진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

이 방법은 RNA 결합 단백질이 생체 내에서 특정 RNA에서 어떻게 조립되어 전사 후 유전자 조절을 부과하는지와 같은 유전자 발현 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복제나 유전자 조작이 필요하지 않다는 것입니다. 모든 모델 유기체 또는 아형에 적용할 수 있습니다.

올리고뉴클레오티드를 설계하려면 온라인 도구를 사용하여 mRNA 또는 그 단편의 2차 구조를 분석합니다. 먼저 빈 상자에 뉴클레오티드 염기서열을 입력한 다음 Basic Options 상자에서 최소 자유 에너지를 선택하고 분리된 염기쌍을 피합니다. Output Options 상자에서 interactive RNA secondary structure plot을 선택하고 마지막으로 Proceed 버튼을 클릭합니다.

관심 있는 mRNA의 2차 구조를 표시하는 새 창이 나타납니다. 관심 mRNA 내에서 최소 3개의 서로 다른 21 - 24-뉴클레오티드 길이의 염기서열을 선택하며, 우선적으로 광범위한 2차 구조가 없고 3-프라임 비번역 영역에 위치한 영역을 선택합니다. 구아니딘/시토신 비율이 50%에 가깝고 뉴클레오티드 탠덤 반복이 없는 영역을 선택하여 헤어핀 형성 또는 자체 어닐링의 가능성을 방지합니다.

원하는 타겟 mRNA 내에서 선택한 영역을 완전히 보완하는 3-프라임에서 비오틴 부분을 갖는 2-프라임-메톡시 변형 RNA 올리고뉴클레오티드를 수동으로 설계합니다. 적절한 온라인 도구를 사용하여 RNA 하이브리드의 용융 온도를 60도에서 65도 사이로 조정하고 우수한 언어 서열 복잡성을 갖도록 합니다. Basic Local Alignment Search Tool을 사용하여 전사체에서 다른 mRNA와의 잠재적인 ASO 교차 혼성화를 검색합니다.

Nucleotide BLAST를 선택하고, 빈 상자에 염기서열을 삽입하고, 관심 생물을 선택합니다. 나머지 매개변수는 기본값으로 유지하고 BLAST를 클릭합니다. 10cm 조직 배양 접시에서 HEK293 세포를 70% 포화도에서 2마이크로그램의 리포터 유전자와 20마이크로리터의 형질주입 시약과 혼합하고 세포에 첨가하여 형질주입합니다.

채취하기 전에 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다. 수확 당일에는 혈청 학적 피펫으로 배지를 제거하고 섭씨 37 도에서 예열 된 10 밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 빠르게 세척합니다. 다음으로 접시에 PBS 6ml를 넣고 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 UV 교차결합제에서 세포를 제곱센티미터당 100밀리줄의 자외선에 노출시킵니다. 자외선에 노출된 후 세포와 PBS를 긁어내고 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 g으로 셀을 스핀다운합니다.

피펫으로 상층액을 제거한 후, 튜브를 얼음 위에 올려 놓고 5-6회 위아래로 피펫팅하여 2ml의 사전 냉각된 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다. 피펫으로 용해물을 얼음 위에 놓인 5밀리리터 튜브로 옮기고 10미크론 진폭에서 20초 버스트로 구성된 3회 동안 초음파 처리하고 얼음에서 30초의 냉각 기간을 갖습니다. 용해물을 2 밀리리터 관으로 옮긴 후에, 15, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 시간 g에 분리기.

상층액을 모아 새 튜브로 옮깁니다. RNA 분리를 시작하려면 500마이크로리터의 용해 완충액에서 1mg의 올리고(dT) 결합 마그네틱 비드를 평형화합니다. 회전자에서 튜브를 제거하고 마그네틱 랙에 놓고 용해 버퍼를 제거합니다.

HEK293 단백질 추출물 4mg을 올리고(dT)25 결합 마그네틱 비드와 결합합니다. 샘플을 세게 섞은 다음 섭씨 25도에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 10초 동안 놓고 상층액을 제거합니다.

후속 회수 라운드를 위해 상층액을 얼음 위에 보관하십시오. 500마이크로리터의 세척 완충액 A를 비드에 추가하고 5초 동안 소용돌이칩니다. 자석을 가진 구슬을 모으고 그 후에 RNA를 용리하기 위하여 세척 완충 B.To 액의 500 마이크로리터로 구슬을 두번 세척하고, 10 millimolar Tris-HCl의 30 마이크로리터를 추가하고 1, 000 RPM에 지속적인 동요를 가진 2 분 동안 80 섭씨 온도에 관을 배양하십시오.

튜브를 마그네틱 스탠드로 직접 옮기고 10초 정도 후에 가능한 한 빨리 용리액을 수집하여 더 낮은 온도에서 mRNA가 비드에 재결합할 가능성을 방지합니다. 그런 다음 반복되는 라운드의 용리액을 결합하여 섭씨 영하 80도에서 저장할 수 있습니다. 특정 mRNA를 포획하려면 1ml의 결합에 30마이크로리터의 스트렙타비딘 결합 마그네틱 비드를 추가하고 0.1밀리리터당 밀리리터 E.coli 전달 RNA가 포함된 완충액을 세척합니다.

실온에서 1시간 동안 회전체에서 평형을 이룹니다. 한 시간 후 750마이크로리터의 바인딩 및 세척 버퍼로 비드를 세 번 세척합니다. 튜브를 소용돌이치게 한 다음 흑백 버퍼를 제거한 다음 30마이크로리터의 버퍼에 다시 현탁시키고 사용할 때까지 얼음 위에 두십시오.

100마이크로리터의 결합 및 세척 완충액에 이전 폴리(A) 분리에서 약 35마이크로그램의 총 단백질을 희석한 다음 적절한 안티센스 올리고뉴클레오티드 200피코몰을 추가하고 어닐링을 용이하게 하기 위해 섭씨 70도에서 5분 동안 배양합니다. 장치에서 전체 열 블록을 제거하고 실온에 10분 동안 놓아 천천히 식힙니다. 다음으로, 30마이크로리터의 평형 스트렙타비딘 결합 마그네틱 비드를 샘플에 첨가한 다음 믹서에서 950rpm으로 지속적으로 흔들면서 섭씨 25도에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다.

튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 상층액을 제거한 다음 750마이크로리터의 예열 바인딩으로 비드를 세 번 세척하고 섭씨 55도에서 버퍼를 세척합니다. 20 마이크로 리터의 10 밀리 몰 Tris-HCl을 넣고 섭씨 90도에 놓고 950rpm에서 10 분 동안 계속 흔들어 RNA를 용리시킵니다. 10분 후 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 즉시 용리액을 수집합니다.

HEK293 세포 추출물에서 p27 mRNA에 올리고(dT) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 포획할 때 특정 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 mRNA를 검출하는 데 사용되는 아가로스 겔입니다. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 없는 대조군도 표시됩니다. 입력 레인은 가교 결합된 세포의 총 RNA를 보여줍니다.

또한 poly(A)와의 경쟁 결과도 표시됩니다. 여기에 표시된 것은 인간 항원 R, 알려지지 않은 RNA 결합 단백질 및 음성 대조 단백질인 베타-액틴을 검출하는 항체가 있는 mRNA 결합 단백질의 면역 블롯 분석입니다. 이 블롯은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된 p27 mRNA를 포획할 때 분리된 폴리(A)RNA에서 인간 항원 R이 성공적으로 검출되었음을 보여줍니다.

인간 항원 R은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 없는 대조군 분리물에서 검출되지 않았습니다. 입력 레인은 가교 세포의 추출물에 있는 단백질을 보여주며 폴리(A)와의 경쟁 결과도 보여줍니다. 이 절차에 따라 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 생체 내에서 특정 RNA와 상호 작용하는 단백질의 전체 샘플을 체계적으로 분석할 수 있습니다.

중요한 것은 TRIP이 RNA 단백질 상호 작용의 동적 배열을 이해하기 위해 유기체 전반에 걸쳐 모든 유형의 폴리아데닐화 RNA에 적용할 수 있는 다재다능한 접근 방식이라는 것입니다. 따라서 발달 제어 RNA 또는 질병 관련 RNA를 조사하는 데 사용할 수 있으며 결국 치료 개입을 위한 새로운 표적으로 이어질 수 있습니다.