Name: 진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 TRIP 방법을 통해 진핵세포에서 mRNA-단백질 복합물을 격리하고 면역블롯으로 결합 단백질을 검출하는 기술입니다. 유전자 발현 조절 및 전사 후 조절 메커니즘 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 박사 조나단 홀과 마우로 치머만 (ETH 취리히) PFK2 와 cep 1 ASOs, p27/CDKN1B ASOs, 및 박사 라팔 Ciosk (프리드리히 Miescher 연구소 생물 의학 연구의 디자인에 대 한 박사 Maikel Wouters의 합성에 대 한 감사 바젤) 안티-GLD-1 항 체에 대 한. 이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BB/K009303/1)와 왕 사회 울프 연구 공로 수상 (WM170036) A.P.G.에 의해 지원 되었다

1. 디자인 센스 Oligonucleotides (ASOs)
<ol><li>mRNA 또는 단편38사용 가능한 온라인 도구 사용 하 여 그의 이차 구조를 분석 합니다. 따라서, 빈 상자에 뉴클레오티드 (nt) 시퀀스를 입력 합니다. 기본 옵션 상자에서 격리 된 기본적인 쌍을 방지및 최소 자유 에너지 (MFE) 및 파티션 함수를 선택 합니다. 출력 옵션 상자에서 대화형 RNA 이차 구조 플롯 을 선택 하 고 마지막 진행 버튼을 클릭 합니다. 새 창 관심의 mRNA의 이차 구조를 표시 하는 팝업이 됩니다.</li>
	<li>적어도 3 개의 다른 탐지 보조 구조 부족 한 지역에 우선적으로 관심의 mRNA 내 21-24 국세청 긴 시퀀스를 선택 (예., 구조화 되지 않은 루프에서) 및에서 3' 되지 않은 지역 (UTR). 참고: 그것은 ASOs 3' 되지 않은 지역 (UTR) 시퀀스에 어 닐 링 최고의 수행 관찰 되었습니다. 1 개의 가능성은 리보솜 코딩 시퀀스 (CD)에 바인딩된 ASOs의 어 닐 링 방해 때때로 수 있습니다. 5 ' Utr는 어 닐 링 ASOs 테스트 하지 했다.<ol>
<li>50 %guanidine / 시 토 신 비율 영역을 선택 하 고 헤어핀 또는 어 닐 링 자체의 잠재적인 형성을 피하기 위해 반복 뉴클레오티드 협동 부족.</li>
	</ol>
</li>
	<li>디자인 2'-methoxy RNA oligonucleotides biotin moiety는 3', 선택된 영역 (1.2 단계) 원하는 내에 완벽 하 게 보완에 베어링을 수정 하는 수동으로 mRNA를 대상. 참고: 2'-methoxy 수정 RNA 저항 세포 RNases를 렌더링 하 고 녹는 온도에 엄격한 수 있는 이중을 증가 한다. Biotin moiety는 streptavidin과 ASOs를 캡처 필요 합니다.<ol>
<li>~ 60-65에 RNA 하이브리드의 용융 온도 조정 ° C 높은 언어 시퀀스 복잡 다는 것을 확인 하 고 (> 60%)으로 적합 한 온라인 도구39결정.</li>
		<li>40 기본 로컬 정렬 검색 도구 사용 하 여 잠재적인 아소 크로스-교 잡에는 transcriptome 다른 mRNAs와에 대 한 검색. 뉴클레오티드 폭발, 빈 상자에 시퀀스를 삽입 선택 하 고 관심의 유기 체. 기본으로 나머지 매개 변수를 유지 하 고 폭발을 클릭 합니다. 참고: 8-10 국세청의도 부분 연속 맞춤 간 교 잡 및이 mRNA의 복구를 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 문화, UV 방사선 및 세포 세포 세포의 용 해
참고: 다음 절차는 설명 신진 효 모 S. cerevisiae, C. 선 충, 선 충 및 인간 미 발달 신장 세포 (HEK293). 그것은 명시적으로 아직 테스트 하지 않지만 그럼에도 불구 하 고, 뿐만 아니라, 다른 유기 체에 적용할 수 있습니다.
<ol><li>S. cerevisiae
	<ol>
<li>효 모 세포를 성장 (예., BY4743 미분; 변형 MATa/α his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0 PFK2:TAP / PFK2) YPD 미디어의 500 ml에서 (1% 효 모 추출 물, 2% 펩, 2 %D-포도 당) 220 rpm에서 일정 한 동요와 30 ° C에서.</li>
		<li>중간 로그 단계에서 세포를 수집 (600 nm (OD)600 에서 광학 밀도 ~ 0.6) 0.45 μ m 나일론 필터를 사용 하 여 여과 또는 실 온 (RT)에서 2 분 동안 3000 × g에서 원심 분리. 삭제 흐름 통해 또는 상쾌한, 각각.</li>
		<li>셀 세 번 25 mL의 인산 염-버퍼링-염 분 (PBS) 0.45 μ m 나일론 필터를 사용 하 여 세척 또는 RT에서 2 분 동안 3000 × g에서 원심 분리 하 여 수집 하 고는 상쾌한 삭제. 최대한 빨리 부과 스트레스 RNA-단백질 상호 작용에 영향을 미칠 수로 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>25 ml PBS의 셀 resuspend 하 고 정지는 15 cm 배양 접시에에서 붓는 다. 얼음에 접시를 놓고, 뚜껑을 제거 하 고 셀 세 번 400 mJ cm-2 부드러운 혼합과 각 노출 주기 사이 얼음에 2 분 휴식 UV crosslinker에서 254 nm 자외선의 노출.</li>
		<li>50 mL 튜브에 세포를 전송 및 4 ° c.에 3 분 동안 3000 × g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 삭제는 상쾌한 고 펠 릿을 유지. 참고: 셀 스냅 액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장 된 수 합니다.</li>
		<li>냉장된 세포의 용 해 버퍼 A의 4 mL에 셀 resuspend (파운드-A; 100 mM Tris HCl, pH 7.5, 500mm LiCl, 10 mM EDTA, 1% 트라이 톤 X-100, 5mm DTT, 20 U ml-1 DNase I, 100 U ml-1 RNasin, EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일을 완료).</li>
		<li>2 2 mL 튜브에 세포를 전송 합니다. 최대 추가 합니다. ⅔의 유리 구슬 냉장 볼륨과 4 ° c.에서 10 분 동안 30 Hz에서 조직 lyser의 세포를 중단</li>
		<li>뜨거운 바늘으로 튜브의 하단에 구멍을 펀치와 30에 대 한 600 × g에서 원심 분리 하 여 신선한 1.5 mL 튜브에는 lysate 전송 s.</li>
		<li>3 분 동안 3000 × g에서 4 ° C에서 3 개의 순차 centrifugations에 의해 lysate 5000 × g 그리고 10000 × g 5 분에 대 한 선택을 취소 합니다. 참고: 추출 스냅인-액체 질소에서 냉동 고 수-80 ° c.에 저장</li>
	</ol></li>
	<li>C. 선 충
	<ol>
<li>선 충 류 성장 매체 (NGM) 접시 (0.3 %NaCl, 1.7 %agar, 0.25% 펩, 1mm CaCl2, 5 µ g/mL 콜레스테롤, 1mm MgSO4, 25 mM KPO4 버퍼, pH 6.0) OP50 대장균 긴장 시드에 20 ° C에서 문화 브리스톨 N2 웜 41 .
</li>
		<li>각 접시에 M9 버퍼41 (0.3% KH2포4, 0.6% 나2HPO4, 0.5 %NaCl, 1 mM MgSO4)의 5 mL을 추가, resuspend 벌레를 15 mL 튜브에 벌레를 전송 접시를 동요 한다. 슬라이드에는 서 스 펜 션의 2 µ L를 놓고 정지에서 벌레는 현미경으로 계산 합니다. 다음 접시 당 벌레의 수를 계산 하려면 요소를 적용 합니다.</li>
		<li>수집 ~ 120000 웜 (400 × g, 2 분, RT) 상 온에서 원심 분리 하 여 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>벌레 세 번 씻어. 따라서, M9 버퍼의 10 mL을 추가, 반전에 의해 혼합 및 실시간에 2 분 동안 400 × g에서 원심 분리 하 여 벌레를 수집</li>
		<li>벌레를 M9 버퍼의 15 mL를 추가 하 고 실시간에 15 분 동안 회전 바퀴에</li>
		<li>NGM 접시 (접시 당 4000 ~ 웜)에 벌레를 전송 및 UV 빛에 노출 (254 nm) UV-crosslinker에서 300 엠 제이 cm-2 에서.</li>
		<li>접시에 직접 M9 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 버퍼에 벌레를 resuspend에 접시를 흔들어. 15 mL 튜브에는 피 펫과 서 스 펜 션을 전송 하 고 실시간에 2 분 동안 400 × g에서 원심 분리 하 여 벌레를 수집</li>
		<li>세포의 용 해 버퍼 B의 2 mL에 벌레를 resuspend (파운드-B; 100 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 m m NaCl, 1 mM EDTA, 0.75 %IGEPAL, 1mm DTT, 20 U mL-1 DNase I, 100 U mL-1 RNasin, EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일을 완료).</li>
		<li>액체 질소로 채워진 박격포에 벌레 갈아. 실시간에 녹여 50 mL 튜브에 분말을 수집 참고: 액체 질소 안전 절차 (예: 연기 후드와 안전 장갑)에 따라 처리 합니다.</li>
		<li>Lysate 10 분 14000 × g에서 원심 분리 하 여 지방 층 포함 한 하 고 이후에 명확히 전달 0.45 μ m 필터 주사기를 통해 lysate.</li>
	</ol></li>
	<li>사람 배양된 세포 참고: 다음 설명 기반 과도 transfection HEK293 세포 pGL3-CDKN1B-3 ' UTR 기자 플라스 미드 CDKN1B/27의 하류 반딧불 luciferase 유전자42의 3′UTR 표현 하.<ol>
<li>문화 HEK293 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 포도 당 25 m m 및 1 m m 나트륨 pyruvate, 포함 된 100 mL-1 페니실린, 100 µ g mL-1 스과 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 보충 하 고 37 ° c에서 품 어는 습도 챔버 (인큐베이터) 포함 된 5% CO2.</li>
		<li>표준 10cm 조직 문화에 씨 ~ 3 × 106 HEK293 세포 transfection는 전날 접시. hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>취재 원 유전자의 믹스 2 µ g (예., pGL3-p27-3'UTR) transfection 시 약의 20 µ L와 70 %confluency (~ 7 × 106 셀)에 셀 transfect 고.</li>
		<li>수확 하기 전에 셀 추가 48 h에 대 한 37 ° C에는 인큐베이터에 배치 합니다.</li>
		<li>혈 청 학적인 피 펫과 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 PBS의 10 mL로 두 번 셀을 신속 하 게 세척 혈 청 학적인 피 펫으로 PBS를 제거 합니다.</li>
		<li>접시에 6 mL PBS의 추가 얼음에 놓고 다음 셀 UV 빛에 노출 (254 nm) UV crosslinker에 100 mJ cm-2 에서. 참고: 접시 유지 되어야 한다 얼음에-자외선 노출 시.</li>
		<li>셀 (총 10 ~7 셀) PBS에 15 mL 튜브에 떨어져 다쳤어요.</li>
		<li>4 ° C에서 10 분 동안 250 × g에서 셀 아래로 회전 시키십시오 하 고는 피 펫과 상쾌한 제거. 참고: 셀 펠 릿 스냅-액체 질소에서 냉동 고 사용까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>미리 냉장된 세포의 용 해 버퍼의 2 mL에 셀 resuspend (파운드-A)에 대 한 아래로 pipetting으로 5-6 번, 얼음에 튜브를 유지 하면서.</li>
		<li>얼음에 5 mL 튜브에는 피 펫과 lysate 전송.</li>
		<li>제목 lysate 쥡니다 30와 10 μ m 진폭에서 20 s 파열의 구성의 3 라운드를 얼음에 기간 냉각의 s. 참고: 쥡니다 세포와 파편 DNA의 세포의 용 해 완료로 좋습니다.</li>
		<li>2 mL 튜브 및 4 ° c.에서 10 분 동안 15000 × g에서 원심 분리기는 lysate 전송 (= 추출) 상쾌한 수집 및 새로운 튜브에 전송. 추가 단백질 및 RNA 분석을 위한 분석 샘플 (5-10%)를 제거 합니다. 참고:이 단계는 모든 나머지 세포 파편을 제거 하는 중요 하 고 반복 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 첫 번째 단계: 많은 RNA 격리
<ol><li>Oligo(dT)25의 1 mg equilibrate-결합 각 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L에 자석 구슬.</li>
	<li>결합 5 mg, 10 mg 또는 4 mg (단백질) S. cerevisiae, C. 선 충 또는 HEK293 추출, 각각, oligo(dT)25 의 1 밀리 그램-자석 구슬 결합. 믹서에 25 ° C에서 10 분 동안 적극적으로 샘플을 믹스. 참고: 추출의 단백질 농도 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 참조 표준으로 Bradford 분석 실험으로 확인할 수 있습니다. 샘플의 활기찬 동요 구슬의 침전을 방지 합니다. MRNA 격리의 특이성을 평가 하기 위해 제어 실험 polyadenylic 산 (pA)의 초과 (20 µ g)를 추가 하 여 병렬로 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>10 s를 제거 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한. 복구 (단계 3.7)의 다음 라운드에 대 한 얼음에 상쾌한을 유지.</li>
	<li>세척의 500 µ L A 버퍼 추가 (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 600mm LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% 트라이 톤 X-100) 구슬과 5 소용돌이에 s. 참고: 워시 버퍼에 LiCl의 농도가 달라질 수 있습니다. 600 mM LiCl 좋지만 낮은 농도 (500 m m C. 선 충, HEK293 300 m m) 테스트도 했다.</li>
	<li>자석으로 비즈를 수집 하 고 구슬 (WB, 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 600mm LiCl, 1 mM EDTA)는 워시 버퍼 B의 500 µ L로 두 번 세척.</li>
	<li>믹서에 10 mm Tris HCl, pH 7.5 연속 떨고 (1000 rpm)으로 2 분 동안 80 ° C에서 30 µ L에서 RNA을 elute. 즉시 튜브 마그네틱 스탠드에 놓고 10 후는 eluate 수집 미 저장 정화의 추가 라운드 구슬. 참고: 낮은 온도에서 구슬에 mRNAs의 잠재적인 다시 바인딩 방지 하기 위해 가능한 한 빨리는 eluate를 수집 합니다.</li>
	<li>3.3 단계에서 수집 된 상쾌한에 구슬 이전 단계에서 추가 하 고 반복 캡처, 세척 및 차입 mRNAs의 두 번 (단계 3.3-3.6). 반복된 라운드에서 있다 다음 결합 하 고-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
</ol>4. 두 번째 단계: 3'-Biotinylated' 2-Methoxy 수정 센스 RNA Oligonucleotides와 특정의 캡처 mRNAs
참고: ASOs의 적합성을 테스트 하기 위해 다음 절차는 총 RNAs 셀에서 격리를 수행할 수 있습니다.
<ol><li>30 µ L 바인딩의 1 mL에 자석 구슬 streptavidin 결합의 equilibrate와 버퍼 (B & W 버퍼, 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 m EDTA, pH 8.0)을 씻어 1 시간에 대 한 회전에 0.1 mg mL-1대장균 이동 RNA (tRNA)을 포함 하 실시간<ol>
<li>구슬 B & W 버퍼의 750 µ L로 세 번 세척.</li>
		<li>B & W 버퍼의 30 µ L에 구슬 resuspend 그리고 사용까지 얼음에 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이전 많은 격리에서 총 단백질의 ~ 35 µ g을 희석 (참조 3) 1.5 mL 튜브에 B & W 버퍼의 100 µ L에서. 참고: 총 RNA와 ASOs의 특이성을 테스트 하려면 추가 600 B & W 버퍼의 100 µ L 정제 총 RNA의 ng.</li>
	<li>각각 아소의 200 pmol 추가 하 고 5 분 동안 70 ° C에서 품 어. 참고: 높은 온도 아소의 어 닐 링을 촉진 하는 RNA 이차 구조를 해결 합니다.</li>
	<li>장치에서 전체 열-블록을 제거 하 고 천천히 진정 10 분에 대 한 실시간에 그것을 배치.</li>
	<li>4.1 단계에서 샘플 equilibrated streptavidin 결합 자석 구슬의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>믹서에 950 rpm에서 일정 한 동요와 25 ° C에서 30 분 동안 혼합물을 품 어. 참고:이 좋습니다 구슬의 침전을 방지 하기 위해 튜브 마다 10 분 영화를.</li>
	<li>튜브에 마그네틱 스탠드, 제거는 상쾌한 놓고 55 ° c.에 세 번으로 미리 데워 B & W 버퍼의 750 µ L 구슬 세척 참고: 최적의 세척 온도 달라질 수 있습니다 약간 다르다/다른 ASOs 사이. 비 가교 된 총 RNA 사전 셀 추출 물으로 실험을 수행으로이 상태를 조정 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>10 mm Tris HCl, pH 7.5 믹서. 에 950 rpm에서 일정 한 동요와 10 분 동안 90 ° C에서 20 µ L에서 RNA elute 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 eluate 즉시 수집 합니다. 참고: 단백질 분석용 구슬에 1 × Laemmli 버퍼의 20 µ L을 추가 하 고 5 분 단백질은 immunoblot 분석 표준 실험실 프로토콜을 다음에서 모니터링에 대 한 95 ° C에서 품 어.</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li>
<li>Iadevaia, V., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Control+of+mRNA+Fates+by+RNA-Binding+Proteins+and+Non-Coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Control of mRNA Fates by RNA-Binding Proteins and Non-Coding RNAs.</a> Biomolecules. 5 (4), 2207-2222 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biology. 15 (1), 203(2014).</li>
<li>Matia-González, A. M., Gerber, A. P. Ch. 14. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatia-Gonz%C3%A1lez%2C+AM+%22Fungal+RNA+Biology%22">Fungal RNA Biology</a>. Sesma, A., von der Haar, T. , Springer. 347-370 (2014).</li>
<li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+identification+of+RNA-binding+proteins+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture.</a> Nature Protocols. 8 (3), 491-500 (2013).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cardiomyocyte+RNA-Binding+Proteome%3A+Links+to+Intermediary+Metabolism+and+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Cardiomyocyte RNA-Binding Proteome: Links to Intermediary Metabolism and Heart Disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+Proteins+in+Macrophages+by+Interactome+Capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding Proteins in Macrophages by Interactome Capture.</a> Molecular Cell Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212(2016).</li>
<li>Matia-Gonzalez, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23222640">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127(2015).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Planta+Determination+of+the+mRNA-Binding+Proteome+of+Arabidopsis+Etiolated+Seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Koster, T., Marondedze, C., Meyer, K., Staiger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Binding+Proteins+Revisited+-+The+Emerging+Arabidopsis+mRNA+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-Binding Proteins Revisited - The Emerging Arabidopsis mRNA Interactome.</a> Trends Plant Sciences. 22 (6), 512-526 (2017).</li>
<li>Hamasaki, K., Killian, J., Cho, J., Rando, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+RNA+constructs+that+specifically+bind+aminoglycoside+antibiotics+with+high+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimal RNA constructs that specifically bind aminoglycoside antibiotics with high affinities.</a> Biochemistry. 37 (2), 656-663 (1998).</li>
<li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StreptoTag%3A+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (11), 1509-1516 (1999).</li>
<li>Vazquez-Pianzola, P., Urlaub, H., Rivera-Pomar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+reaper+5%27+untranslated+region-interacting+factors+isolated+by+tobramycin+affinity-selection+reveals+a+role+for+La+antigen+in+reaper+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of reaper 5' untranslated region-interacting factors isolated by tobramycin affinity-selection reveals a role for La antigen in reaper mRNA translation.</a> Proteomics. 5 (6), 1645-1655 (2005).</li>
<li>Hartmuth, K., Vornlocher, H. P., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14769995">Tobramycin affinity tag purification of spliceosomes.</a> Methods Molecular Biology. 257, 47-64 (2004).</li>
<li>Beach, D. L., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribotrap+%3A+targeted+purification+of+RNA-specific+RNPs+from+cell+lysates+through+immunoaffinity+precipitation+to+identify+regulatory+proteins+and+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribotrap : targeted purification of RNA-specific RNPs from cell lysates through immunoaffinity precipitation to identify regulatory proteins and RNAs.</a> Methods Molecular Biology. 419, 69-91 (2008).</li>
<li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16 (11), 2277-2290 (2010).</li>
<li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RaPID%3A+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Molecular Biology. 714, 387-406 (2011).</li>
<li>Yoon, J. H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNA-Interacting+Factors+by+MS2-TRAP+%28MS2-Tagged+RNA+Affinity+Purification%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNA-Interacting Factors by MS2-TRAP (MS2-Tagged RNA Affinity Purification).</a> Methods Molecular Biology. 1421, 15-22 (2016).</li>
<li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42 (2), 13(2014).</li>
<li>Blencowe, B. J., Sproat, B. S., Ryder, U., Barabino, S., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+probing+of+the+human+U4%2FU6+snRNP+with+biotinylated+2%27-OMe+RNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antisense probing of the human U4/U6 snRNP with biotinylated 2'-OMe RNA oligonucleotides.</a> Cell. 59 (3), 531-539 (1989).</li>
<li>Lingner, J., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+telomerase+from+Euplotes+aediculatus%3A+requirement+of+a+primer+3%27+overhang%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purification of telomerase from Euplotes aediculatus: requirement of a primer 3' overhang.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 10712-10717 (1996).</li>
<li>Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+capture+and+identification+of+host+cell+factors+associated+with+hepatitis+C+virus+%28%2B%29+strand+subgenomic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA.</a> Molecular Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).</li>
<li>Imig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-CLIP+capture+of+a+miRNA+targetome+uncovers+a+lincRNA+H19-miR-106a+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">miR-CLIP capture of a miRNA targetome uncovers a lincRNA H19-miR-106a interaction.</a> Nature Chemical Biology. 11 (2), 107-114 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Rogell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+RNP+capture+with+antisense+LNA%2FDNA+mixmers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific RNP capture with antisense LNA/DNA mixmers.</a> RNA. 23 (8), 1290-1302 (2017).</li>
<li>Matia-Gonzalez, A. M., Iadevaia, V., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tandem+RNA+isolation+procedure+to+capture+in+vivo+formed+mRNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile tandem RNA isolation procedure to capture in vivo formed mRNA-protein complexes.</a> Methods. , 93-100 (2017).</li>
<li>Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vienna+RNA+websuite%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Vienna RNA websuite.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), Available from:
 <a target="_blank" href="http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi">http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi</a> W70-W74 (2008).</li>
<li>Kalendar, R., Khassenov, B., Ramankulov, Y., Samuilova, O., Ivanov, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FastPCR%3A+An+in+silico+tool+for+fast+primer+and+probe+design+and+advanced+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">FastPCR: An in silico tool for fast primer and probe design and advanced sequence analysis.</a> Genomics. 109 (3-4), Available from:
 <a target="_blank" href="http://primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html">http://primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html</a> 312-319 (2017).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Kedde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pumilio-induced+RNA+structure+switch+in+p27-3%27+UTR+controls+miR-221+and+miR-222+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3' UTR controls miR-221 and miR-222 accessibility.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 1014-1020 (2010).</li>
<li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li>
<li>Ziegeler, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+lethal+abnormal+vision-like+HuR-dependent+mRNA+stability+regulates+post-transcriptional+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p27Kip1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Embryonic lethal abnormal vision-like HuR-dependent mRNA stability regulates post-transcriptional expression of cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (20), 15408-15419 (2010).</li>
<li>Itri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+UV-laser+pulses+to+unveil+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Femtosecond UV-laser pulses to unveil protein-protein interactions in living cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 637-648 (2016).</li>
<li>Zhang, L., Zhang, K., Prandl, R., Schoffl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+DNA-binding+of+proteins+in+vivo+by+UV-crosslinking+and+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Detecting DNA-binding of proteins in vivo by UV-crosslinking and immunoprecipitation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 322 (3), 705-711 (2004).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여행 특정 mRNAs에 vivo에서 생 화 확 적인 수단에 바인딩된 단백질의 분석을 허용 한다. 우리 다른 생물/세포에서 mRNA 목표와 특정 RBPs의 상호 작용을 확인 하기 위해 메서드를 사용 하는 동안 여행 또한 많은 RNAs, 세포질 긴 ncRNAs 등의 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, MS 또는 RNA 시퀀싱 바인딩된 단백질 RNAs의 체계적인 분석은 업 스케일링 절차의 얻을 수 있습니다. 이와 관련, 우리의 예비 데이터 효 모 문화의 1 L와 인간의 HEK293 세포의 100 백만 이상 잘 표현한 mRNAs에 대 한 신뢰할 수 있는 MS 데이터를 얻기 위해 (되지 않은 결과) 충분 한 시작 물자를 제공할 수 있는 것을 나타냅니다.
254에서 UV 빛을 가진 세포의 방사선 조사를 포함 하는 설명된 여행 프로토콜 nm crosslink RNA-단백질 상호 작용. 정화 하는 동안 엄격한 세척 조건 구현 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 명시적으로 테스트, 가교는 선택 사항이 며 active RNPs 또한 생리 버퍼가 복구할 수 있습니다 주의 하 길. 그러나,이 경우 lysates의 목표가 RNA 단백질 또는 RNAs의 잠재적인 다시 배열 해야 될 고려. 반대로, 만약 UV 또는 다른 가교 절차 적용 (예, 포름알데히드), RNA의 무결성 평가 되어야 한다로 RNA 저하 mRNPs의 저하 회복으로 이어질 수 있습니다. 또한, 자외선 가교 오히려 비효율적인 (~ 5%) 이며 이중 가닥 RNA와 상호 작용 하는 단백질에 대 한 심지어 덜 그렇게 있는 RBPs12의 특정 클래스의 검색에 대 한 바이어스를 소개 수 있습니다. 마지막으로, UV 방사선 또한 데이터 해석45,46에 대 한 간주 되어야 하는 단백질-단백질, 단백질-DNA crosslinks을 유도할 수 있다. 따라서, 포름알데히드, 예를 들어, 대체 가교 절차 또한 mRNAs에 더 큰 단백질 어셈블리를 캡처하는 데 특히 관심의 수 있습니다.
여행의 하나의 주요 기능은 특정 RNAs, 선택도 증가 및 감소 공동 오염 물질을 정화의 확률 아소 기반 정화 절차 2 단계입니다. 예를 들어, 하나의 관심사 biotin-바인딩 단백질의 공동 정화 이어질 수 있는 세포 추출 물에 직접 추가 하는 biotinylated ASOs 관련이 있습니다. 이 여행에서 covalently 결합 된 oligo-(dT)25 자석 구슬를 사용 하 여 많은 RNAs의 엄격한 정화 조건 RNA-단백질 위하여 캡처 할 수 있는 정화의 첫 라운드를 구현 하 여 피할입니다. 또한, 많은 RNA 선택 리보솜 RNAs tRNAs, 등 매우 풍부한 ncRNAs 제거 하 고 따라서 샘플 및 간 교 잡 및 오염에 대 한 잠재적인 출처의 복잡성을 감소 시킨다. 두 번째 단계에서 특정 mRNAs biotinylated로 복구 되 고 지역에 mRNA 표적에 anneal ASOs를 수정. 또는, 수정된 ASOs 수 또한 직접 covalently에 첨부는 아민-링커를 통해 자석 구슬 biotin 바인딩 단백질을 잡으려고 성향 감소. 그러나, 우리의 경험, streptavidin 구슬의 추가 이전 ASOs는 많은 RNA 분수의 인큐베이션 복구 mRNPs 아소 결합 구슬의 직접적인 추가 보다 더 효율적으로. 가능 하 게, 무료 oligos는 접착 고정된 oligos에 비해 구조화 된 RNA에 시퀀스에 더 나은 접근을 선호 하 고 있습니다. 따라서, ASOs의 샘플 인큐베이션 전에 구슬의 공유 결합 RNA 대상의 복구를 위해 유해할 수 하 고 경험을 테스트 될 수 있다.
아소 기반 방법으로 하나의 단점은 일부 대상 mRNAs의 비효율적인 복구입니다. 따라서이 좋습니다 anneal 여러 ASOs의 평가 대 본의 다른 지역에. 특히, 3'-UTR에서 시퀀스 anneal 2-3 ASOs 또는 관심의 mRNA의 CD 디자인을 좋습니다. 각 아소 각각 mRNA 대상의 복구에 대 한 다른 효율성을 전시 수 있습니다 하 고 경험적으로 되어야 합니다 (그림 2A, B, 데이터 표시 되지 않음)을 테스트. 끝에, 우리는 발견 ASOs 3' Utr에 어 닐 링 더 수행 CD를 단련 하는 것 들에 비해. 이것은 리보솜 CD 내에서 효율적인 하이브리드를 방해 수 있습니다 반면 리보솜, 번역의 부재로 인해 Utr에 사이트를 바인딩 증가 접근성 때문일 수 있었다. 우리 또한 경험이 풍부한 비 표적 mRNAs에서 증가 오염으로 이어질 수 및 풀 다운 효율 감소 여러 ASOs의 조합. 어떤 경우에, 선택한 oligos의 선택도 경쟁 실험에 의해 통제 될 수 있다 (예., 경쟁 oligos의 추가).
더 우려 없는 RNAs와 잠재적인 간 교 잡에 관한 다른 mRNAs와 그도 부분 교 잡 관찰로 이어질 수 있습니다 그 mRNA (그림 2C)의 복구. 설계 ASOs의 적합성 평가, 따라서 좋습니다 초기 체 외에 테스트 총 RNAs 소금 농도 및 버퍼의 세척 온도 최적화를 수행. 우리의 손에서 150 m m를 포함 하는 버퍼에서 결합 하는 streptavidin 자석 구슬의 세척 55 ° C에서 NaCl 수행, 하지만 각 설계 아소에 대 한 조건의 독립 테스트 것이 좋습니다. 주목할 만한, 우리 모든 ASOs (2D 그림) 에서 체 외 실험에서 선택 했다 캡처 가교 된 셀 추출 물 (그림 3)에서 각각 mRNA 표적에 대 한 적절 한 추가에서 의 유효성 substantiating 발견 체 외 테스트. MRNA 캡처에 대 한 적합 한 ASOs, 설계 외 추가 요소 선택도에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 구슬 유형 사양에 따라 BSA 및 tRNA와 포괄적인 차단 절차 구슬에 난다 바인딩을 방지할 수 있습니다. 더 단백질의 불특정 흡수를 줄이기 위해,이 좋습니다 Lo 바인딩 튜브를 사용 하 여를 샘플의 낮은 금액으로 작업 하는 경우에 특히.
일반적으로, 여행 수 ASOs와 RNAs를 잡으려고 이전 설립된 접근을 보완 하 고 있다. 예를 들어, 비 코딩 RNA Xist 의 긴 (90-메 르) biotinylated DNA oligonucleotides 전체 사본 를 포함 하는 배열을 사용 하 여 200-800 백만 자외선 가교 된 세포에서 파생 된 핵 추출 물에서 바인딩된 단백질 격리 했다 34,35. 그러나, 선택한 바둑판식 배열 접근 없는 RNAs과 간 교 잡에 대 한 중대 한 잠재력에 비추어 문제가 될 수 있다 그리고 특정 사본, 예를 선택 하는 데 사용할 수 없습니다., 양자 택일로 접합 형태. 최근, 잠긴된 핵 산 (LNA) 특별히 또는 DNA 아소 mixmers covalently 세포 자유로운 추출 물;에서 생체 외에서 사본 또는 높은 표현된 리보솜 RNAs를 복구 하는 자기 수 지에 붙어 있었다 그러나, 그것은 vivo에서 형성 된 mRNA 단백질 단지36의 복구를 위해 시험 되었다. RBPs와 ncRNA post-transcriptional 유전자 제어의 증가 인식에 비추어 우리를 믿고 여행을 구성과 RNP 단지 세포내 환경 단서와 미치는 영향에 따라 세포 내에서 역학 조사 하는 유용한 방법 건강과 질병.

Post-transcriptional 유전자 규칙 구동 RNA 의무적인 단백질 (RBPs), 비 코딩 RNAs (ncRNAs) 및 mRNAs 사이 상호 작용을 통해이 직접 처리, 현지화, 번역 및 셀1 에 내에서 모든 대 본의 , 2. RBPs 고 ribonucleoprotein 단지/입자 (RNPs)로 알려져 설정 특정 mRNAs와 상호 작용 하는 ncRNA mRNAs와 유전자 식 컨트롤의 운명을 이해 하는 열쇠 이므로. RNP 단지3,4의 생 화 확 적인 특성에 대 한 보완 방법을 착수: "RNA 중심" 접근을 포함 한다 "단백질 중심" 접근은 특정 RBPs의 정화를 바탕으로, 하는 동안은 모집단 또는 개별 RNAs 및 상호 작용 단백질 또는 RNAs의 후속 분석의 격리. 최근, polyadenylated와 상호 작용 하는 RBP 레 퍼 토리의 식별을 위한 RNA 중심 접근 (poly(A)) RNAs5 인기 끌고있다 점점 단백질-RNA 안정화 하는 자외선 (UV) 빛 가교 단계를 통합 하 여 상호 작용 이전 극적으로 인간 세포6,7,,89,10,11RBPs의 카탈로그를 확장, mRNAs의 격리 꼬마 선 충 12,14, saccharomyces cerevisiae의12,13,및 다른 유기 체15,,1617,18, 19,20. 그러나, 단백질의 특정 사본에 ncRNAs 매핑 여전히 좋은 도전입니다. 이 위해, 두 가지 주요 방법을 현재 사용: 한편으로, RNA aptamer 태그 친 화력 정화 수 있도록 관심의 RNA를 융합 하는. 따라서, RNA aptamers aminoglycoside 항생제를 포함 한 tobramycin 및 스21,22,,2324또는 단백질 외 투 단백질 같은 높은 선호도와 바인딩 R17/MS2 살 균 소 또는 세균성 streptavidin S125,,2627,,2829. 비록이 방법은 상대적으로 강력 하 고 다재 다능 한 수를 표시 했다, 조사, 설계는 RNA 복제 요구 하 고 따라서 자연 mRNAs를 캡처하는 데 사용할 수 없습니다. 다른 한편으로, 센스 oligonucleotides (ASOs)는 복구에 대 한 초기에 사용 되었다 하 고의 높은 네이티브 RNPs30,31 및 바이러스 성 RNAs32표현. 더 최근에, ASOs 캡처 오래 비 코딩 RNAs33,,3435 에 적용 된 고 생체 외에서 mRNPs36형성. 모든 RNA 중심 접근 한 주요 제한 요인이 더 문제가 낮은 표현 mRNAs의 복구를 만들기 관심, RNA의 복사본입니다. 이 제한 반응; upscaling에 의해 극복 될 수 있다 그러나,이 잠재적으로 배경 증가 발생할 수 있습니다.
여기, 우리가 우리의 최근에 개발한 아소 기반 협동 RNA 격리 절차 (여행) 높은 선택도37 (그림 1). 와 네이티브 mRNA 단백질 복합물을 설명 두 개의 순차적 아소 기반 정화 단계를 포함 하는 프로토콜, 상용 oligo(dT)와 많은 mRNAs의 특별히 설계 된 짧은 biotinylated 2'-methoxy를 사용 하 여 특정 mRNAs의 캡처 다음 비즈를 결합 하는 즉 ASOs RNA입니다. 이 2 단계 절차는 오염 단백질을 제거 하는 데 도움이 하 고 조정 및 최적화에 대 한 기회를 추가 합니다. 이 경우에, 여행에서 효 모, 선 충, 선택 된 mRNAs에 적용 된 그리고 mRNA 단백질 복합물을 형성 하는 인간 세포 vivo에서 확인 하.

<table><tbody><tr><td>MaxQ 5000 대형 인큐베이팅 및 냉장 오비탈 쉐이커</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE5000-8CE</td>, <td>효모 세포 배양을 위한 플로어 쉐이커</td></tr>, <tr><td>BBD 6220</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td>, <td>인간 세포 배양을 위한 CO2 인큐베이터</td></tr><tr>,<td>Sonicator Soniprep150</td>, <td>MSE</td><td>, MSS150. CX4.5</td><td>초음파 처리기/세포 교란기. 인간 세포에서 DNA를 전단하는 데 사용</td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td>Stratalinker는 세포를 254 nm의 자외선에 노출시킵니다</td></tr><tr><td>Tissue Lyser:</td><td>Qiagen</td><td>RETSCH MM200</td><td>효모 세포를 기계적으로 파괴하는 장치</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>세포를 스핀다운시키기 위한 원심분리기,</td></tr><tr><td>진탕 인큐베이터, Thriller</td><td>Peqlab</td><td></td><td>1.5 mL 튜브용 Thermoshaker</td></tr><tr><td>유리 구슬 0.5mm</td><td>Stratech Scientific Limited</td><td></td><td>효모 세포의 11079105 용해</td></tr><tr><td>나일론 필터, 0.41 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>NY4104700</td><td>효모 세포 수집</td></tr><tr><td>Millex-HA Filter, 0.45 &micro; m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA02510</td><td>선충 용해물 정화를 위한 필터</td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind 마이크로 원심분리기 튜브 단백질 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22431081</td><td>단백질 손실 최소화</td></tr><tr><td>2 mL 마이크로fuge 튜브</td><td>Ambion</td><td>AM12425</td><td>효모 추출물 준비 및 기타 응용 분야</td></tr><tr><td>5 mL 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>129A</td><td>HEK293 세포 용해물 컬렉션</td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>Collection C. elegans</td></tr><tr><td>50 mL 플라스틱 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>컬렉션 효모 세포</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966</td><td>HEK293 세포 배양을 위한 배지</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>박테리아를 제어하기 위해 세포 배양 배지를 보충하는 데 사용됩니다. 오염</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>세포 배양 배지를 보충하는 데 사용</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>DNAse I는 세포 용해물에서 DNA를 분해합니다</td></tr>. <tr><td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td>RNase inhibitor RNA 분해</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>단백질 분해 방지를 위한 프로테아제 억제제 칵테일</td></tr><tr><td>Dynabeads Oligo (dT)25</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61011</td><td>mRNA-단백질 복합체 정제의 첫 번째 단계에 필요한 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td>mRNA-단백질 복합체 정제의 두 번째 단계에 필요한 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>10109550001 E. coli 에서 RNA를 전달하여 streptavidin 비드를 차단하고 비분리성 상호 작용을 방지하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>퀵 스타트 Bradford 1x 염료 시약</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td>용해물 내 단백질 농도를 측정하기 위해, BSA를 참조로 사용</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>단백질 농도 측정을 위한 참조로 사용될 표준 곡선을 수행하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>마우스 anti-Act1</td><td>MP Biomedicals</td><td>869100</td><td>웨스턴 블롯에서 효모 액틴 검출을 위한 항체 (1:2,500)</td></tr><tr><td>마우스 anti-Act1</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td>웨스턴 블롯에서 human actin 검출을 위한 항체 (1:2,000)</td></tr><tr><td>mouse anti-HuR</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5261</td><td>웨스턴 블롯에서 HuR 검출용 항체 (1:500)</td></tr><tr><td>마우스 anti&ndash; CYC-1</td><td>Invitrogen</td><td>456100</td><td>웨스턴 블롯 (1:1,000)</td></tr><tr><td>퍼옥시다제 안티-퍼옥시다제 용해성 복합체</td>에서 Cyc-1 검출을 위한 항체 <td>시그마</td><td>P1291</td><td>웨스턴 블롯에서 Pfk2:TAP 검출 (1:5,000)</td></tr><tr><td>HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG</td><td>Amersham</td><td>NXA931</td><td>HRP-coupled secondary 항체</td></tr></tbody></table>

진 핵 세포 mrna 단백질 복합물을 복구 하는 oligonucleotide 기반 협동 rna 격리 절차

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA 의무적인 단백질 (RBPs) post-transcriptional 유전자 발현 통제에 주요 역할을 재생합니다. 따라서, mRNA 단백질 복합물의 생 화 확 적인 특성 상호 작용 단백질 또는 비 코딩 RNAs에 의해 유추 하는 mRNA 규정을 이해 하는 데 필수적 이다. 여기, 탠덤 RNA 격리 절차 (여행) 세포 추출 물에서 endogenously 형성된 mRNA 단백질 복합물의 정화를 가능 하 게 설명 합니다. 2 단계 프로토콜 포함 polyadenylated mRNAs 센스 oligo(dT) 구슬 및 후속의 다음으로 고립 될 수 있다 3'-biotinylated 2'-O-갠 센스 RNA oligonucleotides와 함께 관심 있는 mRNA의 캡처의 격리 streptavidin 구슬입니다. 여행 가교 된 mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) 단지 vivo에서 효 모, 선 충 및 추가 RNA와 단백질 분석에 대 한 인간의 세포에서 복구할 데 사용 되었습니다. 따라서, 여행은 mRNPs 세포내 또는 환경 단서에 의해 부과 된의 동적 다시 배열 공부 하는 생물에 걸쳐 polyadenylated RNAs의 모든 종류에 적용할 수 있습니다 다목적 접근 이다.

우리는 여행, 3 다른 유기 체37에서 바인딩된 단백질 그들의 특정 한 mRNAs를 잡으려고 불리는 아소 기반 RNA 격리 전략 개발. 본질적으로, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서 했다 254 nm, 및 많은 세포의 UV 방사선에 의해 RNAs는 상용 올리고 (dT) 결합 하는 자석 구슬, 복구 된 다음의 mRNA와 격리 했다 3'-biotinylated 2-0'-methoxy 수정 센스 RNA oligonucleotides (그림 1). 우리 따라서 전체 complementarity 여러 21-24 국세청 수정 ASOs 영역 선택 된 mRNAs에 효 모, 선 충 C. 및 인간, 디자인과 (뇌관 및 ASOs의 목록이 테이블에서에서 주어진 다 관심의 mRNA를 복구할의 적합성 테스트 1). 효율성과 개별 ASOs의 특이성 각 유기 체에서 분리 된 비 가교 된 총 RNA와 먼저 평가 했다. 이 실험에서 RNA ASOs streptavidin 활용 된 상자성 구슬에 결합 되었고 해당 유기 체에서 준비 하는 비 가교 된 총 RNA와 인 큐베이 팅. 구슬에서 캡처된 mRNAs의 출시 후 mRNA의 존재 뿐만 아니라 없는 제어 mRNAs는 반전 녹음 방송 (RT)에 의해 모니터링 대상-중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)37. 우리는 두 개의 변수, 소금 농도 및 온도 워시 버퍼, 3 개의 다른 ASOs (그림 2A)와 함께 테스트 되었습니다 누 룩에서 PFK2 mRNA의 캡처의 효율에 중요 한 역할을 했다 것으로 나타났습니다. 복구 감소 25 m m 소금 (NaCl) 농도 낮추는 부정적인 모든 ASOs, 감지할 수 없는 수준 mRNA (PFK1)를 제어 하지만 그것은 또한 원하는 복구 감소 표적 mRNA PFK2 (입력의 10-15%). 반대로, 생리 적인 수준 (150 m m NaCl) 염 농도의 증가 PFK2 mRNAs의 복구와 아소 PFK2-2, PFK1 컨트롤의 초과 75%까지 증가 하 여 mRNA 적어도 5 (그림 2A). 추가 메모의 다른 ASOs mRNA의 중대 한 변이 대상 캡처 신진대사에서 보였다 생리 소금 농도, ASOs. 의 경험적 검증에 대 한 필요성을 강조 워시 버퍼의 온도 의존 mRNA 복구의 cep-1 C. 선 충과 효 RPS20 mRNAs 각각 ASOs (표 1)를 사용 하 여 exemplified입니다. 우리는 최적의 세척 온도 50 ° C와 분명 관련이 없는 mRNAs와 mRNAs 대상 (그림 2B)의 효율적인 복구 낮은 배경에서 55 ° C 사이 했다 관찰 했다. 이 시점에서, 우리는 십자가-교 잡의 ASOs의 다른 mRNAs와 가능성을 강조 하고자 합니다. 예를 들어 DNM1 아소 DNM1 코딩 시퀀스 내에서 시퀀스를 완벽 하 게 보완 이지만 그것은 또한 부분적으로 ACT1 mRNA와 anneals. DNM1 ASOs 간 교 잡 (그림 2C)에 대 한 강한 성향을 보여주는 세척 온도 관계 없이 모두 mRNAs 복구. 마지막으로, 우리는 위의 설명된 테스트 사용 하 고 최적화 선택에서 각각 대상 mRNAs의 복구에 적합 했던 3 ASOs를 총 RNA S. cerevisiae, C. 선 충 및 인간의 세포 (그림 2D에서 격리 ).
적당 한 ASOs 생체 외에서 의 초기 선택 후 우리 셀 추출 물 자외선 가교 된 생물/셀 (그림 1)에서 얻은 여행을 수행. 특히, 우리는 3 개의 다른 유기 체에서 3 개의 다른 mRNAs의 복구 테스트: 효 모 S. cerevisiae, cep 1 C. 선 충, 선 충 및 기자에서에서 PFK2 mRNA mRNA (pGL3-CDKN1B-3'UTR) 3' UTR 베어링 인간 CDKN1B/p27 mRNA 순서 인간 HEK293 세포에서 과도 식 luciferase (루크) 기자에 게 융합. RNA 격리의 특이성을 제어 하려면 모니터링 하는 여러 관련 없는 mRNAs의 복구 하 고 우리는 펜 실바 니 아 셀 추출 물에 oligo(dT)25에 세포 mRNAs의 바인딩으로 경쟁의 과잉의 추가 의해 경쟁 실험 수행 는 첫 번째 단계 정화 단계 동안 구슬. 이전 비 가교 된 총 RNA 샘플 (그림 2), RT-PCR 확인 본 각 mRNAs의 농축 대상 mRNA 여행 동안, 여러 비 관련 제어 mRNAs 농축 되지 했다 반면 (그림 3A). 또한, 어느 mRNAs ASOs, 불특정 바인딩 방지 하는 적절 한 차단 절차를 나타내는 없이 구슬에 감지 했다. 이 줄에 무관/발진 ASOs 또한 사용할 수 있습니다 제어, 특정 mRNAs와 바운드 단백질의 유추 캡처 간 교 잡에 대 한 잠재적인 다음 고려 되어야 하는. 이후 최종 eluate에 단백질은 스테인드 polyacrylamide 젤 (데이터 표시 되지 않음)에 거의 구상 될 수, 이전에 알려진된 mRNA 상호 작용 단백질의 존재는 더 immunoblot 분석에 의해 평가 됩니다. S. cerevisiae, 리보솜 독립적인 방식으로12; PFK2 mRNA를 선택적으로 묶는에서 Pfk2p 포함 C. 선 충 GLD-1, 3 ' UTR cep 1 의 시퀀스는 정식 RBP mRNA 변환 규칙43; 그리고 허는 RBP mRNA 안정성 및 p27/CDKN1B mRNA44의 번역. 예상 대로,이 단백질의 모든 서쪽 오 점 분석 (그림 3B)에 의해 각각 mRNAs의 여행 있다에서 확인 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58223/58223fig1.jpg"> 그림 1입니다. 여행의 도식 대표. 단백질은 RNA에 vivo에서 UV 방사선에 의해 가교 된. (밝은 녹색 상자) 첫 번째 단계에서 많은 RNA-단백질 복합물 oligo(dT)25 구슬 언바운드 단백질 제거 하려면 엄격한 세척 조건 적용 복구 됩니다. 두 번째 단계 (핑크 상자)에서 대상 mRNP는 뽑아-아웃 biotinylated 센스 RNA oligonucleotides와 streptavidin 구슬. 순화 mRNPs 다음 RT-PCR 및 immunoblot/질량 분석 (MS) RNAs 단백질 각각의 관심, mRNA와 상호 작용을 식별 하 여 분석 된다. 그림은 권한이 있는 이전 게시37 에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58223/58223fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58223/58223fig2.jpg"> 그림 2입니다. 비 가교 화 셀/유기 체를 사용 하 여 전체 RNA에서 선택 된 mRNAs의 절연 antisense RNA 캡처 프로브 수정. (A) 효 모 PFK2 mRNA ASOs와의 캡처 효율성에 소금 농도의 영향. 효 모 세포에서 총 RNA 표시 ASOs와 결합 되었고 55 ° c.에 지정 된 소금 (NaCl) 농도 포함 하는 버퍼와 세척 그린, 블루와 오렌지 라인 대표37RT-PCR 의해 결정으로 다른 ASOs PFK2 mRNA 복구: PFK2 1 , PFK2-2에는 3' UTR, CD에서 PFK2 4 anneal. PFK1 는 부정적인 mRNA를 제어. PCR 32 증폭 사이클 수행 하 고 앞에서 설명한37로 계량 했다. C. eleganscep-1 및 효 모 RPS20 아소의 (B) 일부 다른 세척 온도, 검정과 빨강 라인에 각각 표현에서 mRNAs 바인딩됩니다. C. eleganspgk-1 및 효 모 ACT1 비 대상 (제어) mRNAs는. 30과 32 PCR 주기는 각각 효 모와 선 충 C. mRNAs의 검출에 대 한 적용 했다. (C) DNM1 ACT1 mRNA와 (빨간) 시퀀스는 DNM1 mRNA로 잠재적인 간 교 잡에 아소의 교 잡의 도식 대표는 왼쪽에 표시 됩니다. 효 모 DNM1 및 ACT1 mRNAs 구슬에서 eluted의 검출을 위한 RT-PCR 반응 (30 주기)에서 제품을 보여주는 agarose 젤 오른쪽에 표시 됩니다. 입력, 총 RNA; Sn, ASOs;를 가진 외피 후 상쾌한 E, 구슬에서 세척에서 있다 표시 온도 이전 차입 (40 ° C, 50 ° C와 60 ° C). 제어 실험 (Ctrl) 아소를 추가 하지 않고 동시에 수행 되었다. (D) Agarose 젤 (오른쪽) 효 모 S. cerevisiae, C. 선 충, 그리고 인간의 HEK293 세포 (H. sapiens)의 총 RNA에서 캡처한 mRNAs의 검출을 위한 RT-PCR 제품을 보여주는. 입력, 총 RNA; Sn, 표면에 뜨는; E, 구슬에서 있다입니다. PCR 효 모 mRNAs에 대 한 30 확대 주기, C. 선 충 mRNAs 32 사이클에 의해 수행 됐다 고 28 및 30 각각 인간의 tubulin p27 mRNAs를 주기. 그림은 권한이 있는 이전 게시37 에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58223/58223fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58223/58223fig3.jpg"> 그림 3입니다. 여행과 자외선 가교 된 셀에서 파생 된 추출 물에서 특정 mRNA 단백질 복합물의 캡처. (A) Agarose 젤 oligo(dT)와 S. cerevisiae, C. 선 충 그리고 인간 (H. sapiens) 셀 추출 물에서 나타난된 ASOs 캡처 시 RT-PCR와 (오른쪽) mRNAs의 검출에 대 한. 입력, 가교 화 셀/유기 체;에서 총 RNA Ctrl 키, 아소 없이 제어입니다. 많은, 많은 경쟁 RT-PCR은 35 증폭 사이클 설명된37 로 뤽에 대 한 p27, 32 주기 그리고 수행 29 tubulin위해 사이클. (B) 표시 된 항 체 (오른쪽)와 mRNA-바인딩 단백질의 Immunoblot 분석. 로드 된 분수는 다음과 같습니다: 0.1%, 2.5% 1% 효 모, 선 충 및 인간의 입력; 10%, 10%, 5% 효 모, 선 충 및 인간 oligo(dT) 차선; 그리고 모든 ASOs 차선 66%입니다. 분자 무게 (MW) kilodaltons (kDa)에 표시 됩니다. 그림 허가37와 게시입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58223/58223fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>뇌관 이름</td>
			<td colspan="2">시퀀스</td>
			<td>대상</td>
			<td>크기</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pfk2_Fwd</td>
			<td colspan="2">GTGTTAAGGGTTCACATGTCG</td>
			<td>PFK2 S. cerevisiae</td>
			<td>133 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pfk2_Rev</td>
			<td colspan="2">CTTCCAACCAAATGGTCAGC</td>
			<td>PFK2 S. cerevisiae</td>
			<td>133 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pfk1_Fwd</td>
			<td colspan="2">GGTGATTCTCCAGGTATGAATG</td>
			<td>PFK1 S. cerevisiae</td>
			<td>97 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pfk1_Rev</td>
			<td colspan="2">CTTCGTAACCTTCGTAAACAGC</td>
			<td>PFK1 S. cerevisiae</td>
			<td>97 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Act1_Fwd</td>
			<td colspan="2">GTCTGGATTGGTGGTTCTATC</td>
			<td>ACT1 S. cerevisiae</td>
			<td>85 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Act1_Rev</td>
			<td colspan="2">GGACCACTTTCGTCGTATTC</td>
			<td>ACT1 S. cerevisiae</td>
			<td>85 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnm1_Fwd</td>
			<td colspan="2">CTGTGTTCGATGCATCAGAC</td>
			<td>DNM1 S. cerevisiae</td>
			<td>156 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnm1_Rev</td>
			<td colspan="2">CGCACTCCAATTCTTCTCTC</td>
			<td>DNM1 S. cerevisiae</td>
			<td>156 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rps20_Fwd</td>
			<td colspan="2">CGCTGAACAACACAACTTGG</td>
			<td>RPS20 S. cerevisiae</td>
			<td>228 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rps20_Rev</td>
			<td colspan="2">GGAAGCAACAACAACTTCGAC</td>
			<td>RPS20 S. cerevisiae</td>
			<td>228 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cep1_Fwd</td>
			<td colspan="2">CGATGAAGAGAAGTCGCTGT</td>
			<td>cep-1 C. 선 충</td>
			<td>110 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cep1_Rev</td>
			<td colspan="2">ATCTGGGAACTTTTGCTTCG</td>
			<td>cep-1 C. 선 충</td>
			<td>110 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pgk1_Fwd</td>
			<td colspan="2">GCGATATTTATGTCAATGATGCTTTC</td>
			<td>pgk-1 C. 선 충</td>
			<td>74 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pgk1_Rev</td>
			<td colspan="2">TGAGTGCTCGACTCCAACCA</td>
			<td>pgk-1 C. 선 충</td>
			<td>74 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mpk1_Fwd</td>
			<td colspan="2">TGCTCAGTAATCGGCCATTG</td>
			<td>mpk-1 C. 선 충</td>
			<td>74 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mpk1_Rev</td>
			<td colspan="2">TCCAACAACTGCCAAAATCAAA</td>
			<td>mpk-1 C. 선 충</td>
			<td>74 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>p27_Fwd</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATACATATCGCTGACTTCATGG</td>
			<td>p27 헤 사피엔스</td>
			<td>212 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>p27_Rev</td>
			<td colspan="2">CAAAGTTTATGTGCTACATAAAAGGTAAAAA</td>
			<td>p27 헤 사피엔스</td>
			<td>212 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luc_Fwd</td>
			<td colspan="2">AATGGCTCATATCGCTCCTGGAT</td>
			<td>Luciferase P. pγralis
</td>
			<td>117 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luc_Rev</td>
			<td colspan="2">TGGACGATGGCCTTGATCTTGTCT</td>
			<td>Luciferase P. pγralis
</td>
			<td>117 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-TUBULIN_Fwd</td>
			<td colspan="2">CTGAACCACCTTGTCTCAGC</td>
			<td>Β-TUBULIN 헤 사피엔스
</td>
			<td>136 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-TUBULIN_Rev</td>
			<td colspan="2">AGCCAGGCATAAAGAAATGG</td>
			<td>Β-TUBULIN 헤 사피엔스
</td>
			<td>136 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>
PFK2-1 아소</td>
			<td colspan="2">AAUAGAAAGUGUAAUAAAAGGUCAU</td>
			<td>3' UTR PFK2 S. cerevisiae
</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>
PFK2-2 아소</td>
			<td colspan="2">GUUUCAUGGGGUAGUACUUGU</td>
			<td>3' UTR PFK2 S. cerevisiae
</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>
PFK2-4 아소</td>
			<td colspan="2">CUUGAAGAGGAGCGUUCAUA</td>
			<td>ORF PFK2 S. cerevisiae
</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>
DNM1 아소</td>
			<td colspan="2">UCGGUCAGUGGAGGUUCAGCGUUU</td>
			<td>ORF DNM1 S. cerevisiae
</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>
RPS20 아소</td>
			<td colspan="2">GUCGGUAAUAGCCUUCUCAUUCUUG</td>
			<td>ORF RPS20 S. cerevisiae
</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>
cep-1 아소</td>
			<td colspan="2">GUGAGAAAUGCGGUGCUUUGAAA</td>
			<td>3' UTR cep 1 C. 선 충
</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>
p27 아소</td>
			<td colspan="2">UCAUACCCCGCUCCACGUCAGUU</td>
			<td>3' UTR p27 헤 사피엔스
</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. Oligonucleotide 시퀀스. PCR 뇌관 및 ASOs 확대 후이 일, 뇌관 순서, 유전자 대상 및 예상된 조각 크기에 사용의 목록입니다.

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

이 방법은 RNA 결합 단백질이 생체 내에서 특정 RNA에서 어떻게 조립되어 전사 후 유전자 조절을 부과하는지와 같은 유전자 발현 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복제나 유전자 조작이 필요하지 않다는 것입니다. 모든 모델 유기체 또는 아형에 적용할 수 있습니다.올리고뉴클레오티드를 설계하려면 온라인 도구를 사용하여 mRNA 또는 그 단편의 2차 구조를 분석합니다. 먼저 빈 상자에 뉴클레오티드 염기서열을 입력한 다음 Basic Options 상자에서 최소 자유 에너지를 선택하고 분리된 염기쌍을 피합니다. Output Options 상자에서 interactive RNA secondary structure plot을 선택하고 마지막으로 Proceed 버튼을 클릭합니다.관심 있는 mRNA의 2차 구조를 표시하는 새 창이 나타납니다. 관심 mRNA 내에서 최소 3개의 서로 다른 21 - 24-뉴클레오티드 길이의 염기서열을 선택하며, 우선적으로 광범위한 2차 구조가 없고 3-프라임 비번역 영역에 위치한 영역을 선택합니다. 구아니딘/시토신 비율이 50%에 가깝고 뉴클레오티드 탠덤 반복이 없는 영역을 선택하여 헤어핀 형성 또는 자체 어닐링의 가능성을 방지합니다.원하는 타겟 mRNA 내에서 선택한 영역을 완전히 보완하는 3-프라임에서 비오틴 부분을 갖는 2-프라임-메톡시 변형 RNA 올리고뉴클레오티드를 수동으로 설계합니다. 적절한 온라인 도구를 사용하여 RNA 하이브리드의 용융 온도를 60도에서 65도 사이로 조정하고 우수한 언어 서열 복잡성을 갖도록 합니다. Basic Local Alignment Search Tool을 사용하여 전사체에서 다른 mRNA와의 잠재적인 ASO 교차 혼성화를 검색합니다.Nucleotide BLAST를 선택하고, 빈 상자에 염기서열을 삽입하고, 관심 생물을 선택합니다. 나머지 매개변수는 기본값으로 유지하고 BLAST를 클릭합니다. 10cm 조직 배양 접시에서 HEK293 세포를 70% 포화도에서 2마이크로그램의 리포터 유전자와 20마이크로리터의 형질주입 시약과 혼합하고 세포에 첨가하여 형질주입합니다.채취하기 전에 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다. 수확 당일에는 혈청 학적 피펫으로 배지를 제거하고 섭씨 37 도에서 예열 된 10 밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 빠르게 세척합니다. 다음으로 접시에 PBS 6ml를 넣고 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 UV 교차결합제에서 세포를 제곱센티미터당 100밀리줄의 자외선에 노출시킵니다. 자외선에 노출된 후 세포와 PBS를 긁어내고 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 g으로 셀을 스핀다운합니다.피펫으로 상층액을 제거한 후, 튜브를 얼음 위에 올려 놓고 5-6회 위아래로 피펫팅하여 2ml의 사전 냉각된 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다. 피펫으로 용해물을 얼음 위에 놓인 5밀리리터 튜브로 옮기고 10미크론 진폭에서 20초 버스트로 구성된 3회 동안 초음파 처리하고 얼음에서 30초의 냉각 기간을 갖습니다. 용해물을 2 밀리리터 관으로 옮긴 후에, 15, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 시간 g에 분리기.상층액을 모아 새 튜브로 옮깁니다. RNA 분리를 시작하려면 500마이크로리터의 용해 완충액에서 1mg의 올리고(dT) 결합 마그네틱 비드를 평형화합니다. 회전자에서 튜브를 제거하고 마그네틱 랙에 놓고 용해 버퍼를 제거합니다.HEK293 단백질 추출물 4mg을 올리고(dT)25 결합 마그네틱 비드와 결합합니다. 샘플을 세게 섞은 다음 섭씨 25도에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 10초 동안 놓고 상층액을 제거합니다.후속 회수 라운드를 위해 상층액을 얼음 위에 보관하십시오. 500마이크로리터의 세척 완충액 A를 비드에 추가하고 5초 동안 소용돌이칩니다. 자석을 가진 구슬을 모으고 그 후에 RNA를 용리하기 위하여 세척 완충 B.To 액의 500 마이크로리터로 구슬을 두번 세척하고, 10 millimolar Tris-HCl의 30 마이크로리터를 추가하고 1, 000 RPM에 지속적인 동요를 가진 2 분 동안 80 섭씨 온도에 관을 배양하십시오.튜브를 마그네틱 스탠드로 직접 옮기고 10초 정도 후에 가능한 한 빨리 용리액을 수집하여 더 낮은 온도에서 mRNA가 비드에 재결합할 가능성을 방지합니다. 그런 다음 반복되는 라운드의 용리액을 결합하여 섭씨 영하 80도에서 저장할 수 있습니다. 특정 mRNA를 포획하려면 1ml의 결합에 30마이크로리터의 스트렙타비딘 결합 마그네틱 비드를 추가하고 0.1밀리리터당 밀리리터 E.coli 전달 RNA가 포함된 완충액을 세척합니다.실온에서 1시간 동안 회전체에서 평형을 이룹니다. 한 시간 후 750마이크로리터의 바인딩 및 세척 버퍼로 비드를 세 번 세척합니다. 튜브를 소용돌이치게 한 다음 흑백 버퍼를 제거한 다음 30마이크로리터의 버퍼에 다시 현탁시키고 사용할 때까지 얼음 위에 두십시오.100마이크로리터의 결합 및 세척 완충액에 이전 폴리(A) 분리에서 약 35마이크로그램의 총 단백질을 희석한 다음 적절한 안티센스 올리고뉴클레오티드 200피코몰을 추가하고 어닐링을 용이하게 하기 위해 섭씨 70도에서 5분 동안 배양합니다. 장치에서 전체 열 블록을 제거하고 실온에 10분 동안 놓아 천천히 식힙니다. 다음으로, 30마이크로리터의 평형 스트렙타비딘 결합 마그네틱 비드를 샘플에 첨가한 다음 믹서에서 950rpm으로 지속적으로 흔들면서 섭씨 25도에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다.튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 상층액을 제거한 다음 750마이크로리터의 예열 바인딩으로 비드를 세 번 세척하고 섭씨 55도에서 버퍼를 세척합니다. 20 마이크로 리터의 10 밀리 몰 Tris-HCl을 넣고 섭씨 90도에 놓고 950rpm에서 10 분 동안 계속 흔들어 RNA를 용리시킵니다. 10분 후 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 즉시 용리액을 수집합니다.HEK293 세포 추출물에서 p27 mRNA에 올리고(dT) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 포획할 때 특정 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 mRNA를 검출하는 데 사용되는 아가로스 겔입니다. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 없는 대조군도 표시됩니다. 입력 레인은 가교 결합된 세포의 총 RNA를 보여줍니다.또한 poly(A)와의 경쟁 결과도 표시됩니다. 여기에 표시된 것은 인간 항원 R, 알려지지 않은 RNA 결합 단백질 및 음성 대조 단백질인 베타-액틴을 검출하는 항체가 있는 mRNA 결합 단백질의 면역 블롯 분석입니다. 이 블롯은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된 p27 mRNA를 포획할 때 분리된 폴리(A)RNA에서 인간 항원 R이 성공적으로 검출되었음을 보여줍니다.인간 항원 R은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 없는 대조군 분리물에서 검출되지 않았습니다. 입력 레인은 가교 세포의 추출물에 있는 단백질을 보여주며 폴리(A)와의 경쟁 결과도 보여줍니다. 이 절차에 따라 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 생체 내에서 특정 RNA와 상호 작용하는 단백질의 전체 샘플을 체계적으로 분석할 수 있습니다.중요한 것은 TRIP이 RNA 단백질 상호 작용의 동적 배열을 이해하기 위해 유기체 전반에 걸쳐 모든 유형의 폴리아데닐화 RNA에 적용할 수 있는 다재다능한 접근 방식이라는 것입니다. 따라서 발달 제어 RNA 또는 질병 관련 RNA를 조사하는 데 사용할 수 있으며 결국 치료 개입을 위한 새로운 표적으로 이어질 수 있습니다.

an-oligonucleotide-based-tandem-rna-isolation-procedure-to-recover

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

이 원고는 특정 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 통해 진핵 세포에서 형성된 동족 RNP를 선별하는 방법을 설명합니다. DHX9/RNA 헬리카제 A로 구성된 레트로바이러스 5' 미번역 영역에 결합된 동족 RNP를 분리하여 이 접근법의 적용 가능성을 입증합니다.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

이 RNA 풀 다운 메서드 오래 비 코딩 RNA (lncRNA)의 RNA 목표를 식별 수 있습니다. 집에서 만든, 설계 방지 감각 DNA oligonucleotide 프로브는 적절 하 게 고정 된 조직 또는 세포 라인에이 lncRNA에 교 잡에 따라, 효율적으로 수 있습니다는 lncRNA의 모든 RNA 대상의 캡처를.

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

여기에서, 우리는 포유류 세포에서 내인성 RNA 결합 사이트 또는 RNA의 "발자국"을 풍부하게 하는 프로토콜을 제시합니다:단백질 (RNP) 복합체. 이 접근은 RNP 소단위의 2개의 면역 강절을 관련시키고 그러므로 나란히 RNA 면역 침전이라고 불립니다 (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

이 프로토콜은 고밀도 지단백질 small RNA의 분리 및 정량화를 설명합니다.

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

배우세요 TRIP 방법을 통해 진핵세포에서 mRNA-단백질 복합물을 격리하고 면역블롯으로 결합 단백질을 검출하는 기술입니다. 유전자 발현 조절 및 전사 후 조절 메커니즘 연구에 활용됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

더 많은 동영상 탐색