Name: 3 보완 방법을 사용 하 여 태 반 대상 약물 전달의 안전과 효율성의 종합 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 학습하세요 태반 표적 약물 전달의 안전성과 효율성을 평가하는 방법을 생체 내 영상, 고주파 초음파, HPLC를 활용하여. 이 기술은 임신 합병증 치료 연구에 활용됩니다.

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이 작품에서 국립 자연 과학 재단 (81771617) 및 자연 과학 재단의 광 동 지방 (2016A030313178) X.F.;에 게 수 여 교부 금에 의해 지원 되었다 심천 기본 연구 기금 (JCYJ20170413165233512) X.F;에 수 여에서 부여 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 아동 건강 및 보너스 번호 R01HD088549에서 건강의 국가 학회의 인간 발달 (전적으로 저자의 책임은 내용과 반드시 공식 대표 하지 않는다 국립 보건원의 조회) N.N. 하

모든 마우스 실험 동물 관리 및 사용 위원회의 심천 연구소의 첨단 기술, 과학의 중국 아카데미에 의해 승인 되는 프로토콜 (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232)에 엄격 하 게 따 랐 다.
1. 태 반 Chondroitin 황산 염 A 대상 지질 고분자 나노 입자의 합성
<ol><li>MTX 및 ICG 로드 지질 고분자 나노 입자를 합성 (MNPs와 INPs 각각) plCSA BP 활용 된 나노 입자 (plCSA-MNPs와 plCSA INPs)에 설명 된 대로 자세하게 다른18.</li>
</ol>2. vivo 형광 이미징
<ol><li>
임신 쥐의 준비
	<ol>
<li>한 장에 동일한 긴장의 비옥한 남성 여성 CD-1 마우스 (8-12 주) 장소 (남성: 여성 = 1:2) 확인 하 고 오후에는 질 플러그 다음 아침. 질 플러그 관찰 되는 경우 배아 하루 0.5 (E0.5)으로 마우스를 정의 합니다.</li>
		<li>집 임신 마우스 혼자 어두운 14 h 빛/10 h 동물 병원 체 없는 방에 주기을 E14.5까지 음식과 물에 대 한 무료 액세스를 제공 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나노 입자의 정 맥 주입
	<ol>
<li>절차, 전에 0.22 μ m 주사기 필터를 통해은 나노 여과 의해 소독. 수량 및 나노 사출의 볼륨을 결정 하기 위해 E11.5에서 임신 마우스 무게. 참고: 나노 사출 볼륨 1% 미만 (볼륨/중량) 임신 마우스의 몸 무게의 이어야 한다. 예를 들어 나노 사출 볼륨 25 g 마우스에 0.25 mL 미만 이어야 한다.</li>
		<li>꼬리 정 맥 팽창가 열 패드와 함께 5-10 분에 대 한 꼬리를 따뜻한.</li>
		<li>28 g 인슐린 주사기에 주입 하기 전에 INPs 또는 plCSA INPs 발음.</li>
		<li>임신 마우스를 꼬리 정 맥에 대 한 액세스를 허용 하는 동안 마우스를 멈출 지주 장치 전송. 꼬리는 알코올 면봉으로 청소 합니다. 다음 꼬리 정 맥에 주사기를 삽입 합니다. 천천히 주입 INPs 또는 plCSA-INPs (5 mg/kg ICG 해당)도 압력에 5-10 s. 참고: 물집에 나타나면 꼬리 때문에이 결과 바늘 임을 나타냅니다 하지 정 맥 주입을 중지 합니다. 주사기는 질병 전송 최소화 하기 위해 마우스 및 교차 오염을 사이 공유 되지 않을.</li>
		<li>사출 시간을 기록 합니다. 한편,는 일반적으로 30-60 s 출혈 정지까지 사출 사이트에 부드러운 압력을 적용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vivo에서 화상 진 찰
	<ol>
<li>주입 후 30 분 임신 쥐에서 vivo 형광 이미징 시스템을 사용 하 여 이미지.</li>
		<li>Anesthetize 1.0 L/min와 isoflurane 마 취 단위의 관련된 상공에 2-4%의 산소 흐름 속도와 임신 쥐 고 느린에 의해 전체 마 취와 일반 호흡을 확인 합니다. 그런 다음 이미징 챔버로 이동 합니다. 부정사 위치에 동물 유지 이미징 실로 마 취 임신 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>입과 마 취를 유지 하기 위해 1.0 L/min의 산소 흐름 속도 1-2 %isoflurane 흡입 수 있도록 코 코 콘 장소.</li>
		<li>ICG 형광 신호를 이미지를 2D 형광 및 사진 매개 변수를 선택 합니다. 설정 자동 으로 노출과에 여기/방출 파장 710/820 nm.</li>
		<li>이미징 절차의 끝에, 마 취, 막으려고 isoflurane 유입 해제 하 고 신중 하 게 그들의 감 금 소를 임신 쥐를 반환.</li>
		<li>나노 사출 후 48 h anesthetize isofluorane와 임신 쥐 그리고 자 궁 탈 댐 희생. 태아와 반응과 Graefe 집게, Graefe 조직 집게를 사용 하 고 해 부가 위를 수집 합니다.</li>
		<li>반응과 태아 이미징 실과 단계 2.3.4에서에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 이미지에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HFUS 배아 발달의 평가
<ol><li>
동물 모델
	<ol>
<li>얻기 및 단계 2.1에에서 설명 된 대로 임신 쥐를 준비.</li>
		<li>HFUS를 사용 하 여 E 6.5 (3.2 및 3.3.3 프로토콜)에서 이미지 임신 쥐. 첫째, 하루 E6.5에 배아를 시각화 하 여 임신을 확인 하 고 다음 세 그룹으로 임신 쥐를 무작위로 할당: MNP 그룹, plCSA MNP 그룹 및 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 그룹.</li>
		<li>주사 PBS, MNPs 또는 plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX 상응) 임신 쥐의 꼬리 정 맥으로 매일 2.2 단계에서 설명한 대로 E6.5에서 시작.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미징에 대 한 준비
	<ol>
<li>나노 입자, 주사 후 24 h 이미지 이미징 시스템 HFUS를 사용 하 여 임신 쥐.</li>
		<li>2.3.2 단계에서 설명한 대로 임신 쥐를 anesthetize. 이미징 플랫폼의 통합된 온도 제어를 켜고, 37-42 ° c 플랫폼을 예 열 테이프를 사용 하 여 플랫폼에 부정사 위치에 임신 쥐를 보호 합니다.</li>
		<li>장소 코 콘 주 둥이 통해 마 취 단위에 연결. 1.0 L/min 꾸준한 마 취를 유지 하는 산소 유량과 2 %isoflurane 적용 됩니다.</li>
		<li>화학적 depilatory 크림을 사용 하 여 복 부에서 머리를 제거 합니다. 물에 젖은 거 즈로 깨끗이 잔여 크림을 닦 고 젤 커플링 음향 복 코트.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
영상 절차
	<ol>
<li>기계 팔에서 40 MHz 변환기를 놓습니다.</li>
		<li>초점 영역에서 관심 영역으로 태아와 태 반에의 경도 이미지를 변환기 위치를 조정 합니다.</li>
		<li>
B 모드 영상과 분석 참고: 영화 1<ol>
<li>B 모드 버튼을 클릭 하 고 태아와 태 반 보기에 올 때까지 복 부에 변환기를 낮은. 시작/정지 영상, 씨 네 저장 을 누릅니다을 씨 네 루프 저장 프레임 저장 프레임 이미지를 저장 하 게 스캔/동결 을 누릅니다.</li>
			<li>임신 성 골목 길이 (GS), 태아 크라운 둔 부 길이 (CRL), biparietal 직경 (BPD), 복 부 둘레 (AC), placental 직경 (PD)와 태 반 두께 (PT) 분석 측정 버튼을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
PW 도플러 영상 및 분석 참고: 영화 1<ol>
<li>동일을 사용 하 여 프로젝션 스캔, 비밀 번호 버튼을 클릭, 샘플링 볼륨 상자 탯 줄 동맥의 중심에 놓고 스캔/동결 이미징 시작을 누릅니다. 탯 줄 동맥 이미지 수집 하 씨 네 저장 을 클릭 합니다.</li>
			<li>탯 줄 동맥 피크 속도 (UA)를 계산 하기 위해 측정 버튼을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
색 도플러 모드 영상 및 분석
		<ol>
<li>동일을 사용 하 여 프로젝션 스캔 컬러 버튼을 클릭을 태아 심장의 이미지를 변환기 위치를 조정. 스캔/동결 이미징 및 씨 네 이미지 수집 저장 시작을 누릅니다.</li>
			<li>태아의 심장 박동 (인사)을 계산 하려면 측정값 단추를 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. HPLC 분석
<ol><li>
조직 준비
	<ol>
<li>늦은 임신에서 MNPs 또는 plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX 동등 물)의 단 하나의 복용량을 임신 쥐를 주입 (예., E14.5) 단계 3.1.3에서에서 설명한 대로.</li>
		<li>24 시간 후 240 μ g/몸 무게 (g)에서 avertin의 복 주사 하 여 쥐를 anesthetize. 생쥐는 완전히 마 취 확인 하 발 핀치에 응답을 확인 합니다.</li>
		<li>스프레이 75% 에탄올과 가슴 지역입니다. 심장 관류 (잘라 오른쪽 심 방 및 좌 심 실을 통해 perfuse) 수행 세부19,20 언바운드 나노 입자를 제거 하는 10 분 동안 차가운 0.9% 염 분의 50 mL에에서 앞에서 설명한.</li>
		<li>댐 안락사 태아와 반응과 Graefe 집게가 위, 그리고 Graefe 조직 겸 자, 해 부를 사용 하 여 수집 하 제왕 섹션을 수행 하 고 조직 분석 전에-80 ° C에서 저장 합니다.</li>
		<li>균질 솔루션 (10%과 염소 산)을 준비 하 고 얼음에 계속. 조직의 약 200 mg을 수집 하 고 각 샘플을 균질 솔루션의 500 μ를 추가. 균질 샘플 30 s, 그리고 반복에 대 한 최고 속도 균질 화기를 사용 하 여이 절차를 두 번.</li>
		<li>4 ° c.에 20 분 14000 × g에서 샘플을 원심 HPLC 유리병에 결과 액체를 전송 및 필터 주사기 0.45 μ m 통해 상쾌한 (약 300 μ)을 필터링 합니다. 샘플 튜브를 주입 autosampler 트레이 넣으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
표준의 준비
	<ol>
<li>다음 솔루션 모바일 단계에 대 한 준비: 40 mM 칼륨 인산 염기 (pH 4.5)와 이기 (88:12, v/v). 0.45 μ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 하 고 깨끗 한 HPLC 저수지 병 결과 액체를 전송. 참고: 0.1 M 인산으로 pH를 조정 합니다. 15 분에 대 한 초음파 진동을 사용 하 여 사용 하는 모바일 단계 때마다 이전 드.</li>
		<li>1.5 mL 원심 분리기 관으로 MTX의 10 밀리 그램 무게. 1 M 수산화 나트륨의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>소용돌이 MTX까지 고속에서 완전히 녹 인 다. 참고:이 기본 주식 이며 몇 달 동안-20 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>보조 MTX 주식 (500 μ g/mL)를 만들려면 50 μ 모바일 단계의 950 μ에 기본 주식의 희석. 참고: 사용까지 얼음에 저장 하 고 매일 신선한 준비. 사용 하 여 모바일 단계 표준의 준비에 대 한 샘플 주입 후 서로 다른 솔루션을 혼합의 결과로 봉우리를 피하기 위해 중요 하다.</li>
		<li>(표 1) 표준을 만들고 희석 추가 확인 합니다. 얼음에 기준을 저장 하 고 매일 신선한 준비. 표준 직렬 실험 샘플으로 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>번호</td>
			<td>최종 농도 (μ g/mL)</td>
			<td>500 μ g/mL, μ</td>
			<td>모바일 phase(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>999</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>998</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>980</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
			<td>950</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>50</td>
			<td>100</td>
			<td>900</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>800</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 표준 곡선의 MTX에 대 한 준비. MTX 표준 솔루션의 최종 농도 0.5-100에서 μ g/mL.
<ol start="3"><li>
HPLC 계측 및 작업 매개 변수 참고: 샘플 용 펌프, UV spectrophotometric 검출기를 장착 하는 HPLC 시스템에 분석 되었다 (313 nm), 및 C18 열 (250 × 4.6 m m, 5 μ m 입자 크기).<ol>
<li>시스템에서 공기를 제거 하는 HPLC degasser를 켭니다. 초기 소음을 줄이기 위해 30 분 모바일 단계와 열 평형 흐름을 켭니다.</li>
		<li>열의 온도 25 ° C를 설정 하 고 1 mL/min의 유량에 20 μ 샘플 볼륨을 주입 실행 방법 분석 시작을 클릭 합니다.</li>
		<li>실행 완료 되 면 수동으로 HPLC 급 이기에 모바일 단계를 변경 합니다. 시스템을 보호 하기 위해 약 15 분 동안 실행 합니다. 참고: 권장된 실행 시간을 다음이 단계를 수행 하려면 실패 손상에서 열 될 수 있습니다.</li>
		<li>정량 분석을 위한 HPLC 시스템 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 표준 MTX 봉우리 아래 영역을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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X.F.와 B.Z.는 민 태 반 관련 약물 전달 방법을 포함 하 여 특허 출원 PCT/CN2017/108646 제출 및 그 응용 프로그램에 대 한 발명가. 다른 모든 저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

이 원고에서 우리 plCSA BP-기반 나노 입자 약물의 태 반 배달 대상에 대 한 효율적인 도구 인지 결정 하기 위한 3-방법 시스템 개요. Vivo에서 이미징 적외선 형광 ICG 신호를 모니터링 하는 데 사용 plCSA BP. 사용의 placental 대상 특이성을 확인 HFUS 및 HPLC, 우리 plCSA BP 활용 된 나노 입자 수에 MTX 제공 효율적으로 시연 합니다 태 반 세포, 태아에 게 하지입니다.
Vivo에서 형광 이미징 실험, 임신 쥐의 임신 나 중요 하다. 태 양식 E9.521주위를 시작합니다. 또한, 고려는 영상 해상도는 vivo에서 이미징 실험 수행 되어야 한다 E 10.5 후. 이 프로토콜에 따라 전자 11.5에서 plCSA INP 주입 후 형광 신호는 피부와 내부 장기 신호 전송22방지 되었을 수 있습니다 설명된 조건 ...

사전 eclampsia, 임신 손실, placental 속보 및 작은 임신 연령 (SGA)를 포함 하 여 중재 하는 태 반 임신 합병증은 일반적이 고 실질적인 태아와 산 모 병 적 상태와 사망률1,2,에 3, 그리고 거의 약4,5장애 임신 치료에 효과적인 것으로 입증 되었습니다. 임신 중 더 선택적이 고 안전한 태 반 대상 약물 전달에 대 한 전략의 개발 현대 약물 치료에 도전 남아 있습니다.
최근 몇 년 동안, 여러 보고서 태 타겟팅 도구로 펩 티 드 또는 항 체 나노 입자 코팅에 의해 uteroplacental 조직에 약물의 타겟된 배달에 집중 했다. 이러한 안티 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)6 항 체, 등 종양 유도 펩 티 드 (CGKRK 및 iRGD)7, 태 반 대상 펩 티 드8, placental 맥 관 구조 대상 펩 티 드9 에 대 한 항 체는 옥 시 토 신 수용 체10.
여기, 합성 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP) 태11나노 입자와 그들의 마약 페이로드의 대상된 배달에 사용할 수 있습니다 설명 합니다. PlCSA BP-기반 나노 입자는 placental trophoblast 대상 때문에 메서드를 대상으로 보고 uteroplacental를 보완.
비-침략 적 방법으로 이미징 vivo에서 쥐12, 태 반 관련 유전자 발현을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다 그리고 indocyanine 그린 (ICG) 나노 입자 형광 이미징 시스템13를 사용 하 여 추적을 널리 이용 되는 , 1415. 따라서, 우리는 plCSA BP 활용 된 나노 로드 ICG (plCSA-INPs) 형광 이미징 임신 쥐에 plCSA INP 분포를 시각화 하 정 맥 주입. 우리는 다음 정 맥 methotrexate (MTX) 주사-임신 쥐에 plCSA-NPs를 로드. 높은 주파수 초음파 (HFUS), 다른 비-침략 적, 실시간 이미징 도구16,17 쥐에 태아 및 태 반 개발을 모니터링 하는 데 사용 되었다. 마지막으로, 우리 반응과 태아에 MTX 분포를 정량화 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 사용.
이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 plCSA 혈압 유도 nanocarriers 태 대상 약물 전달의 효율성을 평가 하는 데 사용 하는 3 방법 시스템.

<table><tbody><tr><td>CD-1 마우스</td><td>베이징 바이탈 리버</td><td>201</td><td>여성 (8-12 주)</td></tr> <tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>IV 주입</td>용 BD <td>328421</td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>Sinopharm</td><td>나노 입자 합성을위한</td>화학 <td>10009218</td></tr><tr><td>대두 레시틴</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>나노 입자 합성 용</td><td>441601</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>나노 입자 합성을위한</td> <td>880125</td></tr><tr><td>PLGA</td> 나<td>노 입자 합성을위한</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>719897</td></tr><tr><td>초음파 프로세서</td><td>나</td><td>노 입자 합성 용</td><td>Sonics VCX130</td></tr><tr><td>메토 트렉세이트 (MTX)</td> 나<td>노 입자 합성 용</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>V900324</td></tr><tr><td>인도 시아닌 그린 (ICG)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>1340009</td><td>생체 내 이미징</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 스펙트럼 기기</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>생체 내 이미징</td></tr><tr><td>초음파 투과 젤</td><td>Guanggong</td><td>ZC4252418</td><td>초음파 이미징</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Lunan 제약</td><td>I0040</td><td>마취</td></tr><tr><td>유지 제모 크림</td><td>Nair</td><td>털 제거용</td> <td>TMG001</td></tr><tr><td>40MHz 변환기</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td>초음파 이미징</td></tr><tr><td>용 MS550S 고주파 초음파 이미징 시스템</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo2100</td><td>초음파 이미징</td></tr><tr><td>용 Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>마취</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Mindray</td><td>SK-500III</td><td>forcardiac 관류</td></tr><tr><td>0.9% 식염수</td><td>Meilunbio</td><td>MA0083</td><td>forcardiac 관류</td></tr><tr><td>1.5 mL 폴리프로필렌 튜브</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C 냉동고</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88600V</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Cence</td><td>H1650R</td><td></td></tr><tr><td>과염소산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td>단백질 침전용</td></tr><tr><td>균질화기</td><td>SCIENTZ</td><td>SCIENTZ-48</td><td>조직 균질화용</td></tr><tr><td>주사기 필터(0.45 &mu; m)</td> <td>Millipore</td><td>SLHV033RS01</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>Sinopharm MTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC 바이알</td><td>해결을</td> 위한 화학 10019763 <td></td><td>Waters 670650620 HPLC</td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>Sinopharm</td><td>HPLC</td><td></td></tr> 아<tr><td>세토니트릴</td><td>JK화학</td> 20032117 <td>932537</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>C18 컬럼</td><td>Waters 용 화학</td><td></td><td>HPLC HPLC</td></tr><tr><td>시스템</td><td>Shimadzu</td><td>HPLC의</td> 경우 186003966 <td></td></tr></tbody></table>

3 보완 방법을 사용 하 여 태 반 대상 약물 전달의 안전과 효율성의 종합 평가

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

더 효과적인 치료 태 반 관련 임신 합병증에 대 한 현재 존재 하 고 도전 남아 태아와 모성의 부작용을 최소화 하면서 태 반에 약물의 타겟된 배달에 대 한 전략을 개발. 타겟된 나노 캐리어 placental 질환을 치료 하는 새로운 기회를 제공 합니다. 우리는 최근에 합성 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP) 태 반에 약물을 전달 하기 위해 나노 가이드 사용 될 수 보여 주었다. 이 프로토콜에서 설명 자세히 plCSA-혈압 사용 세 별도 메서드를 사용 하 여 태 반에 약물 전달의 효율성을 평가 하기 위한 시스템: vivo에서 이미징, 높은-주파수 초음파 (HFUS), 및 높은 성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC)입니다. Vivo에서 를 사용 하 여 이미징, plCSA BP-기반 나노 했다 시각에 살아있는 동물의 반응과 HFUS 및 HPLC는 plCSA BP 활용 된 나노 효율적이 고 구체적으로 전달 토트 태 반에 시연 하는 동안. 따라서, 이러한 방법의 조합은 태 반에 약물의 타겟된 배달 및 여러 가지 임신 합병증에 대 한 새로운 치료 전략의 개발을 위한 효과적인 도구로 사용할 수 있습니다.

이 원고, plCSA BP 활용 된 나노 로드 MTX (plCSA-MNPs) 또는 ICG (plCSA-INPs) 했다 임신 쥐에 정 맥 주입 됩니다. Vivo에서 영상 plCSA INP 주입 후 자 궁 30 분의 지역에서 강한 ICG 신호를 밝혔다. INPs 했다 주로 간, 비장 지역 (그림 1A) 지역화 됩니다. PlCSA-INP 주사 후 48 h, 임신 쥐 ICG 신호 없는 신호와 태 반에만 태아 (그림 1B)에 감지 했다 드러내는 희생 했다.
우리는 나노 입자의 정 맥 주입 후 배아 개발 모니터링 데 HFUS를 사용 됩니다. 생체 인식 측정 포함 임신 성 골목 길이 (GS), 태아 크라운 둔 부 길이 (CRL), biparietal 직경...

우리는 안전 및 태 반 대상 약물 전달의 효과 평가 하기 위해 세 가지 방법을 사용 하는 시스템을 설명: vivo에서 이미징 나노 축적, 태 반 및 태아 개발을 모니터링 하 고 주파수 초음파를 모니터링 하 그리고 조직에 약물 전달 척도를 HPLC.

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

이 방법은 모체와 태아에게 전달되는 나노 입자에 적재된 약물의 효과와 안전성에 대한 나노 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 태반에 전달되는 약물의 양을 정확하게 생화학적으로 측정할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 태반에 대한 약물 전달의 정확한 표적을 보장하는 것이 중요하기 때문에 태반 매개 임신 합병증 치료로 확장됩니다.배아 발달에 대한 고주파 초음파 평가는 숙달하기 위해 인내심과 경험이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 나노입자 정맥 주사의 경우, 꼬리 정맥이 열팽창된 Embryonic Day 14.5 임신 마우스를 구속기로 옮기고 알코올 면봉으로 꼬리를 청소합니다. 그런 다음 28게이지 인슐린 주사기의 바늘 끝을 확장된 꼬리 정맥에 삽입하고 나노 입자를 꼬리 정맥으로 전달하기 위해 균일한 압력으로 플런저를 5-10초 동안 천천히 누릅니다.주사 30분 후, 마취된 임산부 마우스를 누운 자세로 생체 내 형광 이미징 시스템의 이미징 챔버에 놓습니다. 인도시아닌 녹색 형광 신호를 이미징하기 위한 2D 형광 및 적절한 사진 매개변수를 선택하고 자동 노출과 여기 및 방출 파장을 각각 710 및 820 나노미터로 설정합니다. 그런 다음 동물을 이미지화하고 임신한 쥐를 우리로 되돌립니다.주사 후 48시간 후에 Graefe 겸자, Graefe 조직 겸자 및 해부 가위를 사용하여 태아와 태반을 수집하고 수확된 조직을 전체 동물에 대해 방금 설명한 것처럼 이미지화합니다. 배아 발달에 대한 고주파 초음파 평가를 위해 나노 입자 주입 후 24시간 후에 마취된 임산부 댐을 섭씨 37-42도의 예열 초음파 이미징 플랫폼에 누운 자세로 고정하고 40메가헤르츠 변환기를 기계 암에 놓습니다. 그런 다음 변환기 위치를 조정하여 초점 영역 내의 관심 영역과 함께 태아와 태반의 세로 이미지를 얻습니다.B-모드 이미징 및 분석을 위해 B-모드를 선택하고 태아와 태반이 보일 때까지 트랜스듀서를 복부 위로 내립니다. Scan/Freeze를 클릭하여 이미징을 시작 및 중지하고, Cine Store를 클릭하여 시네 루프를 저장하고, Frame Store를 클릭하여 프레임 이미지를 저장합니다. 그런 다음 측정을 클릭하여 재태낭 길이, 태아 크라운 엉덩이 길이, 양두정 직경, 복부 둘레, 태반 직경 및 태반 두께를 분석합니다.맥파 도플러 이미징 및 분석을 위해 동일한 스캔 프로젝션을 사용하여 먼저 Color를 클릭한 다음 Pulse Wave를 선택하고 샘플링 볼륨 상자를 제대 동맥 중앙에 배치합니다. Scan/Freeze를 클릭하여 이미징을 시작하고 Cine Store를 클릭하여 제대 동맥 이미지를 수집합니다. 그런 다음 Measure(측정)를 클릭하여 제대 동맥 최고 속도를 계산합니다.컬러 도플러 모드 이미징 및 분석의 경우 동일한 스캔 프로젝션을 사용하여 색상을 클릭하고 변환기 위치를 조정하여 시연된 대로 태아 심장 이미지를 얻습니다. 그런 다음 측정을 클릭하여 저장된 cine image loop의 태아 심박수를 계산합니다. 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 위해 먼저 Embryonic Day 14.5 임신한 마우스에 시연된 바와 같이 1회 용량의 나노 입자를 주입합니다.24시간 후, 임신한 동물의 심장에 얼음처럼 차가운 0.9%식염수 50ml를 10분 동안 관류하여 결합되지 않은 나노 입자를 제거하고 태아와 태반을 채취하여 영하 80도의 보관을 합니다. 분석 당일, 각 200밀리그램 조직 샘플에 새로 준비된 균질화 용액 500마이크로리터를 추가하고 해리당 30초 동안 최고 속도로 샘플을 두 번 균질화합니다. 두 번째 균질화 후 샘플을 원심분리하고 0.45마이크로미터 주사기 필터를 통해 상등액을 HPLC 바이알로 여과합니다.주입을 위해 샘플 바이알을 자동 시료 주입기 트레이에 넣고 HPLC 탈기 장치를 켜서 시스템에서 공기를 제거합니다. 다음으로, 기준선 노이즈를 줄이기 위해 30분 동안 흐름을 켜서 컬럼을 이동상과 평형을 이루고 컬럼의 온도를 섭씨 25도로 설정합니다. 그런 다음 30분 이내에 분당 1밀리리터의 유속으로 20마이크로리터 시료를 주입하고 Run Method를 클릭하여 분석을 시작합니다.실행이 완료되면 수동으로 이동상을 HPLC 등급 아세토니트릴로 변경하고 약 15분 동안 아세토니트릴을 실행하여 시스템을 보호합니다. 생체 내 이미징은 태반 콘드로이틴 설페이트 결합 형광 접합 나노 입자 주입 후 30 분 후 자궁 조직에서 강력한 인도 시아닌 녹색 신호를 보여주는 반면, 결합되지 않은 나노 입자는 주로 간과 비장 영역에 국한됩니다. 주입 후 48시간이 지나면 태반 콘드로이틴 황산염 결합 나노입자 주입 동물의 태반에서 형광 신호가 관찰되며 태아 내에서는 신호가 감지되지 않습니다.태반 콘드로이틴 황산염 결합 형광 접합 나노입자 주입 동물의 고주파 초음파 모니터링은 주요 태아 및 태반 발달 지표의 현저한 감소를 보여줍니다. 흥미롭게도, 메토트렉세이트 결합 나노입자를 사용한 처리는 태아 및 태반 발달을 약간 손상시키는데, 이는 나노입자가 향상된 투과성 및 보유 효과를 통해 태반으로의 메토트렉세이트 전달을 개선할 수 있음을 나타냅니다. HPLC에 의한 메토트렉세이트 농도 측정은 메토트렉세이트에 결합된 나노입자 주입 마우스의 태반 내 머무름 시간이 7분임을 나타냅니다.주사 후 24시간이 지난 후, 메토트렉세이트 결합 나노입자 주입 그룹의 태반 메토트렉세이트 수치는 태반 콘드로이틴 황산염 및 메토트렉세이트 결합 나노입자 그룹에서 측정된 수치보다 현저히 낮았으며, 후자의 태아에서는 메토트렉세이트가 검출되지 않았습니다. 메토트렉세이트는 태반 콘드로이틴 설페이트와 메토트렉세이트 결합 나노입자 주입 후 48시간 후에도 태반에서 여전히 검출될 수 있으며, 이는 태반 콘드로이틴 황산염 및 메토트렉세이트 결합 나노입자가 태반을 통과할 수 없음을 입증하여 태아에 대한 잠재적인 부작용을 최소화합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 태반은 배아 9 1/2일쯤에 형성되기 시작한다는 것을 기억하는 것이 중요하며, 따라서 생체 내 이미징 실험은 배아 10 1/2일 또는 그 이후에 수행하는 것이 더 좋습니다.이 절차에 따라 면역형광 염색 및 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 태반 내 나노 입자의 국소화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생식 의학 분야의 연구자가 임신 합병증에서 태반 표적 치료의 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

트윈 - 투 - 쌍둥이 수혈 증후군과 트윈 빈혈 polycythemia 시퀀스는 perinatal 의학의 두 잠재적으로 치명적인 문제가 있습니다. 두 질환은 monochorionic 쌍둥이와 placental 혈관 anastomoses을 통해 불균형 혈액의 흐름에서 결과 발생합니다. 우리는 정확하게 출산 후 placental 혈관의 색깔 염료의 주입을 사용하여 혈관 anastomoses의 존재를 평가하는 간단한 프로토콜을 제공합니다.

유색 염료를 사용하여 Monochorionic 태반의 혈관 Anastomoses의 정확하고 간단한 평가

태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

우리는 장기간 생체 내 생체 태반 생리를 연구하기위한 상세한 방법을 제시합니다. 이 방법은 태아의 모체 및 태아 측에 유입 및 유출 혈관으로부터의 혈액 샘플링을 부피 혈류 및 태반 조직 샘플링의 초음파 측정치와 결합시킨다.

인간 태반 생리학의 통합 연구에 대한 4 혈관 샘플링 접근법<em&gt; In Vivo</em

이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

여기, 선물이 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP)의 합성에 대 한 프로토콜-지질 고분자 나노 입자를 통해 단일 단계 쥡니다 bioconjugate 기법을 활용. 이 입자는 가장 인간의 종양 및 암 및 태 반 장애 치료에 태 반 trophoblasts 치료제의 대상된 배달에 대 한 새로운 도구를 구성 합니다.

합성 및 Placental 콘의 황산 (plCSA)-지질 타겟팅-고분자 나노 입자

여기, 우리는 분리 하 고에서 자연 킬러 세포의 세포 독성 기능을 평가 하는 상세한 방법론을 제공 합니다. 비 색 판 분석에 의해. 태 반 허 혈의 감소 된 자 궁 관류 압력 쥐 모형은 천연 킬러 세포의 세포 독성 기능의 항 체 매개 분리 및 평가를 입증 하기 위해 선택 되었다.

랫 트 태 반 천연 킬러 세포 세포 용 분해 기능의 평가를 위한 플레이트 기반 세포 독성 분석

여기에 전 생체 모성 태아 혈관 관류의 프로토콜이 제시 되어 모계의 혈관 조직으로 시험 물품의 투여를 가능 하 게 하 고, xenobiotic 입자 또는 약리학 적 제제의 변경 이외에의 태 반 전달을 평가할 수 있도록 태 반 생리학.

설치류 태 반의 전 생체 관류

여기에서는 생체 내에서 마우스 태반의 중요한 발달 경로를 효과적으로 조작하는 시간별 방법을 설명합니다. 이것은 배아 12.5일째에 임신한 댐의 태반에 CRISPR 플라스미드를 주입하고 전기천공하여 수행됩니다.

Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

저산소 조건(자간전증의 한 측면 모델링)에서 배양된 태반 외식에서 분리된 소형 EV(sEV)가 임신하지 않은 성인 암컷 마우스의 혈액-뇌 장벽을 파괴하는지 여부를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

저산소성 인간 태반의 작은 세포외 소포에 의한 생쥐 혈액-뇌 장벽의 파괴

생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

학습하세요 태반 표적 약물 전달의 안전성과 효율성을 평가하는 방법을 생체 내 영상, 고주파 초음파, HPLC를 활용하여. 이 기술은 임신 합병증 치료 연구에 활용됩니다.

3 보완 방법을 사용 하 여 태 반 대상 약물 전달의 안전과 효율성의 종합 평가

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