오픈 패치 클램프 피 펫과 Unstirred 경계 층에 이온 농도의 측정: 유체에 의해 이온 채널의 제어 의미 흐름
2019년 1월 7일
Mechanosensitive 이온 채널은 종종 패치 클램프 기록 유체 흐름/전단 힘 감도 측면에서 공부 했다. 그러나, 실험 프로토콜에 따라 이온 채널의 유체 흐름 규정에 결과 잘못 된 수 있습니다. 여기, 우리는 방지 하 고 이론적 근거와 이러한 오류에 대 한 메서드를 제공 합니다.
이 제출은 이온 채널의 단지 규정에 있는 액체 흐름과 같은 전기 생리적인 구체에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이온 채널의 유체 흐름 조절과 관련된 데이터 해석을 위해 멤브레인 표면의 교반되지 않은 경계 층에서 실제 이온 농도를 추정할 수 있다는 것이다. 이 절차를 시작하려면 발사 유리 모세관 튜브를 구부려 U 모양을 형성합니다.
모세관의 내경은 큰 이온 전류를 기록할 때 계열 저항을 감소시키기에 충분합니다. 다음으로, 3개의 어금니 칼륨염100밀리리터에 아가로즈 3그램을 녹이고, 90~100°C 사이의 핫 플레이트에 놓습니다. 그런 다음, 용액에 유리 다리를 침지하여 염화 칼륨 아가로즈와 다리를적재합니다.
아가로즈가 설정되고 굳어질 수 있도록 밤새 실온에서 보관하십시오. 다음 날, 경화 아가로즈 소금에서 염화칼륨이 실린 유리 다리를 조심스럽게 파고들수 있습니다. 다리를 냉장고에 3개의 어금니 칼륨을 넓은 목에 담아 보관하십시오.
이 절차에서, 패치 클램프 챔버 위에, 목욕 용액로드 용기를 배치합니다. 다음으로, 튜브를 흡입하여 입욕 용액으로 패치 클램프 챔버를 채웁니다. 유체 흐름을 중지하려면 용기 측의 튜브를 잘라 유체 흐름을 차단합니다.
그런 다음 흡입 측에서 튜브를 잘라 흡입을 동시에 중지합니다. 고정 제어 상태입니다. 유체 흐름 전단 힘을 적용하려면 용기와 흡입 측면에 두 튜브를 동시에 엽니다.
유체 흐름 전단력을 셀에 적용하기 전이나 후에 지정된 시간에 걸쳐 유체 부피의 감소를 측정하여 분당 밀리리터의 유량을 계산합니다. 액체 금속 접합 전위의 변화를 측정하려면, 목욕 챔버에 대한 정상적인 생리염 식염수를 준비하고, 염화 칼륨 다리의 부재와 존재에서 그들을 비교한다. 다음으로, 3개의 어금니 칼륨 염화물 용액을 포함하는 패치 파이펫을 챔버에 놓고 파이펫과 입욕 용액 사이의 접합 전위 이동을 최소화한다.
그런 다음 전압 클램프 증폭기를 현재 클램프 모드로 설정합니다. 초기 오프셋 전위를 무효화한 후 유량의 변화에 따라 유도되는 전압의 변화를 측정합니다. 전압의 변화가 액체 금속 접합 전위인지 확인하려면 목욕 용액과 기준 전극 사이의 아가로즈 염교를 사용하여 접합 전위유체 흐름의 효과를 다시 검사합니다.
액체 금속 접합 전위의 변화의 결과로, 기능 잠재적 유량 관계를 끌어, 초라 유체 유량에 의해 접합 잠재적 변화의 포화 값을 추정한다. 이어서, 입욕액에서 염화물 농도를 변경하고, 접합 전위 염화물 농도 관계를 그립니다. 유체 속도는 일정해야 하며, 인접한 은은 염화물 기준 전극의 염화물 농도감소를 방지하기에 충분히 높어야 한다.
두 관계 곡선에서, 측정 된 접합 전위 변화에서 염화물 농도의 변화를 추정한다. VDCC-L 전류는 효소분산된 쥐 막질 동맥 근세포에 기록되었으며, nystatin 천공 패치 클램프 레코딩이 기록되었다. 아가로즈 칼륨 염화칼륨 다리를 사용하면 기준 전극과 입욕 용액 사이의 접합 전위가 최소화될 수 있으며 유체 흐름은 VDCC-L 전류의 전압을 독립적으로 증가시켰습니다.
그러나, 은은염화물 기준 전극이 염화화칼륨 교량 없이, 유동염수 없이, 입체에 직접 연결되었을 때, 유체 유량의 존재하에 있는 IV 관계는 정적인 조건하에서 VDCC-L 전류에 비해 오른쪽으로 이동한다. 아가로즈 다리를 가진 쥐 배혈백혈병 세포에 기록된 Kerr 2.1 전류의 유체 유동 유도 증가는, 교반되지 않은 층 효과에 의해 설명될 수 있다. 개발 후,이 기술은 전기 생리학을 통해 연구자들을위한 길을 열었습니다.
따라서 이온 채널 전류의 유체 흐름 조절을 위한 것입니다. 전기 화학 현상의 관점에서, 세포막 표면에서 교반되지 않은 경계 층에서.
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개요
본 논문은 유체 흐름을 정확하게 측정하는 것의 중요성과 그것이 기계적 자극 민감성 이온 채널에 미치는 영향에 대해 논합니다. 또한 실험 프로토콜에서 발생할 수 있는 오류를 방지하고 수정하는 방법을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 전기생리학
- 기계적 자극 민감성 이온 채널
- 유체역학
배경
- 기계적 자극에 대한 세포 반응을 이해하는 데 있어 기계 민감성 이온 채널은 매우 중요합니다.
- 유체 흐름 측정 시 발생하는 오류는 이온 채널의 거동에 대한 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다.
- 패치 클램프 기록법은 이러한 연구에 흔히 사용되는 기술입니다.
- 정확한 데이터 해석을 위해서는 비교란 경계층을 이해하는 것이 필수적입니다.
연구 목적
- 이온 채널에 미치는 유체 흐름 효과를 정확하게 측정하는 방법을 제공합니다.
- 기존 실험 프로토콜의 잠재적 오류를 강조합니다.
- 막 표면 부근의 이온 농도 역학에 대한 이해를 높입니다.
사용된 방법
- 유체 흐름 측정을 위한 U자형 가열 유리 모세관의 활용.
- 기록용 브릿지 제작을 위한 염화칼륨 내 아가로스 용해.
- 적절한 점도를 확보하기 위한 아가로스 용액 가열.
- 효과적인 이온 전류 기록을 위해 브릿지에 염화칼륨 아가로스 충진.
주요 결과
- 제안된 방법들은 유체 흐름 측정의 정확도를 향상시킵니다.
- 수정된 프로토콜을 통해 이온 채널 조절에 대한 이해도를 높일 수 있습니다.
- 비교란 경계층 내의 이온 농도 추정이 수행되었습니다.
- 결과는 정밀한 실험 설정의 중요성을 입증합니다.
결론
- 기계적 자극 민감성 이온 채널을 연구하는 데 있어 정확한 측정 기술은 매우 중요합니다.
- 적절한 프로토콜을 통해 유체 흐름 조절 시 발생하는 오차를 최소화할 수 있습니다.
- 본 연구는 실험 방법을 개선함으로써 전기생리학 분야에 기여합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
정지 경계층(unstirred boundary layer) 내의 이온 농도를 정확하게 측정하는 것은 이온 채널 개폐에 미치는 유체 흐름 효과를 신뢰성 있게 해석하는 데 매우 중요합니다. 본 방법은 전기생리학 연구의 실험적 아티팩트를 해결하여, 기계적 자극 민감성 이온 채널 연구의 표적 검증을 위한 데이터 품질을 향상시킵니다. 또한 액간 전위(junction potential) 변화를 보정함으로써 유체 전단 응답의 전임상 모델에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 실제 이온 채널 조절과 유체 흐름으로 인한 아티팩트를 구분함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 전기생리학적 판독 값의 신호 대 잡음비(signal-to-noise)를 개선하여 기능적 표적 검증을 지원합니다.
- 예측적 가치: 정지층(unstirred layer) 효과로 인한 위양성을 줄여 리드 물질 식별의 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 막 근처의 이온 농도 측정값을 안정화하여 하위 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 재현성: 패치 클램프 분석의 주요 변동 요인을 해결하여 연구실 간의 분석 표준화를 지원합니다.
- 정량적 출력: 비교란 경계층(unstirred boundary layer) 내의 실제 이온 농도 측정을 가능하게 하여 농도-반응 관계의 정확도를 향상시킵니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 일관된 이온 환경 모델링을 보장함으로써 발견 단계의 전기생리학을 전임상 검증과 연결합니다.
- 기전적 리스크 감소: 관찰된 이온 채널 변화가 직접적인 기계적 민감성에 의한 것인지, 아니면 2차적인 이온 고갈 효과에 의한 것인지를 명확히 합니다.
- 리스크 조정 추진: 전임상 효능 및 안전성 신호의 신뢰도를 높여 go/no-go 결정에 필요한 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 타겟 검증부터 리드 최적화, 전임상 평가에 이르는 발굴 연속 과정에 적합하며, 특히 기계적 자극에 의해 조절되는 이온 채널에 유용합니다.
- 발견 생물학: 유체 흐름 실험에서 이온 농도 변화의 기여도와 직접적인 채널 개폐의 기여도를 분리함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 흐름 민감성 이온 채널을 타겟으로 하는 화합물을 평가할 때 분석 준비도와 재현성을 향상시킵니다.
- 분석: 경계층 이온 농도 추정을 가능하게 하는 정량적인 접합 전위 변화 측정값을 제공합니다.
- 중개 연구: in vitro 이온 채널 반응이 생리학적으로 유의미한 조건을 반영하도록 하여 전임상 연속성을 개선합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 치료 영역에 걸쳐 모든 기계적 민감성 이온 채널 타겟을 연구할 수 있는 재사용 가능한 전기생리학적 역량을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 정체층 효과(unstirred layer effects)를 고려함으로써 이온 채널 조절 연구의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운용적 가치: 유체 흐름 조건에서의 패치 클램프(patch-clamp) 실험의 재현성과 표준화를 높입니다.
- 전략적 가치: 가공의 데이터로 인한 후속 연구의 실패를 줄여 자본 효율성을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 더 신뢰할 수 있는 기전적 데이터를 바탕으로 이온 채널 타겟의 위험 조정 우선순위 설정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 유량 제어 및 접합 전위 측정을 적절히 수행하기 위해 전기생리학 및 유체역학에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 정밀한 유량 제어와 전류 클램프 모드에서의 전압 클램프 기록이 가능한 장비가 필요합니다.
- 아가로스 브리지 준비 및 배양액 조성에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 해당 방법을 서로 다른 세포 유형이나 이온 통로 표적에 적용할 때 적응 관련 고려 사항이 수반됩니다.
- 기준 전극 근처의 염화물 고갈을 방지하기 위해 충분히 높은 유량을 유지해야 하는 등의 실질적인 제한 사항이 포함됩니다.
바이오제약 자주 묻는 질문(FAQs)
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
Agarose Salt Bridges Between the Bath Solution and Reference Electrode
1:29
Application of Fluid Flow Shear Force to Cells in a Patch-Clamping Chamber
2:21
Measuring Changes in Liquid-Metal Junction Potential
3:18
Experimental Estimation of Real Chloride Concentration
4:07
Results: Effects of Fluid Flow on L-type VDCCL and Kir2.1 Currents With and Without Agarose 3 M KCl Bridge
5:14
Conclusion
