Name: 오픈 패치 클램프 피 펫과 Unstirred 경계 층에 이온 농도의 측정: 유체에 의해 이온 채널의 제어 의미 흐름 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 배우세요 오픈 패치 클램프 기법을 활용한 유체 흐름 조절이 이온 채널에 미치는 영향을 정확히 측정하는 방법을. U자형 모세관과 아가로즈 브리지를 사용하여 막 표면의 비교류 경계층 이온 농도를 추정하고, 기계수용성 이온 채널 연구의 정확성을 향상시킵니다.

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이 연구 프로그램에 의해 기본 과학 연구 (2015R1C1A1A02036887 및 2016R1A2B4014795 NRF) 연구 재단의 국립 과학, 정보 통신의 내각에 의해 투자를 통해 파이 오 니 아 연구 센터 프로그램 (2011-0027921)에 의해 지원 되었다 & 미래 계획, 보건 복지, 한국 공화국 (HI15C1540)에 의해 한국 건강 기술 R & D 프로젝트 통해는 한국 보건 산업 개발 연구소 (진흥원)의 교부 금에 의해 투자 하 고.

모든 실험은 건국대의 기관 지침에 따라 수행 했다.
1. Agarose 소금 교량 목욕 솔루션 및 Ag/AgCl 기준 전극 사이
참고: Agarose 3m KCl 염 다리 이전 생산12 사소한 변형을 설명 합니다.
<ol><li>다리의 형성<ol>
<li>적절 한 U 자형을 형성 화재 유리 모 세관 튜브 벤드. 모세 혈관의 내경 큰 이온 전류를 기록할 때 직렬 저항을 줄이기 위한 충분히 큰 해야 합니다. 2-5 m m 내부 직경 튜브는 일반적으로 허용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agarose 3m KCl 솔루션의 준비<ol>
<li>100 mL 3 M KCl 해결책의 준비 (1 또는 2 M 하 셔도 됩니다).</li>
		<li>Agarose의 3 g의 무게.</li>
		<li>90와 100 ° C 사이 뜨거운 접시에 KCl (즉, 3 %agarose) 100 mL에 agarose를 녹</li>
	</ol>
</li>
	<li>3m KCl agarose와 브리지 로드<ol>
<li>쉽게 로드 agarose KCl 해결책에 U 자 모양의 유리 다리를 담가. 참고: 그것은 agarose KCl 솔루션 얕 고 넓은 컨테이너에 포함 되어 있으면 유리 다리를 찾아 쉽습니다.</li>
		<li>하룻밤 실 온 (RT) agarose 설정 및 강화를 위한 계속 그들.</li>
		<li>Agarose KCl 로드 유리 다리 세트/강화 agarose-소금에서 신중 하 게 찾아.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다리를 저장<ol>
<li>준비 하는 충분 한 볼륨 (즉, 500ml) 넓은 센 병에 3 M KCl 해결책의.</li>
		<li>냉장고에 있는 병에 준비한 agarose 소금 다리를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 셀 패치 클램핑 챔버에 유체 흐름 전단 력의 응용
참고: 패치 클램프 실험 설정의 회로도 그림 1에 표시 됩니다.
<ol><li>장소 컨테이너 로드 목욕 솔루션 (볼륨 및 높이 측정 해야 합니다 이미) 패치 클램프 챔버 위에.</li>
	<li>튜브를 suctioning 여 입욕 솔루션 패치 클램프 챔버를 채우십시오.</li>
	<li>유체 흐름을 중지, 유체 흐름을 차단 하도록 컨테이너의 측면에서 튜브 클립 다음 중지 동시에 흡입 하는 흡입 쪽에 튜브를 클립 합니다. 이것은 "고정" 제어 상태 이다.</li>
	<li>유체 흐름 전단 힘을 적용 하기 위해 동시에 컨테이너와 흡입 측에 두 튜브를 엽니다.</li>
	<li>전에 또는 유체 흐름 전단 힘 셀에 적용 한 후, mL/min의 유량을 측정 합니다.</li>
	<li>주어진된 시간 동안 유체 볼륨에서 감소를 측정 하 여 유량을 계산 합니다.</li>
	<li>측정 된 유량과 입욕 챔버의 형상 (구조)에서 유체 흐름에 의해 셀에 적용 되는 전단 힘 (토론 섹션 참조) 추정 한다.</li>
	<li>또는, (단계 2.3-2.6)에 대 한 유량 제어, 관류 펌프를 사용 합니다. 이 경우에 상수 타악기 흐름 보다는 되도록 주의 해야 합니다.</li>
</ol>3. 목욕 솔루션 및 (그림 3A) Ag/AgCl 기준 전극 사이의 유체 흐름에 의해 액체 금속 접합 잠재력에 변화를 측정
<ol><li>Ag/AgCl 전극 또는 펠 릿, agarose 소금 다리 없이 기성 품 제품에서 사용할 수 있는 사용 합니다.</li>
	<li>(예를 들어, 143 m m NaCl, 5.4 m m KCl, 0.33 m m NaH2포4, 5 mM HEPES, 0.5 m m MgCl2, 1.8 m m CaCl2, 11 m m D-포도 당, pH 7.4 NaOH로 조정) 입욕 약 실에 대 한 일반적인 생리 소금 염 분을 준비 합니다.</li>
	<li>피 펫 및 입욕 솔루션 사이 접합 잠재적인 변화를 최소화 하기 위해 챔버에 3m KCl 솔루션을 포함 하는 패치 피 펫을 놓습니다.</li>
	<li>전압 클램프 증폭기 전류 클램프 모드를 수정 ("I = 0" 또는 "참조").</li>
	<li>초기 오프셋된 잠재력을 nullifying, 후 다양 한 유량에 의해 유도 된 전압 변화를 측정 합니다.</li>
	<li>전압 변화 액체/금속 접합 잠재력을 확인, 다시 목욕 솔루션 및 Ag/AgCl 전극 사이 agarose 소금 다리를 사용 하 여 접합 잠재력에 유체 흐름의 효과 검사 합니다.</li>
</ol>4. 실험 Unstirred 층 (그림 3B) 정적 조건 Ag/AgCl 전극에 인접 한에서 진짜 Cl- 농도 추정
<ol><li>3 단계의 결과에서 접합 잠재력-유량 관계 그리고 위에 유체 흐름 속도 의해 접합 잠재적인 변화의 최대한 (채도) 값을 추정.</li>
	<li>Cl의 다양 한 농도와 솔루션 준비 (즉, 50, 99, 147, 195, 및 NaCl의 288 m m).</li>
	<li>Cl- 입욕 액체의 농도 변경 하 여 접합 잠재적인-[Cl-] 관계를 그립니다. 일정 하 고 충분히 높은 유체 속도 수 한다 (> 30 mL/min) 인접 한 Ag/AgCl 기준 전극의 Cl- 농도의 감소를 방지 하기 위해.</li>
	<li>두 관계 곡선에서 측정 된 접합 잠재적인 변화에서 Cl- 농도 변화 예상.</li>
</ol>

<ol><li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li>
<li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li>
<li>Langille, B. L., O’Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li>
<li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+mechanically+activated+ion+channel%2C+is+required+for+vascular+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li>
<li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV4-mediated+endothelial+Ca2%2B+influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li>
<li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2%2B+channel+via+enhancement+of+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%2B+current+by+convectively+restoring+%5BK%2B%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585(2016).</li>
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<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li>
<li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2%2B+channel+activation+in+vascular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li>
<li>A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from:
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<li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 우리는 오픈 패치 클램프 피 펫이 높은 KCl로 가득와 잠재적인 액체 금속 접합을 결정 하 여 Ag/AgCl 기준 전극에 인접 한 unstirred 층에 진짜 Cl- 농도 측정 하는 방법을 시연 농도입니다. 경계 층에 Cl- 농도 변화 접합 잠재력의 변화 유체 흐름 조건에 정적에서 전환할 때 발생할 수 있습니다. 단순히 참조 전극과 입욕 액체 사이 KCl 다리는 agarose를 사용 하 여 패치 클램프 기록 중 Cl- 농도 관련 된 오류 또는 아티팩트 방지할 수 있습니다.
한 천 또는 agarose 소금 다리의 중요성을 강조, 게다가 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 추정에이 방법의 또 다른 응용 프로그램은 다음과 같습니다. Plasmalemmal 이온 채널 unstirred 경계에 진짜 이온 농도 (마찬가지로, Ag/AgCl 전극 기능 같은 Cl- 전극), 이온 선택적인 전극으...

유체 흐름은 유체 흐름을 이용한 혈관 확장 및 유체 전단 힘 종속 혈관 개장 및 개발1,2,등 많은 생리와 병 적인 프로세스를 제어 하는 중요 한 환경 큐 3,,45. 유체 흐름 전단 힘에 생물학 응답에 대 한 분자 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 이온 채널 게이팅의 유체 흐름 중재 규칙 유체 흐름 유도 응답5 비판적으로 기여할 수 있다고 믿고 , 6 , 7 , 8. 내 피 안쪽 정류기 Kir2.1 및 캘리포니아2 +의 예를 들어 활성화-활성화 된 K+ (KCa2.3, KCNN3) 채널 Ca2 + 유입 유체 흐름에 의해 액체에 기여할 제안 되었습니다 후 흐름 유도 혈관6,,78. 따라서, 많은 이온 채널, 특히 기계적으로 활성화 또는-저해 채널, 패치 클램프 기술6,,910 유체 흐름/전단 힘 감도 측면에서 연구 , 그러나 11., 수에 따라 실험 프로토콜 패치 클램프 기록 동안 수행, 결과 및 유체 흐름-이온 채널의 규정에 있는 데이터의 해석 잘못10,11.
유체 흐름 유도 아티팩트 패치 클램프 기록에의 한 소스는 목욕 및 Ag/AgCl 기준 전극11사이 잠재적인 교차점에서 이다. 그것은 일반적으로 믿고 그 입욕 액체와 Ag/AgCl 전극 사이 잠재적인 액체/금속 접합 일정 입욕 액체의 Cl- 농도 일정 유지는 입욕 솔루션 사이의 화학 반응 고려 그리고 되도록 Ag/AgCl 전극:
Ag + Cl-↔ AgCl + 전자 (e-) (공식 1)
그러나, 입욕 솔루션 및 Ag/AgCl 기준 전극 (공식 1) 사이 전반적인 전기 화학 반응 왼쪽에서 오른쪽으로 진행 하는 경우, Ag/AgCl에 인접 한 입욕 액체의 Cl- 농도 참조 충분 한 convectional 전송 보장 하지 않는 한 전극 (unstirred 경계 층12,13,,1415) 솔루션, 목욕의 대부분에서 그 보다 훨씬 낮은 수 있습니다. 이전 또는 비 이상적 Ag/AgCl 전극 Ag의 부적당 한 염소와 함께 사용 하 여 이러한 위험을 증가할 수 있습니다. 이 유체 흐름 관련 아티팩트 참조 전극, 사실,에서 단순히 입욕 액체 및 참조 사이 기존의 agarose 소금 다리를 배치 하 여 제외할 수 있습니다 전극, 유물 진짜 Cl- 에서 변경에 기반 Ag/AgCl 전극11에 인접 한 농도. 이 연구에서 제시 하는 프로토콜 흐름 관련 접합 잠재적인 변화를 방지 하 고 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하는 방법을 설명 합니다.
Agarose KCl 입욕 액체 및 Ag/AgCl 기준 전극 사이 다리를 놓은 후 고려해 야 하는 또 다른 중요 한 요소 이다: 참조로 그냥 Ag/AgCl 전극 역할 Cl- 전극, 이온 채널 또한 기능을 할 수 같은 이온 선택적인 전극. 입욕 액체와 Ag/AgCl 기준 전극 사이 unstirred 경계 층의 상황 막 이온 채널을 통해 세포 외 및 세포내 솔루션 사이 이온의 운동을 하는 동안 발생합니다. 이 유체 흐름에 의해 채널 이온의 규정을 해석 하는 때 주의 사용 해야 함을 의미 합니다. 우리의 이전 연구11에서 설명 했 듯이, 전기 화학 기온 변화도 존재 하는 솔루션을 통해 이온의 운동 3 가지 메커니즘을 통해 발생할 수 있습니다: 확산, 마이그레이션, 및 대류, 어디 확산 운동 이다 농도 기온 변화도 의해 유도 된 마이그레이션 전기 기온 변화도 의해 구동 하는 운동 이며 대류 유체 흐름을 통해 운동 이다. 이러한 세 가지 전송 메커니즘 가운데 대류 모드 대부분 이온11 (> 1000 번 유포 또는 일반적인 패치 클램프 설정 마이그레이션 보다)의 운동에 공헌 한다. 이 왜 입욕 액체와 Ag/AgCl 기준 전극 사이 잠재적인 연결 수 매우 다른 정적 및 유체 흐름 조건11의 이론적인 기초를 형성 합니다.
위에서 제안 된 가설에 의하여 현재 이온 채널에 유체 흐름의 어떤 facilitatory 효과 진짜 이온 농도 막 표면 (unstirred 경계 층)에 채널 입구에 인접 한의 대류 복원에서 유추 될 수 10.이 경우에, 이온 채널 전류에 대 한 유체 흐름 유도 효과 단순히 발현 이온 채널 게이팅의 규제 안에서 전기 이벤트에서. 비슷한 생각 이전 배리와 동료12,13,,1415 엄격한 이론적인 고려 사항 및 실험적 증거, 일컬어 unstirred 층에 따라 의해 제안 되었다 또는 전송 번호 효과입니다. 단일 채널 전도도 충분 한 전송 채널 (unstirred 멤브레인 표면에 보다 막에서 빠른 전송 속도), 속도 경계층 효과 제공 하기 위해 충분히 오픈 시간 발생할 수 있습니다 일부 이온 채널 충분 한 경우 . 따라서, 대류 종속 전송 최종 유체 흐름 유도 자와 이온 현재10,12,13,,1415에 기여할 수 있다.
우리는 한 천 또는 agarose를 사용 하 여의 중요성을 강조 하는이 연구에서 이온의 유체 흐름 유도 규칙을 공부 하는 동안 소금 브리지. 우리는 또한 Ag/AgCl 기준 전극 및 막 이온 채널에 인접 한 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하기 위한 방법을 제공 합니다. 또한, 이온 채널 전류 (즉, 대류 가설 또는 unstirred 층 전송 번호 효과)의 유체 흐름을 이용한 변조의 이론적 해석 설계 하 고 해석 하는 연구에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 전단 힘-규칙 이온 채널의. 우리 경우 이온 채널 전류 막 이온 채널의 모든 종류를 통해 유체 흐름, 유체 흐름 전단 힘만을 그들의 생물 학적 감도의 독립에 의해 촉진 될 수 있다 예측 unstirred 경계 층 전송 번호 효과 따라 이온 채널 충분 한 단일 채널 전도도 긴 오픈-시간이 있다. 높은 이온 채널 전류 밀도 세포 막 표면에 unstirred 경계층 효과 높일 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RC-11 개방형 목욕 챔버</td><td>워너 인스트루먼트, 미국</td><td>W4 64-0307</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl 전극 펠렛</td><td>세계 정밀 기기, 미국</td><td>EP1</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치, 미국</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>전압 클램프 증폭기</td><td>HEKA, 독일</td><td>EPC8</td><td></td></tr><tr><td>전압 클램프 증폭기</td><td>분자 장치, 미국</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>액체 펌프</td><td>KNF Flodos, 스위스</td><td>FEM08</td><td></td></tr></tbody></table>

오픈 패치 클램프 피 펫과 unstirred 경계 층에 이온 농도의 측정: 유체에 의해 이온 채널의 제어 의미 흐름

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

유체 흐름은 유체 흐름을 이용한 혈관 확장 등 많은 생리와 병리학 과정을 제어 하는 중요 한 환경 자극. 유체 흐름/전단 힘에 생물학 응답에 대 한 분자 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 이온 채널 게이팅의 유체 흐름 중재 규정은 비판적으로 기여할 수 있습니다. 따라서, 이온 채널의 유체 흐름/전단 힘 감도 패치 클램프 기술을 사용 하 여 공부 되었습니다 했다. 그러나, 실험 프로토콜에 따라 결과 및 해석 데이터의 수 잘못 된. 우리가 유체 흐름 관련 오류에 대 한 실험 및 이론적인 증거를 제시 하는 여기, 예측, 예방, 및 이러한 오류를 수정에 대 한 메서드를 제공 하 고. Ag/AgCl 기준 전극과 입욕 액체 사이 잠재적인 연결에 변화 3 M KCl. 유체 흐름 수 가득한 오픈 피 펫으로 측정 되었다 다음 액체/금속 접합 약 7 잠재적인 뮤직 비디오를 이동 합니다. 반대로, 유체 흐름에 의해 유도 된 전압 변화를 측정 하 여 우리 unstirred 경계 층의 이온 농도 추정. 정적 상태에서 실제 이온 농도 Ag/AgCl 기준 전극 또는 이온 채널 인렛에 세포 막 표면에 인접 한 낮은 흐름 상태에서의 30%로 약으로 도달할 수 있습니다. 배치는 agarose 3 M KCl 다리 입욕 및 참조 전극 사이 접합 잠재적인 이동의이 문제를 방지 할 수 있습니다. 그러나, unstirred 레이어 효과 세포 막 표면에 인접 한이 방법으로 해결할 수 없습니다. 여기, 우리는 이온 전류의 유체 흐름 유도 규칙을 공부 하는 동안 agarose 소금 브리지를 사용 하 여의 중요성을 강조 오픈 패치 클램프 피 펫과 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하기 위한 방법을 제공 합니다. 따라서, unstirred 경계 층에 이온의 실제 농도 고려이 새로운 접근 방식을 실험 설계 및 이온 채널의 유체 전단 응력 규제 관련 데이터 해석에 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다. .

전체 셀 전압 종속 L 유형 캘리포니아2 + 채널 (VDCCL) 전류는 앞에서 설명한11로 효소 분산된 쥐 mesenteric 동맥 myocytes에 기록 되었다. 동맥 myocytes divalent 양이온 무료 입욕 솔루션 VDCCL11,16을 통해 현재의 흐름을 촉진 하기 위하여 nystatin 천공 구성에서 Cs 풍부한 피 펫 솔루션 dialyzed 했다. Depolarizing 전압 램프 또는-70의 지주 잠재력에 전압 단계 간단한 mV, VDCCL 전류 유도에 적용 했다. 대표 전류-전압 (I-V) VDCCL 부재에는 agarose KCl 다리와 기록 (5 mL/min 또는 약 0.004 m/s), 유...

Mechanosensitive 이온 채널은 종종 패치 클램프 기록 유체 흐름/전단 힘 감도 측면에서 공부 했다. 그러나, 실험 프로토콜에 따라 이온 채널의 유체 흐름 규정에 결과 잘못 된 수 있습니다. 여기, 우리는 방지 하 고 이론적 근거와 이러한 오류에 대 한 메서드를 제공 합니다.

오픈 패치 클램프 피 펫과 Unstirred 경계 층에 이온 농도의 측정: 유체에 의해 이온 채널의 제어 의미 흐름

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

이 제출은 이온 채널의 단지 규정에 있는 액체 흐름과 같은 전기 생리적인 구체에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이온 채널의 유체 흐름 조절과 관련된 데이터 해석을 위해 멤브레인 표면의 교반되지 않은 경계 층에서 실제 이온 농도를 추정할 수 있다는 것이다. 이 절차를 시작하려면 발사 유리 모세관 튜브를 구부려 U 모양을 형성합니다.모세관의 내경은 큰 이온 전류를 기록할 때 계열 저항을 감소시키기에 충분합니다. 다음으로, 3개의 어금니 칼륨염100밀리리터에 아가로즈 3그램을 녹이고, 90~100°C 사이의 핫 플레이트에 놓습니다. 그런 다음, 용액에 유리 다리를 침지하여 염화 칼륨 아가로즈와 다리를적재합니다.아가로즈가 설정되고 굳어질 수 있도록 밤새 실온에서 보관하십시오. 다음 날, 경화 아가로즈 소금에서 염화칼륨이 실린 유리 다리를 조심스럽게 파고들수 있습니다. 다리를 냉장고에 3개의 어금니 칼륨을 넓은 목에 담아 보관하십시오.이 절차에서, 패치 클램프 챔버 위에, 목욕 용액로드 용기를 배치합니다. 다음으로, 튜브를 흡입하여 입욕 용액으로 패치 클램프 챔버를 채웁니다. 유체 흐름을 중지하려면 용기 측의 튜브를 잘라 유체 흐름을 차단합니다.그런 다음 흡입 측에서 튜브를 잘라 흡입을 동시에 중지합니다. 고정 제어 상태입니다. 유체 흐름 전단 힘을 적용하려면 용기와 흡입 측면에 두 튜브를 동시에 엽니다.유체 흐름 전단력을 셀에 적용하기 전이나 후에 지정된 시간에 걸쳐 유체 부피의 감소를 측정하여 분당 밀리리터의 유량을 계산합니다. 액체 금속 접합 전위의 변화를 측정하려면, 목욕 챔버에 대한 정상적인 생리염 식염수를 준비하고, 염화 칼륨 다리의 부재와 존재에서 그들을 비교한다. 다음으로, 3개의 어금니 칼륨 염화물 용액을 포함하는 패치 파이펫을 챔버에 놓고 파이펫과 입욕 용액 사이의 접합 전위 이동을 최소화한다.그런 다음 전압 클램프 증폭기를 현재 클램프 모드로 설정합니다. 초기 오프셋 전위를 무효화한 후 유량의 변화에 따라 유도되는 전압의 변화를 측정합니다. 전압의 변화가 액체 금속 접합 전위인지 확인하려면 목욕 용액과 기준 전극 사이의 아가로즈 염교를 사용하여 접합 전위유체 흐름의 효과를 다시 검사합니다.액체 금속 접합 전위의 변화의 결과로, 기능 잠재적 유량 관계를 끌어, 초라 유체 유량에 의해 접합 잠재적 변화의 포화 값을 추정한다. 이어서, 입욕액에서 염화물 농도를

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

막 단백질 기능은 세포막의 지질 성분에 의해 규제됩니다. 이 비디오 - 문서 변경 막 속성의 기자로 이중층 패치 전극뿐만 아니라 사용하는 방법으로 그램이시딘 채널을 사용하여 패치를 형성하는 방법 세부 사항.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

세포막의 수송체는 세포막 또는 세포층을 가로질러 이온을 차등적으로 분리할 수 있으며 조직 생리학, 복구 및 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 우리는 생체 내에서 단일 세포 및 조직에서 특정 이온 플럭스를 측정할 수 있는 이온 선택적 자체 참조 미세전극에 대해 설명합니다.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

이 프로토콜은 수동 endolysomal patch-clamp system을 사용하여 세포 내 소포의 이온 채널 활성을 직접 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 엔도리소좀(endolysosome)을 확대하고 이러한 소포를 수동으로 분리하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 절차를 정확하게 복제하고 적용할 수 있습니다.

단일 Endolysosomal 소포 분석을 위한 Patch-Clamp 기법

이 원고는 패치 클램프 기록을 위해 온전한 등쪽 뿌리 신경절을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 제제는 뉴런과 위성 신경교세포의 미세환경을 유지하여 해리된 DRG 뉴런에서 볼 수 있는 표현형 및 기능적 변화를 방지합니다.

성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음

배우세요 오픈 패치 클램프 기법을 활용한 유체 흐름 조절이 이온 채널에 미치는 영향을 정확히 측정하는 방법을. U자형 모세관과 아가로즈 브리지를 사용하여 막 표면의 비교류 경계층 이온 농도를 추정하고, 기계수용성 이온 채널 연구의 정확성을 향상시킵니다.

오픈 패치 클램프 피 펫과 Unstirred 경계 층에 이온 농도의 측정: 유체에 의해 이온 채널의 제어 의미 흐름

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