Name: 시각화 Axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 배우세요 아밀로이드-β가 배아 마우스 대뇌피질 신경원의 축삭 성장 원추를 붕괴시키는 메커니즘을 시각화하는 방법을. 이 기술은 알츠하이머병의 초기 병리 현상을 연구하는 데 필수적입니다.

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이 작품은 부분적으로 JSP에서 연구 보조금 지원 (KAKENHI 18 K 07389), 일본, 다케다 과학 재단, 일본, 그리고 고바야시 제약, 일본.

모든 실험 관심과 도야마 대학 스기타 캠퍼스에서 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 실시 했다 및 동물 관리 및 사용의 실험실 동물의 스기타 캠퍼스에 대 한 위원회에 의해 승인 된 대학교의 도야마 (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. 붕괴 분석 결과
<ol><li>폴 리-D-리 코팅<ol>
<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 5 μ g/mL 폴 리-D-라이 신 (PDL)의 400 μ와 8 잘 문화 슬라이드 코트 하 고 37 ° C에서 밤새 그들을 품 어.</li>
		<li>PDL 솔루션을 제거 하 고 세척 3 번 증류수와 우물.</li>
	</ol>
</li>
	<li>신경 문화24<ol>
<li>신경 문화 매체 12% 말 혈 청, 포도 당 0.6%, 그리고 2 mM L-글루타민 (중형 A) microscissors와 배아 하루 14 (E14) ddY 쥐에서 갓 고립된 대뇌 외피가 말하다. 항생제를 추가 하지 마십시오. 참고:이 프로토콜 ddY 마우스 사용 됩니다. 이것은 일본에서 일반적으로 사용 되는 outbred 긴장 이다. 이 신경 세포 문화 프로토콜 쥐 대뇌 피 질의 뉴런7,25도 적용할 수 있습니다.</li>
		<li>3 분 87 x g에서 조직 원심</li>
		<li>제거는 상쾌한. 다음은 펠 릿 0.05 %trypsin 2 개 mL를 추가 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어 매 5 분을 활용 하 여 혼합.</li>
		<li>활용 하 여 매체와 혼합의 4 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>178 x g 3 분에 조직 원심</li>
		<li>상쾌한, 제거 하 고 품 어 어 0.3 mg/mL 콩 트립 신 억제 물에에서 녹아 있는 PBS 37 ° c.에 15 분 동안 600 U/mL DNase와 조직 매 5 분을 활용 하 여 혼합.</li>
		<li>부 화, 후 두 드려서 중간 A와 섞어 4 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>178 x g 3 분에 조직 원심</li>
		<li>제거한 후에 상쾌한, 매체 A의 4 mL를 추가 하 고 세련 된 파스퇴르 피 펫과 조직 triturate.</li>
		<li>70 µ m 기 공 크기 메쉬 triturated 조직 필터링. 여과 후 한 hemocytometer 셀의 밀도 계산 합니다.</li>
		<li>문화 8 잘 문화에서 셀 104 셀/잘 매체 A와 x 0.8에 슬라이드 하 고 37 ° c.에 10% CO2 의 습도 분위기와 CO2 배양 기에서 그들을 유지 하는 것</li>
		<li>후 경작의 4 h, 0.6% 포도 당, 신경 문화와 2 mM L-글루타민 (매체 B)에 대 한 포함 한 2% 보충으로 문화 매체를 교체 합니다. 참고: 뉴런의 순수성은 약 75%,26위에서 설명한 대로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>붕괴 분석 결과27<ol>
<li>상업적으로 얻은 전장 녹말 체 β1-42 (Aβ1-42) 0.5 m m의 농도에서 증류수에 녹이 고 7 일 동안 37 ° C에서 품 어. 부 화 후 사용까지 사용-30 ° C 냉동 고에서 집계 된 Aβ1-42 솔루션을 저장 합니다. 참고:이 외피는 집계 및 Aβ27,,2829,30의 독성에 필요 합니다.</li>
		<li>신경 문화 4 일 새로운 매체 B의 100 μ와 우물, 치료 후 1 시간에 대 한 Aβ1-42 또는 차량 솔루션 (증류수) 집계 0.5 μ M를 포함. 참고: Aβ1-42의 효과 했다 복용량 의존 5 μ M, 0.1에서 증가 하 고 앞에서 설명한270.5 μ M에서 정점. Aβ1-42 신경 문화31의 3 일 후 1 시간에 대 한 치료에 의해 때 비슷한 결과 관찰할 수 있습니다.</li>
		<li>문화 매체를 제거 하 고 즉시 뜨거운 접시에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 PBS에 4% 자당을 포함 하는 4 %paraformaldehyde 뉴런을 수정.</li>
		<li>고정, 후 PBS로 3 회 신경 세척 하 고 수성 설치 매체와 함께 탑재. 2-4 일 동안 4 ° C에서 설치 매체를 건조.</li>
		<li>각에 거꾸로 한 현미경 20 X 건조 목적 렌즈의 전체 지역을 (7.8 x 9 m m2)를 캡처하십시오.</li>
		<li>앞에서 설명한32,33단계 3 또는 4로 축 삭, 각 뉴런의 긴 neurites를 분류 합니다.</li>
		<li>다음 기준에 따라 성장 콘 분류: 1) axonal 성장 콘 lamellipodia 부족 또는 2) 3 filopodia를 가진 것으로 간주 됩니다 축소 성장 콘,17설명한 대로. 참고: 건강 한 성장 콘; 0 점으로 득점 하 축소 된 성장 콘 1 점으로 득점 된다. 각 치료에 대 한 점수 계산 하는 붕괴를 의미 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 아 밀 로이드 β Immunostaining
<ol><li>1.2 단계에서 설명한 대로 3 일 동안 마우스 대뇌 피 질의 뉴런을 문화.</li>
	<li>집계 된 Aβ1-42와 치료 (5 μ M) 또는 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 차량.</li>
	<li>매체를 제거 하지 않고 4 %paraformaldehyde 포함 하는 각 음에 PBS에 4% 자당의 동일한 볼륨을 추가 하 고 5 분 동안 뜨거운 접시에 37 ° C에서 문화를 유지.</li>
	<li>PBS에 4% 자당을 포함 하는 4 %paraformaldehyde 400 μ와 솔루션을 교체 하 고 1 시간에 대 한 핫 플레이트에 37 ° C에서 유지. 이 기정 프로토콜 이전 보고서34에서 수정 되었습니다.</li>
	<li>3 회 PBS 가진 뉴런을 씻어.</li>
	<li>PBS에서 5% 정상 염소 혈 청으로 차단 합니다.</li>
	<li>마우스 방지 아 밀 로이드 β 면역 글로불린 G와 뉴런 (IgG) (1:50) 및 1% 소 혈 청 알 부 민 PBS에 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>3 회 PBS 가진 뉴런을 씻어.</li>
	<li>형광 활용 된 이차 항 체 (1:400)와 1% 소 혈 청 알 부 민 PBS에서 2 h에 대 한 실 온에서 뉴런을 품 어.</li>
	<li>3 회 PBS 가진 뉴런을 세척 하 고 수성 설치 매체와 함께 탑재.</li>
	<li>거꾸로 현미경 B.에 40 X 건조 대물 렌즈를 사용 하 여 형광 이미지와 간접 조명으로 밝은 필드 이미지 캡처</li>
</ol>3. axonal Immunostaining27
<ol><li>1.3.3 단계에서 설명한 대로 교양된 신경 고정 후 PBS로 3 회 신경을 씻어.</li>
	<li>마우스 반대로 tau-1 뉴런을 품 어 IgG (1: 500), 토끼 방지 microtubule 관련된 단백질 2 (MAP2) 5% 정상 염소 혈 청, 그리고 0.3 %t -octylphenoxypoly-ethoxyethanol PBS에 4 ° c 하룻밤에 IgG (1: 500).</li>
	<li>3 회 PBS 가진 뉴런을 씻어.</li>
	<li>형광 활용 된 이차 항 체 (1:400)와 0.3 %t -octylphenoxypolyethoxyethanol PBS에 2 h에 대 한 실 온에서 뉴런을 품 어.</li>
	<li>3 회와 함께 PBS, 뉴런을 세척 하 고 수성 설치 매체를 사용 하 여 탑재.</li>
	<li>거꾸로 현미경 대답에 20 × 건조 대물 렌즈를 사용 하 여 형광 및 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지를 캡처</li>
</ol>4. 라이브 셀 이미징27
<ol><li>PDL의 500 μ와 함께 요리를 유리 코트 (5 μ g/mL), 1.1.1 단계에서 설명한 대로. 참고:이 프로토콜에서 수 제 유리 기반 요리 사용 되었다. 상업적으로 이용 가능한 유리 기반 요리 또한 라이브 이미징에 대 한 사용할 수 있습니다. 수 제 유리 기반 요리 다음과 같이 준비 되었다: 1) 35 m m 접시의 중앙에 지름에서 약 1.4 m m 구멍을 만들어 손 펀치, 고 2) 실리콘 접시의 뒷면에 유리 coverslip (22 m m의 직경) 첨부.</li>
	<li>1.1.2, 단계에서 설명한 대로 증류수를 가진 격판덮개를 세척 하 고 3 x 104 셀/접시 1.2 단계에서 설명한 대로 중간 A에서 유리 접시에 대뇌 피 질의 뉴런 문화.</li>
	<li>세포 배양의 4 일의 새로운 매체 B, 2 mL와 전송 매체 대체 후 접시에 거꾸로 현미경 A. 유지 37 ° c.에 10% CO2 의 습도 분위기에서 문화</li>
</ol>5. endocytosis 실험
<ol><li>1.2 단계에 설명 된 대로 마우스 대뇌 피 질의 뉴런을 문화.</li>
	<li>4 일 후, 새로운 매체 1 분 20 μ M 형광 막 프로브를 포함 하는 B의 100 μ 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>Pipetting으로 1 μ 0.05 m m 집계 Aβ1-42 (마지막 0.5 μ M) 또는 차량 (증류수) 솔루션 및 믹스를 추가 합니다. 20 분 동안 품 어.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 세척 매체 B 37 ° c에 미리 데워 되었습니다와 두 번 웰 스</li>
	<li>해결 하 고 세척, 1.3.3, 1.3.4 단계에 설명 된 대로 뉴런을 탑재.</li>
	<li>형광 및 거꾸로 한 현미경 대답에 오일 렌즈 X 63 DIC 이미지 캡처</li>
	<li>이미지 소프트웨어를 사용 하 여 각 건강 한 성장 콘에 형광 막 프로브-긍정적인 영역의 밀도 계량.</li>
</ol>6. 유전자 Transfection
<ol><li>1.2 단계에서 설명한 대뇌 피 질의 뉴런을 준비 합니다. 1.2.1 1.2.10 단계를 완료 한 후 3 분 동안 178 x g에서 뉴런 원심.</li>
	<li>제거는 상쾌한, 캘리포니아2 +의 4 개 mL를 추가-무료 및 Mg2 +-행 크 스 균형된 소금물 (HBSS CMF), 자유롭고 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>178 x g 3 분에 셀 원심</li>
	<li>제거는 상쾌한 CMF HBSS 4 mL를 추가 하 고 pipetting으로 혼합. 1.2.10 단계에서 설명한 대로 다음 셀 밀도 계산 합니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브를 1 분 동안 1,677 x g에서 원심 분리기 5 x 106 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>제거는 상쾌한 보충과 transfection 솔루션의 100 μ와 인코딩 EGFP 또는 EGFP AP180 C-말단, DNA 플라스 미드의 3 μ g을 추가 하 고 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>인증된 베트를 위의 솔루션 (단계 6.6)를 전송 및 제조업체의 프로토콜에 따라 transfect는 electroporator와 함께.</li>
	<li>Transfection, 직후에 멧 매체 A의 500 μ를 추가 하 고 솔루션 인증된 피펫은 1.5 mL 튜브에 전송. 1.2.10 단계에서 설명한 대로 다음 셀 밀도 계산 합니다.</li>
	<li>1.2.11 및 1.2.12 단계에 설명 된 대로 잘/104 셀, x 0.8에서 8 잘 문화 슬라이드에 세포 문화.</li>
	<li>1.3 단계에서 설명한 대로 세포 배양의 4 일 후 붕괴 분석 결과 수행 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 상관이 있다.

이 연구에서 설명 하는 프로토콜 Aβ1-42 치료 후 axonal 성장 콘에 초기 현상의 관찰을 사용할 수 있습니다. Aβ1-42 유도 axonal 성장 콘 20 분 이내에 endocytosis 그리고 성장 콘 축소 치료의 1 시간 이내에 관찰 되었다. 이 endocytosis clathrin에 의해 아마 중재 했다. 이 프로토콜을 사용 하 여 억제 clathrin 중재 된 endocytosis의 Aβ1-42-유도 된 성장 콘 붕괴와 교양된 신경27axonal 변성을 방지 하기 위해 확인 되었다. 또한, clathrin 중재 된 endocytosis의 저해 감쇠 axonal 변성 Aβ1-42-유도 및 메모리 적자 vivo에서27. 이러한 결과 clathrin 중재 된 endocytosis 광고 방지를 위한 유망 치료 애비뉴 나타냅니다.
이 프로토콜 개발 되었다에서 축소 3A와 e...

아 밀 로이드 β (Aβ) 예금 Alzheimer의 질병 (광고) 환자의 뇌에서 발견 되 고 메모리 장애2,,34로 이어지는 광고1 신경 네트워크를 방해 하는의 중요 한 원인으로 간주 됩니다. 많은 임상 약물 후보 아 밀 로이드 β (Aβ) 생산을 효과적으로 방지 또는 Aβ 예금을 제거 표시 되었습니다. 그러나, 아무도 AD 환자5에 메모리 기능을 개선에 성공 했다. Aβ는 메모리 장애6;의 발병 전에 뇌에 이미 입금 됩니다. 따라서, 환자의 두뇌에서 Aβ 수준 감소 전시 메모리 장애 수 있습니다 효과. Aβ 증 착은 전 임상 광고 환자; 그러나, 이러한 환자는 거의 신경 변성 및 메모리 적자6제시. Aβ 증 착 및 메모리 장애 사이의 지연 시간입니다. 따라서, 광고의 예방을 위한 중요 한 전략 광고, 이전에 메모리 적자의 개발의 초기 단계 동안 신호 Aβ 독성을 차단 합니다. Aβ 착 유도 축 삭 변성7,,89,10,11,12,13의 중단으로 이어질 수 있는 신경 네트워크 그리고 메모리 기능의 영구 장애입니다. 많은 연구 조사 Aβ 독성;의 메커니즘 예를 들어 광고 쥐 두뇌의 퇴 화 한 축 삭 autophagy14증가 표시 되었습니다. Calcineurin 활성화 Aβ 유도 axonal 변성15;의 가능한 메커니즘으로 보고 되었습니다. 그러나, 직접 트리거 axonal 변성의 알 수 없는 남아 있습니다.
이 연구는 성장 원뿔 이라고 axonal 엔딩의 붕괴에 초점을 맞추고. Axonal 성장 콘의 붕괴 semaphorin 3A와 ephrin A516,17,18,,1920같은 axonal 성장 방수 제에 의해 발생할 수 있습니다. 축소 같은 dystrophic axonal 엔딩 광고 환자21,22의 두뇌에서 관찰 되었습니다. 또한, 성장 콘 기능 실패 axonal 변성23을 자극 수 있습니다. 그러나, 그것 아니다 알려진 Aβ 성장 콘 붕괴를 유도 하는 여부. 따라서,이 연구는 교양된 신경에 있는 Aβ의 초기 효과 관찰 하 고 Aβ 유도 성장 콘 붕괴를 조사 하는 새로운 프로토콜을 선물 한다.

<table><tbody><tr><td>ddY 마우스</td><td>SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8웰 배양 슬라이드</td><td>팔콘</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>폴리 D 라이신</td><td>Wako</td><td>168-19041</td><td></td></tr><tr><td>배양 배지, Neurobasal 배지</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>하우스 세럼</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Wako</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>DP</td><td></td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제</td><td>Gibco</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro 필터; m 메쉬 크기, 셀 스트레이너</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Astec</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>아밀로이드 &베타; 1-42</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9810</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>자당&nbsp;</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>수성 장착 매체, Aqua-Poly/Mount</td><td>polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>반전 현미경 A</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer Z1&nbsp;</td><td>AxioCam MRm, 히팅 유닛 XL S, CO2 모듈 S1 및 TempModule S1과 연결</td></tr><tr><td>Objective Plan-Apochromat 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901</td><td></td></tr><tr><td>Objective Plan-Apochromat 63x</td><td>Carl Zeiss</td><td>440762-9904</td><td></td></tr><tr><td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2 IgG</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>anti-tau-1 IgG</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td></td></tr><tr><td>anti-amyloid &beta; 항체</td><td>IBL</td><td>10379</td><td>클론 11A1</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Wako</td><td>143-06561</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Wako</td><td>010-25783</td><td></td></tr><tr><td>t-octylphenoxypolyethoxyethanol</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594와 접합 염소 anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488과 접합된 염소 anti-rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>NISSIN</td><td>NHP-M30N</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>35mm 접시</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 RTV</td><td>Shin-Etsu</td><td>KE42T</td><td></td></tr><tr><td>핸드 펀치</td><td>Roper Whitney</td><td>No. </td><td></td>XX</tr><tr><td>형광 멤브레인 프로브, FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+- 및 Mg2+-free Hanks' Balanced Salt solution</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Transfection solution, Nucleofector solution</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator, Nucleofector I</td><td>Amaxa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경 B</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>이미지 소프트웨어, ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

시각화 axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

아 밀 로이드 β (Aβ)는 Alzheimer의 질병 (광고)에 메모리 장애를 발생합니다. 치료제 광고 환자의 두뇌에서 Aβ 수준을 줄이기 위해 표시 되었습니다, 비록 이러한 메모리 기능을 향상 되지 않습니다. Aβ 메모리 손상의 모양 전에 뇌에 집계, 이후 Aβ를 대상으로 수 있습니다 이미 메모리 적자 전시 광고 환자 치료에 대 한 효율적. 따라서, Aβ 증 착으로 인해 다운스트림 신호 광고 개발 하기 전에 차단 합니다. Aβ 신경 네트워크 및 메모리 손상의 방해로 이어지는 axonal 변성을 유도 합니다. Aβ 독성의 기계 장치에 많은 연구 들이 있더라도, Aβ 독성의 소스를 알 수 없는 남아 있습니다. 소스를 식별 하려면 우리는 현미경 검사 법, 유전자 transfection, 라이브 셀 이미징 교양된 뉴런의 axonal 성장 콘에 Aβ에 의해 발생 하는 초기 변화를 조사 하기 위해 사용 하는 새로운 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜은 Aβ 억제 endocytosis의 Aβ 독성을 방지 시연 clathrin 중재 된 endocytosis axonal 성장 콘 성장 콘 붕괴 뒤에 유도 밝혔다. 이 프로토콜은 Aβ의 초기 효과 공부에 도움이 될 것입니다 하 고 보다 효율적이 고 예방 광고 치료로 이어질 수 있습니다.

이 프로토콜에서 Aβ1-42는 incubated 37 ° C에서 사용 하기 전에 7 일 동안 부 화 Aβ1-42의 독성 형태27,28,,3035생산 필요 했다 때문에. 이 부 화 후 Aβ의 집계 된 형태 (그림 1A)를 관찰 했다. Aβ1-42의 비슷한 인큐베이션 fibril 형태 Aβ36의 생산으로 보고 되었습니다. 치료 후이 집계 Aβ1-42와 함께, immunostaining Aβ,3537 의 유독한 올리고 머에 대 한 항 체와 함께 수행한...

여기 아 밀 로이드 β (Aβ)는 뇌에서의 초기 효과 조사 하기 위해 프로토콜 제공 됩니다. 이것은 clathrin 중재 된 endocytosis 및 axonal 성장 콘의 붕괴 유도 하는 Aβ 보여준다. 프로토콜 axonal 성장 콘에 Aβ의 초기 효과 공부에 유용 하 고 알 츠 하이 머 병의 예방을 촉진 수 있습니다.

시각화 Axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

이 방법은 알츠하이머 병 연구 분야의 주요 질문, 특히 성장 콘 붕괴와 관련된 초기 사건에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 아밀로이드 베타 치료 직후 축축산 성장 콘을 시각화하고 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 항생제없이 뉴런 배양 배지에서 배아 일-14 마우스에서 갓 분리 된 대뇌 코르티스를 다진 마이크로 가위를 사용하여 시작합니다.조직을 수집하고 조직을 원심 분리하여 87G에서 3 분 동안 원심분리하십시오. 원심 분리후, 상체를 제거하고 펠릿에 0.05%의 트립신 2마리를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분간 배양하고 5분간격으로 섞어 섞어드린다.15분 후, 중간 크기의 A 밀리리터 4개에 추가하여 트립신을 중화시키고 눌러 섞습니다. 그런 다음 조직을 3 분 동안 178 배 G로 원심 분리합니다. 상체를 제거한 후 DNAse 및 대두 트립신 억제제 용액을 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하고 이전과 같이 5분마다 혼합합니다.잠복기 시간이 경과하면, 이전과 같이 중간 A.Mix 및 원심 분리기의 4 밀리리터를 추가합니다. 상체를 제거한 후 중간 크기의 4밀리리터를 추가하고 이물질이 관찰되지 않을 때까지 연마된 파스퇴르 파이펫으로 조직을 세리세게 합니다. 다음으로, 70미크론 모공 크기의 메쉬로 삼중 조직을 필터링합니다.여과 후, 혈전계로 세포를 계산하고 세포 밀도를 계산합니다. 파이펫은 중간 크기의 A의 네 번째 세포에 0.8배 10배씩 각각의 우물로 8웰 배양 슬라이드를 한다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10 % CO2의 가습 된 분위기에서 배양하십시오.배양 4시간 후, 배양 배지를 중간B.이 방법을 이용한 뉴런의 순도는 약 75%이며, 상업적으로 수득된 전길이 의 신선한 유리병을 열고 멸균, 증류수의 농도0.5밀리알라의 농도로 용해시킴으로써 적어도 일주일 전에 이 분석법을 시작한다. 집계 및 독성을 유도하기 위해 7 일 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 집계된 A 베타 1-42의 알리쿼트를 준비하고 사용 전까지 영하 80도에 보관하십시오.뉴런 배양의 4일째에, 이전에 입증된 바와 같이 1시간 동안 중간 B에서 베타 1-42 또는 차량 용액을 집계한 0.5 마이크로리터 100마이크로리터로 우물을 치료한다. 시간이 경과 한 후, 배양 배지를 제거하고 즉시 뜨거운 접시에 섭씨 37도에서 1 시간 동안 PBS에서 4 %의 자당을 포함하는 4 %의 para포름 알데히드로 뉴런을 수정합니다. 이 프로토콜에서 성장 원수의 모양을 유지하는 것이 가장 중요하기 때문에 고정은 가장 중요합니다.고정 후 PBS로 뉴런을 세 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 챔버를 제거 한 후 수성 장착 매체로 뉴런을 장착하십시오. 2~4일 동안 섭씨 4도에서 마운팅 배지를 건조시다.반전 된 현미경에 20X 건조 객관적인 렌즈와 각 우물의 전체 영역을 캡처합니다. 각 우물의 전체 영역을 캡처하고 분석하는 것은 주관성을 피하는 데 중요합니다. 3~4단계에서 각 뉴런의 가장 긴 중성염을 축삭으로 분류한다.축 사 성장 콘 라멜리포디아 부족 또는 3 개 미만의 filopodia를 소유 하는 붕괴 성장 콘으로 간주 됩니다. 잠복기 전에 여기에 표시된 베타 1-42 올리고머는 섭씨 37도에서 7 일간의 배양 후 집계합니다. 베타 1-42를 집계한 후, 베타의 독성 올리고머에 대한 항체와의 면역염색은 베타 1-42 처리된 뉴런에 빨간색으로 양성 염색을 나타내지만, 차량 처리뉴런은 아니다.베타 1-42 치료에 의해 유도된 초기 현상은 배양에서 4일 후에 분석되었다. 확인된 축축은 축산 마커 타우-1에 대한 양성 면역스테인팅에 의해 확인되었으며, 수지상 마커에 대한 적색 및 음수 면역스테인링으로 도시된 MAP-2, 그린으로 도시되었다. 차량 치료의 한 시간 후, 성장 콘은 라멜레포디아와 여러 filopodia 확산했다.이들은 건강한 성장 원자로 확인되었습니다. 반대로, 베타 1-42 치료의 한 시간은 라멜리포디아 또는 filopodia를 개발하지 않는 수축 성장 콘으로 이어졌다. 이들은 붕괴 된 성장 콘으로 확인되었다.이 절차를 시도하는 동안, 그것은 내 -nor-idge이 고정 프로토콜에 섭씨 37도에서 4 %의 PFA와 4 %의 자당으로 세포를 고치는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라, 살아있는 세포 화상 진찰 및 유전자 이식 같이 그밖 방법은 축축한 성장 콘이 붕괴되는 때 그리고 어떻게 붕괴된 성장 콘이 복구되는지 와 같은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마우스의 일차 소뇌 과립 뉴런에서 뉴런 손상 모델의 생성을 보여줍니다. 흥분성 신경전달물질 수용체 작용제인 NMDA와 공동 작용제인 글리신을 사용하여 신경 손상을 유도하는 데 필요한 단계를 설명합니다. NMDA와 글리신은 특정 신경 수용체에 결합하여 과도한 자극을 유발하고 세포 내 칼슘을 대량으로 유입시켜 신경 세포 손상과 사멸을 초래합니다.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons(마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 뉴런 손상 모델링)

이 비디오는 아밀로이드 β(Aβ) 응집체에 의한 신경 성장 원뿔 붕괴의 체외 평가를 보여줍니다. 뉴런을 Aβ 응집체로 처리하면 세포골격 불안정화가 발생하여 축삭돌기 끝에 있는 성장 원뿔이 붕괴됩니다. 성장 원뿔의 붕괴 정도를 평가하기 위해 처리된 세포를 대조 세포와 비교합니다.

뉴런 성장 원뿔 붕괴에 대한 응집된 아밀로이드 β의 체외 평가

초파리 애벌레는 그들의 반투명 표피와 강력한 유전학 라이브 영상을위한 매력적인 모델 시스템이다. 이 프로토콜은 3 차 령 초파리 유충의 신경 세포 내에서 세포 프로세스의 실시간 이미징을위한 '유충 칩'이라는 단일 층 PDMS 장치를 활용하는 방법에 대해 설명합니다.

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

여기에서는 아밀로이드-베타의 직접 입체성 뇌 주입을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 뇌 뉴런에 대한 아밀로이드-베타의 단기적인 영향을 해결하기 위한 대안적인 생체 내 마우스 모델을 제공합니다.

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

트랜스제닉 형광 마우스를 사용하여, 살아있는 동물에서 무손상 좌골 신경의 운동 및 감각 축삭 내 엔도솜 및 미토콘드리아의 신호전달의 생체내 축삭 수송을 평가하기 위해 상세한 프로토콜이 기술된다.

축삭 수송의 생체 내 이미징을위한 툴킷 확장

여기에서는 알츠하이머병(AD) 뉴런에서 신경독성 β-아밀로이드(Aβ) 생성을 실시간으로 증가 또는 유지하여 미토콘드리아 관련 소포체(ER) 막(MAM)의 구성 안정제의 축삭 수송 속도를 측정하여 MAM 안정화를 측정하고 AD 치료제 개발을 돕기 위한 직접적이고 정량적인 지표로 사용하는 방법을 설명합니다.

알츠하이머병(AD)의 신경 모델에서 미토콘드리아 관련 소포막(MAM) 안정화의 정량적 분석 

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

배우세요 아밀로이드-β가 배아 마우스 대뇌피질 신경원의 축삭 성장 원추를 붕괴시키는 메커니즘을 시각화하는 방법을. 이 기술은 알츠하이머병의 초기 병리 현상을 연구하는 데 필수적입니다.

시각화 Axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과

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