Name: 인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기세포에서 유래한 망막 색소 상피 세포를 이용해 양막에서 조직을 배양하고 동물 모델에 이식하는 조직 공학 방법을. 이 기법은 망막 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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저자는 여기 설명 하는 방법 설정 하는 동안 그들의 입력에 대 한 제롬 Larghero와 발레리 Vanneaux (Hôpital 세인트 루이스, 파리, 프랑스)에 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation 부 라 검색 Médicale [바이오 공학 프로그램-DBS20140930777] LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 올리비에 Goureau와 크리스텔 Monville에서. 그것은 NeurATRIS는 변환 연구 인프라 (Investissements d'Avenir) 신경 과학 [ANR-11-INBS-0011] 및 INGESTEM, 국가 인프라 (Investissements d'Avenir)에 biotherapies에 대 한 만능 기술에 의해 지원 되었다 고 차별화 된 줄기 세포 [ANR-11-INBS-000] 크리스텔 Monville에. 카림 벤 M'Barek DIM Stempole 및 LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 장학금에 의해 지원 되었다. 줄기 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 지 원하는 희귀 질환에 대 한 Biotherapies 연구소의 일부입니다-Téléthon.

이 프로토콜에 사용 되는 모든 인간의 재료 유럽 연합 규정에 따라 사용 되었다. 이 연구에 사용 된 인간의 ES 세포 라인 독특한 배아에서 파생 되었다. 부부는 배아를 기증 했다 완벽 하 게 통보 했다 고 익명 기부에 대 한 그들의 동의 주었다. 임상 등급 인간 ES 세포 라인이이 배아에서 파생 된, 틀, 자격, 되었고 제대로 문서화로 슬 린 셀 (영국)에 의해. 햄 (APHP, Hôpital 세인트루이스) 병원 지침에 따르면 태 반 기증에 대 한 동의 서명 하는 어머니에 제왕 절 동안 무 균 조건 하에서 조달 했다.
1입니다. 문화 미디어 및 시 약의 준비
<ol><li>
RPE 세포 배양 매체의 준비
	<ol>
<li>RPE 세포 배양 매체를 준비 하려면 추가 4% 혈 청 대체 (20 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한), 희석 1000 x 2-mercaptoethanol (500 mL의 최종 볼륨에 대 한 500 µ L), 및 1 %Eagle′s 최소 필수 매체 (MEM) 비 본질적인 아미노산 솔루션 (최종 5 mL 500 mL의 볼륨)를 수정된이 글 Dulbecco의 매체 (DMEM) 높은 포도 당 (475 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전송/보존 매체의 준비
	<ol>
<li>전송/보존 매체를 준비 하려면 CO2페니실린-스 (5 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한)의 1%를 추가-독립 매체 (495 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한) 4 ° c.에 그것을 유지 하 고</li>
	</ol>
</li>
	<li>
물의 Resuspension thermolysin 효소의
	<ol>
<li>Thermolysin의 재고 솔루션의 준비<ol>
<li>Thermolysin의 재고 솔루션을 준비, 실내 온도-20 ° C에 저장 된 thermolysin 분말을 녹여.</li>
			<li>효소 활동 변수 배치에서 배치 될 수 있습니다, 사용할 수 일괄 처리의 thermolysin 가루와 함께 제공 된 분석의 인증서에 따라이 작업을 계산 합니다. 분할은 "활동 중립 Protease 계산 = ANPC" (분석의 인증서에 표시 된) 181 (이 티로신의 분자량)에 의해. 결과 얻은 제공 된 thermolysin 분말 (U/유리병)의 총 효소 활동에 해당 합니다.</li>
			<li>총 효소 활동 (U/유리병) 200 (U/mL)로 나눈 값에 해당 하는 물의 볼륨을 추가 하 여 200 U/mL에서 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
			<li>위쪽 및 아래쪽에 추가 된 물 pipetting으로 효소를 분해. 소용돌이 30 s 및 확인에 대 한 솔루션 여부 분말 완전히 일시 중지 되었습니다. 더 많은 pipetting 전체 해산에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
			<li>약 수 재고 솔루션-20 ° c.에 그것을 저장 하 고</li>
		</ol>
</li>
		<li>Thermolysin의 작업 솔루션의 준비 참고: thermolysin 솔루션 햄 치료 당일에 준비 되어야 한다.<ol>
<li>해 동 thermolysin-20 ° c.에 저장 된 200 U/mL에서의 주식 aliquots 1 U/mL의 마지막 효소 활동을 얻기 위하여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 재고 솔루션 200 x 희석. 1-4 햄 패치 치료 40 mL를 준비 합니다.</li>
			<li>Thermolysin 솔루션을 사용 하 여 0.2 µ m 필터 사전 통해 필터링.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
젤라틴의 물의 Resuspension
	<ol>
<li>20% 젤라틴 솔루션 및 블록의 준비 참고: 20% 젤라틴 솔루션 및 블록 수 있습니다 준비까지 사용 하기 전에 1 주.<ol>
<li>CO2를 따뜻한-42 ° c (최대 1 h) 30 분 물 욕조에 독립 매체. 50 mL 튜브에 추가의 40 mL에 젤라틴의 10 g CO2예 열-독립 매체 및 소용돌이 솔루션.</li>
			<li>42 ° c.에 30-60 분 젤라틴 해산 소용돌이 균질 솔루션을 각 10 분.</li>
			<li>일단 해결책은 균질, 4 6 cm 문화 요리 20% 젤라틴 솔루션의 4 mL를 추가 합니다. 거품을 하지 마십시오. 요리를 보호 하기 위해 플라스틱 파라핀 영화를 추가 하 고 4 ° c.에 강화 하기 위해 솔루션을 수</li>
		</ol>
</li>
		<li>8% 젤라틴 용액의 준비 참고: 8% 젤라틴 솔루션 사용 하기 전에 날 준비 그리고 4 ° c.에 저장<ol>
<li>CO2를 따뜻한-42 ° C (최대 1 h) 30 분 동안에 독립 매체. 50 mL 튜브에 추가의 46 ml 젤라틴 4 g CO2예 열-독립 매체 및 소용돌이 솔루션.</li>
			<li>42 ° c.에 30-60 분 젤라틴 해산 플라스틱 파라핀 영화 튜브를 보호 하 고 계속 물 욕조에 37 ° C에서 같은 날 사용 하는 경우를 추가 하거나 나중에 사용 하는 경우 4 ° C에서 그것을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Thermolysin 치료 인간 양수 막의
<ol><li>
인간의 양수 막 세척
	<ol>
<li>햄 작은 조각 (약 30 x 30 mm) PBS에 4 ° C에서 이미 나일론 비 계에 고정 또는 고정으로 제공 했습니다. 제공 하는 경우 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 막 해 동 냉동.</li>
		<li>세포 막 세척:<ol>
<li>PBS의 80 mL를 포함 하는 250 mL 병에서 1-4 막 장소. 많은 병을 사용 하 여 필요에 따라.</li>
			<li>5 분 동안 고속에 판 통에 각 병을 흔들어 다음 PBS를 삭제 합니다. PBS와 반복의 80 mL를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thermolysin 치료
	<ol>
<li>포함 하는 막 병 당 thermolysin (1 U/mL)의 작업 솔루션의 40 mL를 추가 (1-4 막 병; 당 한 번에 최대 3 병).</li>
		<li>450 rpm 그리고 소용돌이에 5 분 동안 병을 흔들어 30 그들 s. 1 x 반복.</li>
		<li>Thermolysin 솔루션을 삭제 하 고 PBS의 80 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>450 rpm에서 5 분 동안 병을 흔들어. PBS를 삭제 하 고 PBS의 80 mL를 추가 합니다. 3 배를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 문화 삽입에 인간의 양수 막의 고정
<ol><li>햄 하나, 하나를 제거 하 긴 살 균 겸 자 (그는 병의 바닥을 도달할 수 있다)를 사용 하 고 각 햄 PBS의 10 mL를 포함 하는 10 cm 문화 접시에 전송.</li>
	<li>10 mL PBS의 포함 된 새로운 10 cm 문화 접시, 아래로 나일론 막의 한을 놓습니다. 2 나일론에 멤브레인을 해결 하는 데 사용 되는 4 개의 클립을 분리 합니다.</li>
	<li>나일론 및 막 사이 문화 삽입의 작은 링을 삽입 합니다.</li>
	<li>막 작은 반지를 완전히 덮는 다는 것을 확인 하십시오. 막 위에 문화 삽입의 두 번째 부분을 클립. 햄의 지하실 막 문화 삽입 내부 직면 하고있다. 마지막 두 클립을 분리 합니다.</li>
	<li>잘라, 멸 균가 위로, 문화 삽입 필요한 경우 외부 막의 초과. 12-잘 접시에 문화 삽입에서 고정 막 전송 집게를 사용 하 여 PBS를 더하고 37 ° C, 5% CO2인큐베이터에 접시를 저장.</li>
	<li>다른 멤브레인과 (3.2 3.5 단계)에서 이러한 작업을 반복 합니다.</li>
</ol>4. 해빙 및 인간 양수 내 세포 막에 망막 안료 상피 세포의 시드
<ol><li>
망막 색소 상피 세포의 해빙
	<ol>
<li>RPE 세포 은행 극저온 유리병 당 1 백만 세포에서 액체 질소에서 고정입니다. 필요에 따라 많은 극저온 튜브를 녹여 (350000 세포 막 당 시드 있습니다).</li>
		<li>극저온 유리병 당 RPE 매체의 3 mL를 포함 하는 15 mL 튜브를 준비 합니다. 일단 병 동 각 튜브를 셀을 전송 합니다. 다른 튜브에 대 한이 작업을 반복 합니다.</li>
		<li>균질 (위쪽 및 아래쪽을 몇 번을 플라스틱 resuspend RPE 중간에 셀) 셀 솔루션의 10 µ L과 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. Trypan 블루의 10 µ L를 추가 합니다. 세 실에서이 솔루션의 장소 15 µ L 다음 가능한 셀 (파란색에서 색 하지) 4 X 목표 현미경의 수를 계산 합니다. 다른 튜브에 대 한이 작업을 반복 합니다.</li>
		<li>한편, 원심에서 110 x g 5 분 삭제에 대 한 15 mL 튜브는 상쾌한 고 700000 셀/mL에서 셀 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간 양 막 세포 막으로 망막 색소 상피 세포의 시드
	<ol>
<li>포함 하는 인큐베이터에서 막 12 잘 플레이트를 제거 합니다.</li>
		<li>PBS 발음 준비 단계 4.1.4 문화 삽입의 센터에에서 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. (잘) 내 문화 삽입 외부 RPE 매체의 1 mL를 추가 합니다. 다른 막에 대 한 반복 합니다.</li>
		<li>포함 하는 인큐베이터에서 막 12-잘 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 인간의 양수 내 세포 막에 망막 안료 상피 세포 배양의 유지 보수
<ol><li>중간 2 갱신 월요일과 금요일 때까지 적어도에 보통 주당 x 문화권의 일 30.</li>
	<li>각 잘 문화 삽입 내외 매체를 발음 하 고 신선한 매체 (문화 삽입 외부 1 mL 및 내부 500 µ L)으로 갱신. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 접시를 놓습니다.</li>
</ol>6. 망막 안료 상피 패치 이식에 대 한 준비
참고: 하루 30 문화에서 시작, 조직이 식을 위한 준비 이다.
<ol><li>따뜻한 물 목욕 30 분 동안 37 ° C에서 8% 젤라틴 솔루션 작성 찬 CO2와 vibratome의 내부 챔버-독립 매체 (4 ° C)에서.</li>
	<li>
장소는 vibratome로 20% 젤라틴 블록.
	<ol>
<li>냉장고에서 20% 젤라틴의 블록을 포함 하는 6 cm 문화 접시를 가져가 라. 메스를 사용 하 여, 5 cm x 5 cm 블록을 잘라. Cyanoacrylate 접착제 또는 해당 지원 블록의 상단 측면을 붙여 넣습니다.</li>
		<li>장소는 vibratome에 새로운 블레이드입니다.</li>
		<li>면도날의 동일한 수준에 올 때까지 블록의 레벨을 조정 합니다.</li>
		<li>신선한 CO2지원 주위 목욕을 채우기-4 ° c.에 독립 매체 Vibratome 블록 균일 하 게 잘라 때까지 중간 속도 사용 하 여, 매끄러운 표면에 지도 함께 블록을 잘라. 0 위치를 설정 합니다.</li>
		<li>그것은 완전히 건조 될 때까지 젤라틴의 블록 주위 매체 발음 그리고 포함 하는 37 ° c.에 인큐베이터에서 조직 12 잘 문화 접시</li>
		<li>집게를 사용 하 여 신중 하 게 젤라틴 블록 위에 문화 삽입을 엽니다. 커트가 위, 막 (세포 배양 하지 했다 반지) 외부 세포를 포함 하지 않는의 모든 부분. 전체 잔여 중간 발음</li>
		<li>멤브레인을 커버 하기 위해 37 ° C에 액체 8% 젤라틴 용액 1 mL를 추가 합니다. 초과 조심 스럽게 제거. 응고에 젤라틴을 허용 하도록 5-8 분을 기다립니다.</li>
		<li>신선한 CO2추가-막 덮여 때까지 목욕 (4 ° C)에서 독립 매체.</li>
		<li>절단, 블록 동작 하는 방법을 알고 남은 중간 속도-100 µ m의 위치에 vibratome와 함께. 섹션의 끝에, 조직의 방향을 유지 하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
		<li>메스, 잘라 섹션의 방향을 식별 하는 코너.</li>
		<li>주걱으로 젤라틴에 포함 된 멤브레인을 수집 하 고 받는 사람 눈으로 접목까지 4 ° C에서 보존 매체 가득 6 잘 플레이트에 배치.</li>
		<li>이식 시 수술 현미경 (쥐에 대 한 1-3, 비 인간 영장류에 대 한 10-15 m m2 ) 받는 사람 눈의 크기에 임 플 란 트의 크기를 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

올리비에 Goureau 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허에 발명자 이다. 다른 저자는 공개 없다.

우리는 생물 학적 비 계 및 동물 모델에 이식에 대 한 준비에 RPE 세포의 문화에 대 한 메서드를 설명합니다. 프로토콜의 중요 한 단계 중 하나는 젤라틴으로 포함 될 때까지 절차를 따라 햄의 방향의 정비 이다. 실제로, 막의 네이티브 상피 제거 되 고 그것의 지하실 막 노출된9된다. RPE 세포 지하실 막이 위에 씨앗을 품고 있다. 젤라틴을 포함 하기 위한 준비, 시 정의 된 온도에서 모든 제품을 사용 하는 중요 한 됩니다. 실제로, 젤라틴은 4 ° C와 바디 온도 (37 ° C)9에서 액체에서 단단한 수 속성이 있습니다. 온도 존경 하지, 젤라틴 응고 수 있다 또는이 효과 적절 하지 단계에서 액 화.
몇 가지 생물 학적 건설 기계 제안 되었습니다, 멧의 막25 또는 햄26처럼. 특히, 햄, 제왕 절 개<su...

RPE 생존 및 대뇌는 그것은 밀접 하 게 관련 된1의 항상성 위해 결정적 이다.입니다. 여러 가지 병 적인 조건 변경의 기능 및 생존, RP 등 AMD.
RP는 RPE 세포 또는 두2,3, 대뇌의 기능에 영향을 주는 상속된 monogenic 돌연변이의 그룹입니다. 그것은 특히 RPE에 영향을 주는 돌연변이 세포 RP2의 5 %는 추정. AMD는 다른 조건이 RPE 레이어 변경 최고의 궁극적으로 중앙 시각 손실. AMD은 유전과 환경 요인의 복잡 한 상호 작용에 의해 발생 하 고 노인4,,56에 영향을 줍니다. 계획에 따르면 AMD 20207에 의해 전세계 196 백만 환자에 대 한 우려 됩니다. 이러한 장애에 대 한 효과적인 치료법 존재 하 고 제안 하는 전략 중 하나 죽은/작동 하지 않는 기존 RPE 세포8에 대 한 보상 하기 위해 새로운 RPE 세포의 이식입니다.
투입 될 최종 제품의 배합의 모드 기능 최고의 결과 보장 하기 위해 필수적 이다. 그들의 생존, 통합 및 기능9,10,,1112 에 관한 우려를 제기 하는 RPE 세포로는 셀 서 스 펜 션, 배달, 쉽고 간단 방법 임에도 불구 하 고 주입 , 13. 과학자는 지금 개발 하 고 더 복잡 한 공식 제공 설계 망막 조직9,13,14,,1516. 이러한 맥락에서 우리는 체 외에서 RPE 조직 이식9에 사용할 수 있는 생성 하는 원래 방법 개발.
인간 미 발달 줄기 (ES) 세포에서 파생 된 RPE 세포 은행이이 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 대안 RPE 세포 은행 (인간 유도 만능 줄기 세포, 기본 RPE 세포, 등) 다른 셀 소스에서 다른 방법으로 분화 하 고이 프로토콜에 대 한 적절 한 있습니다. 그것은 포함 하는 감독된 차별화 cytokines 그리고/또한 작은 분자17,18,19,20,,2122를 사용 하 여 프로토콜.
이식 하는 비 계에 설계 조직을 준비 한다. 지난 몇 년 동안, 다른 건설 기계는 폴리머 또는 생물 기원13,,2324의 매트릭스에 기반으로 개발 되었다. 여기, 생물 학적 기판 사용 햄, 하지만 denuded Bruch 막 같은 다른 기판에 구현 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 RPE 네이티브 환경에 더 관련 된 생물 비 계를 사용 하 여 이점이 있습니다.
인간의 ES 세포 유래 RPE 세포 완전히 조약돌 단층으로 구성 하기 위해서는 적어도 4 주 동안 교양. 그 단계에서 얻은 상피 기능적 이며9편광. 마지막으로,이 조직 쉽게 주름로 그것을 한번 더 강성과 탄성 주입 절차 동안 그것을 보호 하기 위해 하이드로 겔 캐리어의 얇은 층에 포함 됩니다. 이 제품은 다음 접목까지 4 ° C에 저장 됩니다.

<table><tbody><tr><td>멸균 생물안전 캐비닛</td><td>TechGen International</td><td>해당</td><td></td></tr><tr><td>없음 흡인을 위한 액체 폐기물 처리 시스템</td><td>Vacuubrand</td><td>BVC 21</td><td></td></tr><tr><td>CO2-제어 +37&nbsp; &데그; C 세포 인큐베이터</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>BVC 21 NT</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &마이크로; L 피펫: P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; mL 피펫: P1000</td><td>Gilson</td><td>F144566</td><td></td></tr><tr><td>피펫 에이드</td><td>Drummond</td><td>75001</td><td></td></tr><tr><td>+4&nbsp; &데그; C 냉장고</td><td>Liebherr</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>WPI</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (x2)</td><td>WPI</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Grant subaqua pro</td><td>SUB6</td><td></td></tr><tr><td>정밀 밸런스</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorff</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>SC30</td><td></td></tr><tr><td>수평 흔들기</td><td>쉐이커 IKA-WERKE</td><td>IKA MTS 214D</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>Lab Danger S40</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>WPI</td><td>500351</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름</td><td>VWR</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>0.200 &마이크로; m 일회용 주사기 필터</td><td>SARTORIUS</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>주사기(바늘 제외) 50mL</td><td>Dutscher</td><td>50012</td><td></td></tr><tr><td>병 250mL</td><td>Dutscher</td><td>28024</td><td></td></tr><tr><td>15mL 멸균 Falcon 튜브</td><td>Dutscher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50mL 멸균 Falcon 튜브</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>배양 인서트</td><td>Scaffdex</td><td>C00001N</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm 세포 배양 disches: B6</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>12 웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>Castorama 3178040670105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (500&nbsp; mL)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysine</td><td>Roche</td><td>5339880001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td><td>Invitrogen</td><td>12618-013</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol (50&nbsp; mM)</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>CO2-independent medium</td><td>GIBCO</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>MERCK</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>human amniotic membrane</td><td>Tissue bank St Louis hospital (Paris, France)</td><td>적용되지 않음</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

눈의 여러 가지 병 적인 조건에는 기능 또는 망막 안료 상피 (RPE)의 생존에 영향을. 이러한 망막 화 (RP) 및 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 일부 형태를 포함합니다. 세포 치료는 이미 인 간에 있는 예비 결과 격려와 함께 이러한 질병을 치료를 제안 하는 가장 유망한 치료 전략 중 하나 이다. 그러나,는 이식의 준비의 방법의 기능적 결과 비보에 상당한 영향을 있다. 실제로, 세포 현 탁 액으로 투입 하는 RPE 세포는 망막 조직으로 이식 하는 같은 셀 보다 덜 기능적 이다. 여기, 우리 엔지니어 RPE 조직과 vivo에서 이식에 대 한 준비를 간단 하 고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 RPE 세포 생물학 지원, 인간의 양수 막 (햄)에 시드 있습니다. 인공 건설 기계에 비해,이 지원 Bruch의 막 생 RPE 세포 연결 된 가까운 지하실 막의 이점이 있다. 그러나, 그것의 조작 쉽지 않다, 그리고 우리가 그것의 적절 한 경작에 대 한 몇 가지 전략 및 준비에 비보를 접목 개발.

햄은 RPE 세포의 뿌리기 전에 제거 되어야 한다 상피 층 포함. 막의 효소 치료는 떨고 아래 thermolysin와 함께 수행 됩니다. 순서 대로 하지 아니 막 (상피는 1 개의 측에)의 극성을 잃고, 그것은 어떤 구성 (그림 1A) 공급자에 따라 다를 수는 지원에 고정. 이 단계에서 그것의 지원에 막의 접착을 확인 하 고 필요한 경우 클립을 추가. 문화 삽입에 고정 시 막에 있는 구멍을 만드는 피하기 위해 신중 하 게 작업 하 고 (그림 1B)을 향하도록 하는 지하실 멤브레인와 함께 그것의 극성을 유지 합니다. 세포는 세포 막에 씨를 뿌리고, 그들은 이러한 구멍에서 탈출 수 그리고 마지막 셀 농도 감소 될 것 이다. 구멍의 존재는 현미경 또는 문화 삽입 내부 PBS를 추가 PBS 누수 되는 경우를 확인 하 여 구상 될 수 있습니다. 어떤 막 구멍을 폐기 해야한다...

망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

이 방법은 in vivo에서 특별히 설계된 생체 공학 조직의 효능이 무엇인지와 같은 눈의 자가 치료에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리는 동물 모델에서 눈 이식을 위해 조직을 처리하기 위한 전략뿐만 아니라 망막 조직을 생성하고 윤곽을 그리는 방법을 제공합니다. 30 x 30mm 크기의 인간 양막(hAM) 1-4개를 세척하는 것으로 시작합니다.셰이커에 250ml 병에 담긴 80ml의 PBS에 나일론 골격을 5분 동안 고속으로 두 번 고정합니다. 두 번째 세척 후 각 병에 작동하는 Thermolysin 용액 40ml를 넣고 450rpm으로 5분 동안 병을 두 번 흔든 다음 30초 동안 와류를 만듭니다. Thermolysin 처리의 두 번째 라운드 후, 시연된 바와 같이 세척당 80ml의 PBS로 조각을 두 번 더 세척합니다.그런 다음 긴 멸균 집게를 사용하여 hAM을 PBS 10ml가 들어있는 10cm 배양 접시에 개별적으로 옮깁니다. 다음으로 PBS의 두 번째 10cm 배양 접시에 나일론이 아래를 향하도록 한 개의 멤브레인을 놓고 멤브레인을 나일론에 고정하는 4개의 클립 중 2개를 분리합니다. 나일론과 멤브레인 사이에 배양 인서트의 더 작은 링을 삽입하고 멤브레인이 더 작은 링을 완전히 덮도록 합니다.배양 인서트의 두 번째 부분을 멤브레인 상단에 클립하여 hAM의 기저막이 배양 인서트의 오른쪽이 위를 향하도록 하고 마지막 두 클립을 분리합니다. 그런 다음 멸균 가위를 사용하여 필요에 따라 배양 삽입물 외부의 멤브레인을 다듬습니다. 그리고 겸자를 사용하여 멤브레인을 섭씨 37도 및 5%CO2에서 보관하기 위해 PBS가 포함된 12웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.파종하기 전에 바이알당 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 3ml의 RPE 배지에 1배의 10-6번째 RPE 세포를 담은 따뜻한 cryo 바이알을 가열합니다. 세포가 해동되면 피펫을 사용하여 각 튜브에서 단일 세포 현탁액을 얻고 tri pan blue exclusion으로 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 신선한 RPE 배지에서 밀리리터당 5번째 세포 농도에서 7배 10으로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.다음으로, 제조된 12웰 플레이트의 각 웰에서 PBS를 흡인하고, 각 배양 인서트의 중앙에 500마이크로리터의 세포를 추가하고, 각 웰의 바닥에 1ml의 RPE 배지를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 30일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣고 배양이 끝날 때까지 일주일에 두 번 배지를 교체합니다. 배양일 30일에는 섭씨 37도의 수조에서 8% 젤라틴 용액을 30분 동안 데웁니다.그리고 비브라톰의 내부 챔버를 섭씨 4도의 CO2 독립 매체로 채웁니다. 메스를 사용하여 섭씨 4도에서 보관된 20% 젤라틴 블록에서 5cm x 5cm 블록을 자릅니다. 적절한 접착제로 블록의 윗면을 지지대에 고정합니다.그리고 비브라톰에 새 블레이드를 놓습니다. 면도날과 같은 높이가 될 때까지 블록을 조정하고 지지대 주변의 수조를 섭씨 4도의 새로운 CO2 독립 매체로 채웁니다. 블록이 매끄러운 선행 표면으로 균일하게 절단될 때까지 중간 속도로 블록을 자르고 위치를 0으로 설정합니다.그런 다음 젤라틴이 완전히 마를 때까지 젤라틴 주변의 매체를 흡입합니다. 그리고 집게를 사용하여 블록 위에 있는 RPE 시드 배양 인서트를 조심스럽게 엽니다. 가위를 사용하여 인서트 링 외부의 모든 멤브레인을 제거하고 잔류 매체의 전체 부피를 흡인합니다.멤브레인이 덮일 때까지 최대 1ml의 8% 액체 젤라틴 용액을 추가합니다. 그리고 여분의 젤라틴을 조심스럽게 제거하십시오. 5-8분 후, 응고된 멤브레인이 덮일 때까지 섭씨 4도의 새로운 CO2 독립 매체를 수조에 추가합니다.그리고 100 미크론 위치의 진동으로 조직의 방향을 유지하도록주의하면서 중간 속도로 멤브레인의 일부를 자릅니다. 섹션의 방향을 식별할 수 있도록 메스로 섹션의 모서리를 자릅니다. 그리고 주걱을 사용하여 젤라틴이 포함된 멤브레인을 섭씨 4도의 보존 매체로 채워진 6개의 웰 플레이트 중 하나로 옮깁니다.모서리가 절단되기 전에 자유로운 움직임으로 인해 슬라이스의 방향이 반전될 수 있습니다. 따라서 섹션 바로 뒤에 있는 슬라이스의 위치를 고정하도록 주의하십시오. 그런 다음 이식 전에 외과용 현미경으로 이식 부위의 크기에 맞게 임플란트의 크기를 조정할 수 있습니다.일반적으로 배양 삽입물에 고정된 후 멤브레인 표면에 몇 개의 죽은 세포가 남아 있지만 배양 배지가 변경되면 이러한 세포가 제거됩니다. 기저막의 섬유는 세포가 남아 있지 않을 때 더 높은 배율에서 볼 수 있으며, 이는 Thermolysin 처리 기간이 최적화되었음을 나타냅니다. 망막 상피는 성숙해짐에 따라 현미경으로 더 쉽게 볼 수 있게 되어 3주가 지나면 완전한 조약돌 같은 단층을 형성합니다.4주가 되면 상피는 착상을 준비할 수 있을 만큼 충분히 성숙합니다. 이 절차를 시도하는 동안 젤라틴의 상태는 온도에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 권장 온도를 엄격히 준수하도록 주의하십시오.개발 후, 이 기술은 줄기 세포 치료 분야의 연구자들이 색소성 망막염의 동물 모델에서 생체 공학 조직의 치료 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법은 골격 위에 조직을 준비하는 데 사용할 수 있지만 후속 이식을 위해 광 수용체 층을 포함하는 더 복잡한 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 매우 얇고 쉽게 접히는 경향이 있는 인간 양막을 다루기가 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.인간 양막 고정 및 젤라틴 포매 단계는 배우기 어렵고 특정 취급 접근 방식이 필요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

여기서는 인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기법을 제시합니다.

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

비인간 영장류 (NHP)는 해부학적 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 망막 세포 치료법을 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 원고는 NHP 눈의 망막 색소 상피 세포의 피하 학적 이식 방법과 황반 조작과 관련된 수술 내 합병증을 방지하기위한 전략을 설명합니다.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

이 프로토콜은 망막 변성이 있거나 없는 마우스 수용자에서 수술 합병증 발생률이 낮은 망막하 세포 이식편을 안전하고 정확하게 전달하기 위한 동공 시야 유도 경공막 접근법을 제시합니다.

망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

배우세요 인간 다능성 줄기세포에서 유래한 망막 색소 상피 세포를 이용해 양막에서 조직을 배양하고 동물 모델에 이식하는 조직 공학 방법을. 이 기법은 망막 질환 치료 연구에 활용됩니다.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

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