의 모든 멤브레인을 제거하고 잔류 매체의 전체 부피를 흡인합니다.

멤브레인이 덮일 때까지 최대 1ml의 8% 액체 젤라틴 용액을 추가합니다. 그리고 여분의 젤라틴을 조심스럽게 제거하십시오. 5-8분 후, 응고된 멤브레인이 덮일 때까지 섭씨 4도의 새로운 CO2 독립 매체를 수조에 추가합니다.

그리고 100 미크론 위치의 진동으로 조직의 방향을 유지하도록주의하면서 중간 속도로 멤브레인의 일부를 자릅니다. 섹션의 방향을 식별할 수 있도록 메스로 섹션의 모서리를 자릅니다. 그리고 주걱을 사용하여 젤라틴이 포함된 멤브레인을 섭씨 4도의 보존 매체로 채워진 6개의 웰 플레이트 중 하나로 옮깁니다.

모서리가 절단되기 전에 자유로운 움직임으로 인해 슬라이스의 방향이 반전될 수 있습니다. 따라서 섹션 바로 뒤에 있는 슬라이스의 위치를 고정하도록 주의하십시오. 그런 다음 이식 전에 외과용 현미경으로 이식 부위의 크기에 맞게 임플란트의 크기를 조정할 수 있습니다.

일반적으로 배양 삽입물에 고정된 후 멤브레인 표면에 몇 개의 죽은 세포가 남아 있지만 배양 배지가 변경되면 이러한 세포가 제거됩니다. 기저막의 섬유는 세포가 남아 있지 않을 때 더 높은 배율에서 볼 수 있으며, 이는 Thermolysin 처리 기간이 최적화되었음을 나타냅니다. 망막 상피는 성숙해짐에 따라 현미경으로 더 쉽게 볼 수 있게 되어 3주가 지나면 완전한 조약돌 같은 단층을 형성합니다.

4주가 되면 상피는 착상을 준비할 수 있을 만큼 충분히 성숙합니다. 이 절차를 시도하는 동안 젤라틴의 상태는 온도에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 권장 온도를 엄격히 준수하도록 주의하십시오.

개발 후, 이 기술은 줄기 세포 치료 분야의 연구자들이 색소성 망막염의 동물 모델에서 생체 공학 조직의 치료 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법은 골격 위에 조직을 준비하는 데 사용할 수 있지만 후속 이식을 위해 광 수용체 층을 포함하는 더 복잡한 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 매우 얇고 쉽게 접히는 경향이 있는 인간 양막을 다루기가 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

인간 양막 고정 및 젤라틴 포매 단계는 배우기 어렵고 특정 취급 접근 방식이 필요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다.