Name: 높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 학습하세요 CHO 세포를 이용한 고처리량 마이크로바이오리액터 자동 배양 기술로 IgG1 항체 생산을 최적화하는 방법. 이 프로토콜은 바이오프로세스 제조 및 세포주 특성화 연구에 활용됩니다.

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저자 스콧 류 그들이 제공 하는 분석 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 일부 내부 자금 및이 작업에 대 한 지원을 CDER 중요 경로 프로그램 (CA #1-13)에 의해 제공 되었다. 이 프로젝트는 생명 공학 제품의 사무실, 미국 식품 및 의약품 안전 청, 과학을 통해 교육에 대 한 오크 리 지 연구소에 의해 관리 인턴/연구 참여 프로그램에는 약속에 의해 부분적으로 지원 한 미국 에너지 부와 FDA 간에 부처간 합의.

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면책 조항:이 게시는 저자의 의견을 반영 하 고 FDA의 전망 또는 정책을 해석 되어서는 안 됩니다.

자동화 된 마이크로 생물 시스템을 제대로 실행 하 고 효율적으로 여러 자동화 단계의 적시 실행을 포함 한다. 실행 하는 시스템의 가장 중요 한 부분 중 하나는 소프트웨어를 프로그래밍입니다. 프로그램을 작성 하는 동안 어떤 오류가 있는 경우에 전략, 샘플링 전략, 또는 최종 제품의 품질 연구의 결과 무효화할 수 있는 먹이 과정에서 예기치 않게 변경 될 수 있습니다 실험에서 심각한 오류가 있을. 배치 하 고 적절 한 할 제어 되도록 클램프 플레이트를 제대로 강화 시스템을 실행의 또 다른 중요 한 측면이입니다. 가장 일반적인 표시는 클램프 플레이트는 강화 하지 균등 하 게 할 측정 대, 1, 6, 7, 12 (코너 원자로 용기)에 예기치 않은 변화입니다. 전반적인 할 불안정 클램프 플레이트에 가스 입구 라인에 가스 켓을 완화 하는 나타냅니다. 이 시나리오는 할 세트 포인트에 도달 방해 수 있습니다. 셀 시키는 실험을 시작 하는 경우를 피하기 위해 또 다른 일반적인 함정이 그들 침전을 일으키는 접종 단계 동안 너무 오래 앉아. 셀 앉아, 지출 적은 시간 점차적으로 낮은 inoculum 셀 카운트는 무의식적으로 중요 한 바이어스를 일으킬 수 있는 반응 기 배를 시간순으로 추가 적은 기회 연구 결과 harms. 그것은 여러 단계에서 접종을 더 나은, 즉, 접종 한 다른 일시 중지 단계와 각 문화 역 사이 셀은 15 분 이상 접종 플레이트에 앉아 하지.
일상적인 사용, 무 균 유지에 관여 하는 것은 중요 합니다. 시스템 생물학 안전 장은 비록 불 임 후드와 자주 운동으로 인해 보장 되지 않습니다. 따라서, 후드에서 일어나는 모든 70 %IPA 살포 해야 합니다. 둘째, 그것을 최소한의 거품 발생 합니다 문화; 위해 필수적입니다. 미디어는 가스 덩어리 하 고 배기 라인, 클램프 플레이트와 아래도 핵심 부품의 손상으로 이어지는 수 있습니다. 예방 방지 거품 추가 단계는 어떤 마이크로 생물 프로그램 설계에 중요 합니다. 밖으로 "거품"의 경우 그것은 프로토콜 청소 제조 업체에 따라 도움이 될 것 이라고 하 고 클램프 플레이트의 영구적인 손상을 방지할 수 있습니다. 또는 비 sparged 선박의 사용 볼륨 비율에 더 높은 표면은 sparger의 부족으로도 효율적인 산소 수로 일괄 처리 모드에서 실행할 때 또는 낮은 세포 밀도 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 비 sparged 배 않을 수 있습니다 높은 세포 밀도 또는 관류 문화에 대 한 유용한 머리 공간 성장 하는 산소의 소비 문화 유지 하기에 충분 하지 않습니다.
여러 제어 문화 제어 플라스 크를 흔들어 보다 작은 규모에서 병렬로 실행 되도록 하면 microbioreactor 시스템에서 제공 하는 수많은 이점이 있다. 17 그러므로 시스템 연구, 않는, 높은 처리량 복제 연구와 transfection 연구 심사의 실행을 촉진 한다. 자동된 액체 처리 또한 동시에 훈련 된 인원에 대 한 지루한과 시간 집중적인 노동 최소화 하면서 애 널 리스트 분석 가변성을 감소 시킨다. 시스템에 여러 이점이 있다, 하는 동안 고려해 야 하는 몇 가지 주요 단점이 있다. 첫째, 15 mL의 문화 볼륨 크게 제한 프로세스에서 샘플링 및 최종 수확 소재, 그리고 여러 다른 작은 규모 bioreactors (최대 500 mL) 최근에 제공 되. 시스템에 한 최근 전진은 자동된 미 생물 세포 밀도 및 영양소 분석에 대 한 샘플 볼륨을 줄여에 프로세스 샘플링 문제를 완화 하는 노바 생물에서 BioProfile 플렉스 2 분석기와의 통합 . 혜택 포함할 수 빠른 설치 및 운영 비용 절감, 아니 거의 청소 선도 costlier 재사용 가능한 기존의 시스템 보다 단위를 구입 하는 것으로 긴 기간 프로젝트에 대 한 일회용 단위 비용을 고려 한다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 주로 배치 모드 세포 배양에 적합 하지만 사용자의 요구에 따라 수정할 수 있습니다. 각 문화 역은 온도 독립적으로 제어 및 pH 개별 원자로 혈관의 수준에서 변화 될 수 있습니다. 사토리는 또한 마이크로 생물 반응 기 시스템에 대 한 맞게 될 실험 수 있도록 특별히 설계 된 소프트웨어를 계획 하는 암컷을 제공 합니다. 대규모 DoE 연구는 제조업체에서 제공 하는 새로운 DoE 소프트웨어를 사용 하 여 미디어에 도움이 하 고 최적화를 보충 수 있습니다. 여기 사용 하지, microbioreactor 시스템 또한 먹이 배치 연구 수 있습니다. 시스템은 되지 아직 최적화 되었습니다 관류 세포 배양에 대 한. 그러나, 제한 된 연구와 실험을 현재 마이크로 생물 반응 기 시스템에서 관류 셀 문화 작업을 모방 되었습니다. 26 이 메서드는 셀 정착 하 여 고밀도 관류 문화를 모방 하기 위해 수정할 수 있습니다. 높이 피펫으로 원자로 삽입 되는 변화 및 안정화 시간을 최적화 하 여, 미디어 제거 고 문화의 거울 풍부 모드를 보충 수 있습니다. 이 개발 지역 문화의 관류 모드를 원하는 경우 여기에 제시 된 시스템 보다 더 나은 작동 하지 않을 수 있는 새로운 제품 있다.
요약 하자면,이 연구는 자동화 된 마이크로-생물 반응 기의 사용 방법을 보여 줍니다와 조 셀 문화 작업을 생성 하 고 모델 IgG1 단일 클로 널 항 체의 특성에 대 한 분석 관련. 그것은 작은 규모 마이크로-생물 반응 기 재생을 역할 bioprocess 제조 및 세포 문화 개발 및 미디어 심사에 미치는 영향을 강조 한다. 자동화 된 작은 규모의 시스템을 사용 하 여 많은 이점이 있다, 그러나 완벽 하 게 실현 하기 위해 그들의 혜택 처리 이해 하 고 분석 특성은 필수적입니다. 이 연구 개발 하 고 개별 연구 요구 당 개선 될 수 있는 자동화 된 미 반응 기 시스템을 사용 하기 위한 지침을 사용자를 제공 합니다.

단일 클론 항 체 (mAbs) 19751마우스 hybridoma 세포에서 처음 생산 되었다. 이후로, 재조합 단백질 생산의 증가 증가 vivo에서 안전 및 효능2,,34mAbs 인간적으로 자리를 차지 했다. 재조합 형 단백질 생산 프로세스의 대부분 고용 된 그들은 혈 청 자유로운 미디어, 그들의 생산 능력을 타고 난 인간의 비슷한 포스트 번역 상 수정 단백질을 적용할 수 있습니다 용이성에 대 한 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 단백질 그리고 호스트 셀5,6으로 그들의 신뢰성.
수요가, 빠르고 일관 된 품질을 가진 큰 환자 인구에 대 한 제품을 제공 하 성장 하고있다. 경제 혜택 이외 mAbs에 의해 치료 하는 질병의 레 퍼 토리 증가, 면역 질환, 이식 후 합병증, 관절염, 그리고 암7이제 포함. 현대 상업 mAb 생산 라인에 대 한 평균 수율은 일반적으로 5-6 g/L의 범위에서 고5상승 하는. 부분적으로,이 조 세포 공학 및 높은 처리량 bioreactors8를 사용 하 여 향상 된 생산 라인 심사를 통해 성취 되었습니다. 그러나, 단백질 생산에 대부분 증가 처리 개선, 발전을 포함 하 여 미디어 최적화, 셀 문화 조건에에서 고 먹이 전략7,,910기인 되었습니다. 영양 보충 뿐만 아니라 고품질 단백질의 효율적 생산을 위한 뿐만 아니라 적절 한 세포의 성장을 위해 필수적 이다. 또한, 셀 전략 최적화6,11을 먹이 대 한 추가 이해를 필요로 특정 영양소의 화학 량 론 추가 필요 합니다. 전통적인 최적화 방법에는 개별 미디어 구성 요소 적정 및 혼합 디자인 혼합 미디어 포함 됩니다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 걸리고, 노동 집약 되며 인간의 오류12,13와 관련 된 위험을 포함.
미디어 최적화 연구 이전 쉐이크 플라스 크와 원료 및 인적 자본 prohibitively 비싼 될 수 있는 1-2 L bioreactors에 의존. Microplates는 또한 사용 하지만이 메서드는 제한 된 확장성을 제공. 또한,이 여전히 미디어 구성 및 먹이 전략14,,1516기인 CQA 가변성을 가린다는 일괄 배치 변화를 소개 하는 여러 시간이 걸리는 실행 해야 합니다. 따라서, 높은 처리량 및 높게 일관 된 병렬 생물 시스템 등장된17,18,,1920에 대 한 필요 합니다.
전통적인 벤치 스케일 bioreactors의 작동과 관련 된 중요 한 경비 (0.5-5 L), microbioreactors는 마약을 파생 된의 생산을 생물학적으로 평가 대 한 비용 절감 대안을 제공. 21 벤치 규모 흔들 탱크 bioreactors 신뢰할 수 있는 고 감각 배열을 통해 조밀한 데이터를 제공 한다. 피드백 제어 시스템의 쉬운 감시에 대 한 수 있습니다. 그러나, 어셈블리, 교정, 청소, 노동 비용, 기판 비용, 및 살 균 요구 사항을 벤치 규모 흔들 탱크 bioreactors 비싼 및 노동 집약 작동을 확인 합니다. 쉐이크 플라스 크 및 결정 접시 비용의 일부를 제거 하 고 큰 규모 bioreactors와 관련 된 문제를 노동 하지만 이러한 대안 약한 제어 조건 처리를 제공 하 고 낮은 밀도 데이터, 종종 끝점 측정을 생산. 22
또는, microbioreactors 셀 라인 및 업스트림 공정 개발에 대 한 스케일-다운 접근을 제공 하는 작은 작업 볼륨을 사용 합니다. Microbioreactor 실험의 규모 크게 전력, 기판, 노동, 공간, 및 유틸리티의 낮은 활용을 통해 운영 비용을 줄일 수 있습니다. 23 Microbioreactors는 쉐이크 플라스 크 그들은 그들의 크기 때문에 처리 하기 위해 쉽게 하지만 그들은 pH, 온도의 그들의 온라인 피드백 제어를 통해 전통적인 벤치 규모 bioreactors의 장점을 유지 용 존 산소, 및 산/염기 처럼 소비 뿐 아니라 품질 매개 변수 가스 조성에서 포함의 그들의 실시간 데이터 출력. Microbioreactor 규모 높은 처리량 검열 기능, 클론 선택 및 공정 개발에 유용할 수 있습니다. 24
고급 미 생물 조 셀 문화 과정 특성화 및 개발18에 대 한 효과적인 도구가 될 표시 되었습니다. 여기, 자동화 된 ambr15 시스템, 병렬, 클래식 비교할 수 표시 되어 48 microbioreactors 구성 된 연구 최대 규모에서 탱크 원자로 흔들,25 미디어에 최적화 된 사전 작업을 유사한 방식으로 사용 되었다 생산 모델 공상 IgG16조 DG44 셀 라인에 대 한 구성. 성장과 titer에 다양 한 미디어 조건의 효과 비교, 되었고 분석. 이 논문에서는 microbioreactor 시스템 및 원유 미디어 샘플의 분석을 실행 하는 일반적인 지침 제시 하고있다.

<table><tbody><tr><td>CHO DG44 세포주</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>ambr 15 자동 미생물반응기 시스템</td><td>Sartorius</td><td>001-2804</td><td>자동 마이크로 생물반응기</td></tr><tr><td>ambr 15 세포 배양 24 일회용 생물반응기 - Sparged</td><td>Sartorius</td><td>001-2B80</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 일회용 피펫 팁, 멸균</td><td>Sartorius</td><td>A-0040</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 일회용 피펫 팁, 멸균</td><td>Sartorius</td><td>A-0039</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 딥 웰 플레이트</td><td>Sartorius</td><td>A-0038</td><td></td></tr><tr><td>1 웰 플레이트</td><td>Sartorius</td><td>A-0068</td><td></td></tr><tr><td>Vi-Cell XR 셀 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>자동 셀 카운터</td></tr><tr><td>EX-CELL&nbsp; 소포제(감마 조사)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59920C-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-글루타민</td><td>Corning</td><td>25-005-CV</td><td></td></tr><tr><td>100X 페니실린/스트렙토마이신</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>125 mL F-Bottom Shake Flasks (sterile, vented)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PBV12-5</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 유리 스피너 플라스크</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PP 원추형 원심분리기 튜브(멸균)</td><td>Nalgene (Thermo Scientific)</td><td>376814</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>BioRad Laboratories, Inc.</td><td></td><td></td>1450103</tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BioProfile FLEX 분석기</td><td>Nova Biomedical</td><td>49418</td><td>영양 분석기</td></tr><tr><td>옥텟 레드 96</td><td>Pall Fort&eacute; 바이오&nbsp;</td><td>99-0042</td><td>단백질 A 바이오센서</td></tr><tr><td>단백질 A 딥 앤 리드 바이오센서</td><td>Pall Fort&eacute; 바이오&nbsp;</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 96웰 마이크로플레이트, F-바텀, 굴뚝 스타일, 블랙</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량의 사용 모델 igg1 조 세포에서의 생산을 위한 microbioreactor 시스템 자동화

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

자동된 눈금 bioreactors (15 mL) 세포 문화 엔지니어를 위한 유용한 도구 수 있습니다. 그들은 잠재적인 프로세스 변화를 최소화 하면서 다양 한 실험 조건의 동시 실행을 촉진 한다. 이 방법의 응용: 심사, 온도 및 pH 변화, 미디어 및 보충 최적화 복제. 또한, 작은 원자로 볼륨에 큰 디자인의 실험 조건의 넓은 범위를 조사에 도움이 되는. 이로써 업스트림 프로세스가 크게 확장 하기 전에 최적화 실험 범위 시간과 경제적인 제약 때문에 더 제한 됩니다. 자동된 미 생물 시스템 전통적인 작은 규모에 비해 다양 한 장점을 쉐이크 플라스 크 또는 회전자 플라스 크 등의 셀 문화 단위를 제공합니다. 그러나, 파일럿 규모 중 프로세스 개발 중요 한 배려는 이러한 이점을 실현 되도록가지고 한다. 관리와 실행, 시스템 높은 수준의 자동화를 사용할 수 있습니다 변수의 높은 숫자 미상의 실행 프로그램 될 수 있다, 샘플링 시간을 줄일 수 있습니다 영양소 분석기 또는 셀 카운터와 통합 될 때. 여기, 현재 자동화 된 미 생물 실험으로 제시 하는 전문가 파생 휴리스틱의 통합 의미 있는 결과 방해 하는 일반적인 함정을 최소화할 수 있습니다. 극단, 여기 배치 원칙을 준수 하는 실패는 비싼 수리를 필요로 하는 장비 손상 발생할 수 있습니다. 또한, microbioreactor 시스템 작은 문화 볼륨 셀 문화 조건의 특성을 어렵게 만들고 있다. 샘플 프로세스에서 일괄 처리 모드 문화에서의 양과 수 운영 볼륨 10 mL가 수로 제한 됩니다. 이 메서드는 혜택 및 미 생물 시스템의 단점을 논의할 예정 이다.

중요 한 프로세스 매개 변수 및 셀 문화 작업을 통해 다른 셀 문화 매개 변수를 모니터링 하는 것은 bioprocessing에 중요 한 측면 이다. 셀 카운터와 영양소 분석기는 세포 성장, 영양소 소비 및 부산물 형성 특성 5 특성을 계량 하 사용 되었다. 셀 수는 모든 문화 조건에 대 한 매일 얻은 했다. 평균 실행 가능한 세포 밀도 viabilities는 그들의 ± 1 SD 간격 함께 그림 3 에서 보듯이. 영양소 및 부산물 프로필도 문화의 고정 단계 ± 1 SD 간격으로 표시 됩니다. 이 프로필의 사면 평균 포도 당 및 글루타민 소비 및 젖 산 생산 속도를 나타냅니다. 전반적으로, 이러한 결과 microbioreactor 시스템에서 이러한 특성을 모니터링의 타당성 입증 뿐만 아니라 꽉 범위 내에서 이러한 매개 변수를 유지 하기 위해 microbioreactor 시스템의 기능.
세포 배양의 총 생산성 수확된 세포 배양 0.22 미크론 PVDF 필터를 통해 전달 된 후 proteinA 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 정량 했다. 1.15 pg/셀-d 그림 4에서 보듯이 0.87 pg/셀 차원에서 원거리 셀 당 특정 생산성. 기반으로 이러한 결과에 다양 한 조건 미디어 구성 선택 조사 수 및 실험 절차에 대 한 최소한의 투자에 대 한 생산 단백질의 양을 최대화 하는 전략을 먹이.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig1.jpg"> 그림 1 : 4 문화 방송국 (CS) 12 반응 기 배는 데 microbioreactor 시스템의 레이아웃. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig2.jpg"> 그림 2 : ProteinA 바이오 센서 시스템에 재생 실험으로 기본적인 정량에 대 한 예제 샘플 접시 설정. 행 1 (빨간 "R") 참조 샘플 (즉, 매트릭스 분석 결 석); 예약 행 2 (아쿠아 마린)는 표준 (µ g/ml에서 농도); 3, 4 (오렌지) 행은 낮고 높은 긍정적인 컨트롤 집합 ("PL" 및 "PH" 각각); 알 수 없는 샘플;를 포함 하는 행 5-10 (보라색) 행 11 및 12 (그레이)는 재생 ("R") 및 중화 ("N") 버퍼에 대 한 프로그램 기본 위치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig3.jpg"> 그림 3 :: 는) 가능한 셀 밀도 생존 프로필 나이 일괄 처리의 평균. ± 1 SD microbioreactor 시스템에서 세포 성장의 꽉 컨트롤을 나타내기 위해 표시 됩니다. b) 평균 영양소 프로 파일 젖 산에 대 한 평균 부산물 프로필 뿐만 아니라 포도 당 그리고 글루타민. ± 1 SD microbioreactor 시스템에서 미디어 구성 이상 꽉 컨트롤을 나타내기 위해 표시 됩니다. (N = 3, 모든 조건은 실행 되었습니다 3 중에서). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig4.jpg"> 그림 4 : 는 다양 한 미디어의 평균 특정 생산성의 대표적인 상자 그림. (N = 3, 모든 조건은 실행 했다 3 중) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

이 방법은 세포주 특성화 및 중재 및 공정 최적화의 양상에 관한 바이오 공정 제조 분야에서 중요한 질문 중 일부에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 쉐이크 플라스크에서 더 큰 제어를 제공하고 자동화및 빠른 데이터 생성을 위한 대규모 연구의 성능을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 사이 라시미카 벨루굴라와 케이시 쿤호스트, 내 실험실에서 연구 동료가 될 것입니다.37도 섭씨 수조에 있는 냉동 배지의 밀리리터 당 7번째 쇼 세포에 3배 10번의 스톡 을 담그는 것으로 시작합니다. 얼음의 작은 조각만 남아 있을 때, 부드럽게 빠르게 해동 된 세포 현탁액을 몇 번 파이프하고 OptiCHO 매체의 29 밀리리터를 포함하는 멸균 125 밀리리터 배출 쉐이크 플라스크로 세포의 1 밀리리터를 전송합니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 37도, CO2는 8%로 놓고 130 RPM을 흔들어 놓습니다.125 밀리리터 스피너 플라스크에서 신선한 섭씨 37도의 100밀리리터에서 72시간 후 세포를 섭씨 37도, 70RPM에서 교반하는 8%CO2의 또 다른 72시간 배양에 대한 소풍을 일으킨다. 서브컬쳐 의 셋째 날에, 마지막 24 시간 배양에 대한 적어도 90 %의 생존력으로 세포를 유지하기 위해 스피너 플라스크에 신선한 미리 따뜻해지는 배지를 추가하십시오. 다음 날에는 원격 데스크톱 아이콘을 클릭하고 연결을 클릭합니다.원격 데스크톱이 연결되어 있을 때 셀 카운터 소프트웨어를 열고 새 시약 박을 설치합니다. 그런 다음 Trypan Blue 폐기물을 비우고 시스템을 프라임합니다. 다음으로, 원격 연결을 최소화하고 기존 실험을 템플릿으로 사용하여 마이크로 바이오 반응기 소프트웨어를 열어 새로운 실험을 만듭니다.실행을 시작하기 전에 소프트웨어의 모방 섹션에서 실행하는 동안 사용되는 플레이트를 정의하고 각 배양 스테이션에 12 개의 멸균 배양 용기를 배치합니다. 오토클레이브 클램프 플레이트를 용기 위에 놓고 교반판을 클램프 플레이트 위에 놓고 각 핀이 단단히 삽입되도록 합니다. 그런 다음 클램프 플레이트를 나사와 노브로 고정합니다.시스템을 시작하려면 각 배양 용기와 함께 제공되는 바코드를 스캔합니다. 시스템은 초기화하고 적절한 선박의 존재를 확인합니다. 온도 조절을 섭씨 37도로 설정하고 교반을 1, 000 RPM으로 설정하고 용존 산소 PH 모니터를 켭니다.다음으로 중간 충전 프로그램을 실행합니다. 모든 배지가 적재되면, EX-CELL 안티폼의 35 마이크로리터가 항폼 플레이트에서 배양 용기에 첨가될 것이다. 30분 후 배양 매체 내에서 용존 산소 및 PH를 기록하기 시작하여 용존 산소가 용존 산소 평형 후 50%의 설정점에 도달할 수 있도록 모든 배양 용기에 대해 7.1의 PH 설정점을 획득한다.다음 날 아침, 일시 중지 된 PH 단계를 실행하고 원심 분리를위한 멸균 250 밀리리터 원추형 튜브로 스피너 플라스크의 전체 내용을 전송합니다. 혈관에 접종을 첨가한 후 최종 밀도가 밀리리터당 제6 CHO 세포에 10배씩 될 정도로 신선한 배지에서 펠릿을 재연하고, 멸균 뚜껑24웰 플레이트의 적절한 우물에 부유세포를 첨가한다. 각 웰에 3 밀리리터의 접종을 추가하고 접종판을 후드 안에 지정된 책상에 놓습니다.이어서, 배양용기가 적어도 한 시간 동안 평형화하고 프로그램에서 5개의 EX-CELL 카운트 단계를 개시하게 한다. 2일째에 매일 영양및 대사산물 분석을 위해 샘플 튜브 홀더 플레이트를 지정된 덱에 놓고 열린 마이크로센트심분리기 튜브를 적절한 홀더에 적재합니다. 이어서, 샘플을 분석기 트레이에 넣고 영양 분석을 수행한다.실행을 종료하려면 먼저 동요 뒤에 온도 제어를 해제합니다. 용존 산소 PH 제어 및 배경 베이스 추가, 다른 모든 컨트롤 및 시스템 모니터를 중지합니다. 클램프를 풀고 접시를 저어 배양 용기를 제거하고 건조 판을 배양 소에 나사로 넣습니다.그런 다음, 프로그램에 2 시간 건조 주기를 실행;건조 주기가 완료되면 생물 반응기 소프트웨어의 정지를 클릭. 세포를 수확하기 위해 반응기 용기로부터 세포 배양액을 원심분리를 위한 상응하는 원추형 튜브로 옮기고 멸균 0.22 마이크로미터 PVDH 필터를 통해 초중나티를 필터링한다. 이어서, 각 멸균 세포 배양의 1밀리리터를 개별 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송하여 음의 섭씨 20도 저장을 위한 테이터 분석까지.시료의 IgG 티터를 측정하려면 먼저 단백질 보조 바이오센서 시스템을 켭니다. 램프가 적어도 1시간 동안 따뜻해진 후, 시료가 실온에 평형화되고 시료당 단백질 보조 팁 1개를 신선한 세포 배지에 30분 이상 미리 식힙니다. 그런 다음 플레이트 온도를 섭씨 26도로 설정합니다.샘플을 시스템에 로드하고 데이터 수집 소프트웨어에서 재생하여 기본 고감도 분석서를 사용하여 분석체를 실행합니다. 통합 된 세포 카운터를 사용하여, 평균 실행 가능한 세포 밀도 및 비부채는 모든 배양 조건에 대해 매일 얻을 수 있습니다. 영양 분석기를 사용하면 미생물 반응기 시스템에서 이러한 특성을 모니터링할 수 있는 가능성을 보여주는 영양소 및 부산물 프로파일을 얻을 수 있습니다.또한, 다양한 배양 조건 하에서 세포 배양물의 총 생산성은 입증된 바와 같이 단백질 보조 바이오센서 시스템을 이용하여 정량화될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 프로토콜은 프로그래밍이 올바르게 수행되는 경우에만 작동하며 최소한의 오류로 프로토콜 단계를 적시에 실행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 다각광 산란과 같은 다른 방법은 제조된 제품의 물리적 및 화학적 특성에 관한 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.

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Research

연구

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생명공학

단백질 치료제 생산을위한 생산 세포주 개발의 높은 처리량, 자동화된 플랫폼은 설명합니다. BD FACS 아리아 세포 분류기의 구현, CloneSelect 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo) 액체 처리 시스템이 향상 세포주의 품질과 높은 재현성과 세포주 개발에 크게 증가 처리 능력을 보여주었다.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

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Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

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