Name: 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 마우스 눈 앞쪽 챔버에 이식된 흉선에서 흉선세포의 실시간 추적 방법을. 이 기술은 면역학 연구에서 전구세포 모집 및 성숙 T세포 이출을 장기간 관찰할 수 있어 자가면역 및 면역결핍 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH 교부 금 R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) 및 R21ES025673 (AC)에 의해 고 최고/2015/043 그랜트에 의해 지원 되었다 (Consellería de Educació, 문화 나, esport Generalitat 발렌시아, 발렌시아, 스페인) (EO). 저자는 대학 Católica 드 발렌시아 산 비센테 Mártir, 발렌시아, 스페인, 센트로 데 Investigación 프린시페 펠리페, 발렌시아, 스페인에 대 한 그들의 비디오 촬영과 편집에서 알베르토 헤 르 난 데스에서 보낸 팀을 감사 합니다.

기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 마이애미 대학의 IACUC 지침에 따라 모든 실험을 승인 했다.
1. 격리와 신생아 Thymi의 조정
<ol><li>모든 시 약 및 압력가 마로 소독 또는 멸 균 상태를 보장 하는 다른 방법으로 악기를 준비 합니다.</li>
	<li>오염 최소화, 층 류 두건 아래 모든 수술 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>Euthanizing 기증자 마우스, 이전 60 m m 메 마른 접시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 살 균 prechilled 1를 얼음에 그것을 배치. Rinsing 하 고 기증자는 이식 전에 마우스에서 삭제 thymi를 저장 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>윤리 지침에 따라 잘린 여 신생아 기증자 마우스를 안락사를 진행 합니다.</li>
	<li>등 수직 위치에 스프레이, 멸 균 흡수 성 종이 타 올에 마우스를 놓고 나중에 닦 고, 70% 에탄올과 마우스 복 부.</li>
	<li>낮은 복 부의 수준에서 피상적 V 자형 절 개 하 여 흉 강을 노출 하 고 직선 10cm 약 0.5-1의 개통을 두고 복 부 정중 선 다음가 위를 해 부 한 켤레와 함께 피부를 잘라 cm 가슴 수준에서. 흉 강 노출 가슴의 양쪽에는 피부를 접어.</li>
	<li>막과 같은 유형의 앞쪽 흉 강에 우수한 mediastinum 액세스할 수가 위 흉 곽을 통해 확인 두 깊이 0.5-1 c m 측면 절 개. Thymus 심장 바로 위에 두 창백 엽으로 나타납니다.</li>
	<li>Thymus와 완벽 한 장기를 추출 수직으로 당겨 아래 곡선된 겸 자 집합 장소. 집게의 쌍으로 흉 곽의 폴드를 방지 합니다. 필요한 경우 미세 집게를 사용 하 여 신중 하 게 장기를 추출 하기 전에 캡슐을 방해 하지 않고 장기를 둘러싼 결합 조직 찢. 참고:이 단계는 해 범위를 사용 하 여 촉진 된다.</li>
	<li>차가운 멸 균 1 x PBS (pH 7.4) 이전 60 m m 메 마른 그릇에 표시 하 고 메스와 연결 지협 잘라 thymic 돌출부를 분리 하에 격리 thymus 잠수함. 캡슐을 해치지 않고 접시에서 모든 파편을 제거 합니다. Thymi 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 임 플 란 트 하기 전에 바로 백 리 향 엽 트림. 참고: 각 격리 된 신생아 thymus 양쪽 눈에 이식 받을 때 약 3 호스트 마우스의 최대 폭 1 m m의 6 세그먼트를 렌더링 됩니다 일반적으로.</li>
	<li>각 기증자 마우스에 대 한 1.4-1.9 단계를 반복 합니다. Thymi 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 한 번에 한 thymus를 격리 합니다.</li>
</ol>2. thymus 이식으로 눈의 앞쪽 챔버
<ol><li>이식, 이전 태그와 각 받는 사람 마우스 무게.</li>
	<li>받는 사람 마우스 anesthetize에 isofluorane 증기의 1-2% 사이의 복용량을 사용 합니다. 수술 절차를 시작 하기 전에 반사 다음 발가락 핀치의 부재에 의해 적절 한 anesthetization를 확인 합니다.</li>
	<li>Thymus 세그먼트 이식으로 다음과 같이 하십시오.<ol>
<li>장소 마우스 측면 측면 기댄 위치에는 한쪽 눈 직면 하 고 그래서 해 범위의 렌즈에 직접 노출.</li>
		<li>감기 1 x PBS (pH 7.4)에 누워 격리 thymic 돌출부 중 소비 세-임 플 란 트에 대 한 최대 1 mm 폭 60 m m 접시 조각으로 가득. 각 세그먼트 thymic 피 질과 수 질 포함 되도록 지그재그 패턴을 따릅니다. 욕실이 위를 사용 하 여 그림 1A에 제공 된 지침에 따라 트리밍에 대 한. 참고: thymus의 트리밍은 이식 조직 engraftment를 최적화 하기 전에 행해져야 한다.</li>
		<li>외과 영역에 해당 하는 각 막의 기지에 starting, 해가 위 팁 소개 될 수 있도록 외부 각 막 층으로 작은 절 개를 만들기 위해 40 mm G18 바늘의 팁을 소개 합니다.</li>
		<li>5-10 m m 각 막 여 잡고 단단히 resealing 방지 하기 위해 전용 욕실이 위를 사용 하는 각 막의 기초의 주위에 직접 절 개 측면을 확인 합니다. 편평한 끝 집게를 사용 하 여 조직 손상을 방지.</li>
		<li>잘라 각 막 상피를 파악 하 고 개방을 통해 thymic 세그먼트를 추진 하는 동안 평면 종단 집게의 쌍을 가진 각 막 눌러 여 노출. 조작이 완료 될 때까지 조직을 건조를 방지 하기 위해 필요에 따라 살 균 1 PBS (pH 7.4) 또는 인공 눈물으로 눈을 젖은.</li>
		<li>부드럽게 눈 표면에 eye´s 함수를 유지 하기 위해 학생에 관하여 측면 위치를 소개 조직 세그먼트를 누릅니다. 그는 이식 거짓말 눈 반대 위치에 골 탕 먹 여 이미징 후부 간섭 방지 하 여 확인 합니다.</li>
		<li>플랫 포 셉의 도움으로 눌러 단단히, 대 한 약 3-5 s, 서로 자기 봉인 홍보에 대 한 각 막 여의 두 측면. 스테이플링 또는 재 수술 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>양쪽 눈에 이식 수행, 마우스를 직접 해 현미경 렌즈에 두 번째 눈을 노출 하 고 반복 단계 2.3.2-2.3.7 측면 반대편 넘겨.</li>
	<li>수술 완료 되 면, 열 램프와 prewarmed는 빈 케이지를 마우스를 반환 합니다.</li>
	<li>각 이식된 마우스 차릴 다른 동물 들과 함께 공유 하는 감 금 소에 배치 하기 전에 완전 한 성과 의식 하는 것을 확인 하십시오. 이 일반적으로 수술 후 1 시간 이내에 자리를 걸립니다.</li>
	<li>이식 시 필요에 따라 진통제와 쥐를 치료 하 고 식 수에 1.6 mg/mL의 농도에서 아 세트 아미노 펜을 쥐를 제공 합니다.</li>
	<li>각 받는 사람 마우스에 대 한 2.2 2.9 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>잠재적인 건강 합병증을 감지 하는 이식된 눈의 모양 뿐만 아니라 수술 동물 활동을 모니터링 합니다.</li>
</ol>3. confocal 영상 3D 단일 광자 형광 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 이식 Thymi의
<ol><li>Isofluorane 증기의 1-2% 사이의 복용량을 사용 하 여 받는 사람 마우스 anesthetize 적절 한 anesthetization 이미징 절차를 시작 하기 전에 반사 다음 발가락 핀치의 부재에 의해 보장</li>
	<li>그래서 그 하나의 눈 위로 향하도록 사이드 측면 휴식 위치에서 고정된 단계 현미경 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 열 패드는 녹음 하는 동안 마우스의 일정 한 체온을 보장 하기 위해 현미경 플랫폼에 배치 됩니다. 참고: 자세한 내용은 보충 그림 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>Stereotaxic headholder에 마우스의 머리를 삽입 하 고 노브 thymus 이식 들고 눈에 현미경 목표의 직접 접근 측면 사이드 위치에 마우스 머리 억제를 조정 합니다.</li>
	<li>절차에 걸쳐 취 동물을 유지 하는 가스 마스크에 마우스 주 둥이 놓습니다. Isofluorane 증기 필요에 따라 조정 수 있습니다.</li>
	<li>눈 꺼 풀의 철회를 피하 면 서 녹음 하는 동안 눈의 안정화를 촉진 하기 위하여 철수 눈 꺼 풀에 붙어 있는 그들의 팁을 폴 리 에틸렌 관으로 덮여 있는 핀셋의 쌍을 가진 각 막 여백에 눈의 상태를 UST-2 솔리드 범용이 음. 이 머리와 눈의 안정적인 정착을 허용 하 고 앞에서 설명한22로 눈에 혈액 흐름의 중단 없이 유연성을 제공 합니다. 참고: 보조 그림 1B, C는 전체 어셈블리 표시.</li>
	<li>마우스 눈에 현미경 목표를 배치 하기 전에 각 막과 렌즈 사이 침수 액체도 멸 균 식 염 수 나 인공 눈물 몇 방울을 추가 합니다. 참고: 추가 상품 현미경 경로 유지 하 고 눈의 건조를 방지 하는 절차를 통해 필요에 적절 하 게 됩니다.</li>
	<li>먼저 낮은 배율 (X 5) 렌즈를 사용 하 여 현미경 필드에서 thymus를 찾습니다. 다음 더 높은 해상도 (10, 20 및 40 X) 물 침수 긴 작동 거리와 목표를 찍기로 전환. LSM photodamage와 최소한의 레이저 파워를 적용 하 여 thymic 플 표백을 방지 하 고 가능한 스캔 시간을 단축. 이 현미경의 공명 스캐너를 사용 하 여 이루어집니다. 참고: 우리가 사용 하는 confocal 현미경 공명 검사 거울 25 프레임/s에서 이미지를 수집 능력을 갖추고 있다. 다른 브랜드는 공명 스캐너와 함께 자신의 현미경.</li>
	<li>현미경 소프트웨어를 사용 하 여 수집 모드를 선택 하 고 공명 스캐너 모드 시작. 다음 XYZT 이미징 모드를 선택 하 고 인수 설정을 다음과 같이 구성:<ol>
<li>아르곤 레이저를 켜고 형광 여기 30% 전력 조정.</li>
		<li>여기 레이저 라인을 선택 하 고 다른 방출 파장 acousto 광 빔 스플리터 (AOBS) 제어를 설정 합니다. 또한, 후방 산란 검출 및 조직 구조를 나타내는, 사용 반사 탐지 동시에. 참고: 여기 (GFP와 RFP)에 대 한 색상의 세트를 선택할 때는 AOBS는 자동으로 프로그래밍이 여기 라인 표본에와 그들 사이의 방출 전송. 예를 들어, GFP와 RFP, 우리를 사용 하 여 좁은 반사 밴드 여기 빛 약 488 nm 및 561 nm, 각각. 이것은 내보낸된 형광 광자, 레이저 파워 및 수집 시간에 대 한 필요성 감소의 컬렉션에 대 한 광범위 한 밴드. 반사 모드에서는 AOBS 형광 방출 감지에 사용 하는 것 들에서 어떤 파장에서 반사 된 빛의 이미지를 50: 50 빔 스플리터로 사용 됩니다.</li>
		<li>선택 된 파장에서 방출 수집 다음 512 × 512 픽셀의 해상도 선택 하 고 필요에 따라 이득 레벨을 조정 하는 라이브 버튼을 눌러 이미징 라이브 시작 (일반적인 이득은 약 600 V).</li>
		<li>Thymic 임 플 란 트 위에 초점을 맞춤 으로써 시작 및 z 스택의 끝을 정의한 고 시작, 선택 다음 마지막 이식된 thymus에서 집중 될 수 있는 최종선택 평면 이동 합니다. 5 µ m의 z 단계 크기를 사용 합니다. 소프트웨어 자동으로 confocal 비행기의 수를 계산 합니다.</li>
		<li>각 z-스택 (일반적으로 2 초에 1.5)의 수집에 대 한 시간 간격을 선택 하 고 연속 이미징 멈출 때까지 취득 옵션 선택.</li>
	</ol>
</li>
	<li>초기화를 시작 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>이미지는 이식 반복적으로 같은 동물에서 서로 다른 시간에 단계 3.1 3.9를 반복 하 여 합니다. 참고: 동물 이식 양쪽 눈에 좋다면 어느 눈에서 녹음 단계 3.2 3.9 마우스 머리의 수직 위치 측을 전환 후 반복 하 여 이동 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

개별 면역 능력4 T 세포 성숙 과정의 중요성 및 성숙한 T 세포 thymus2,3에 의해 생산에 선구자 세포 역학의 추정된 영향, 광범위 한 노력이 투자 되었습니다. 대안 클래식 고정된 조직 스냅샷 접근을 개발 하십시오.
조직 조각과 다른 explants는 분명히 우수한 재현 monolayers 또는 집계 thymic 기관 문화14,15보다 조직 아키텍처에서 비록는 맥 관 구조에 대 한 연결의 부재 제한 그들의 사용을 공부 하는 항목 또는 TSP (혈관 내 피 세포 장벽 가로질러 창시자의 전 좌)와 출구 (혈관 내 피 세포 장벽 가로질러 성숙한 T 세포의 전 좌) 기관에서의 단계. 그것은 T 세포의 역학 다른 세포와 접촉 가설로...

Intrathymic T-세포 분화 및 T 세포 부분 모집단 선택 개발 및 척추 동물1셀 중재 면역의 유지 보수에 대 한 핵심 프로세스를 구성합니다. 이 과정에서 혈액, 세포 증식 및 마이그레이션 창시자의 채용, 막 단백질, 그리고 하위 집합에 대 한 대규모 프로그램 된 세포 죽음의 차동 식 등 긴밀 하 게 조직 된 이벤트의 복잡 한 순서를 포함 선택입니다. 결과 T-세포로 성숙 외국 항 원의 넓은 스펙트럼에 반응의 출시 자체-펩 티 드, 최소화 된 응답을 표시 하는 동안 주변 림프 기관 개별2,3의 식민지는 끝낼. ΑβTCR 레 퍼 토리의 탈 선 thymocyte 선택 자가 면역 질환 또는 면역 불균형4 주로에서 파생 되는 결함의 음수 또는 양수 전조 선택 프로세스 동안 각각 이끌어 낸다.
Thymus 걸쳐 thymocytes의 방향 이동 T 세포 성숙의 모든 단계에 본질적인 것 이며 그것은 일련의 동시 또는 순차적으로 발산, 접착제를 포함 하 여 여러 자극을 상상 하 고 드 접착제 세포 외 기질 (ECM) 단백질 상호 작용3,5. 고정 조직의 연구는 렌더링 정의 thymic microenvironments5,6, thymocyte 철새 단서에 대 한 표현의 패턴에 관한 중요 한 정보 ex vivo 연구 두 계시는 동안 널리 장기의 2 개의 조직학 명백한 지역에서 thymocytes의 철새 행동: 느린 피 질에서 확률적 움직임과 빠른, 한정 된 운동 성 정도7,8,,910 , 11 , 12 , 13. thymic 긍정적인 선택13 연관 증가 철새 요금 및 부정적인 선택 가설 thymus 통해 여행의 활동 적절 한 결정을 지 원하는 크롤링 동작와 연결 된 thymocytes 성숙 그들의 관련성에도 불구 하 고 thymocyte stromal 세포 상호 작용의 토폴로지 및 기관 microenvironments T 세포 성숙 동안에 걸쳐 thymocyte 운동 역학 병이 정의 유지.
대부분의 비보 전 날짜를 수행 연구 태아 포함 또는 thymic 기관 문화14,15, 조직 조각 또는 그대로 thymic 엽 explants thymocyte 움직임 2 광자 레이저 스캔 하 여 시각화는 reaggregate 현미경 검사 법 (TPLSM)8을 제한 된 최대 작동 거리 및 조직에 따라 1 mm의 깊이 이미징 intravital 이미징 기술16를 검사 합니다. 3D 구조 형성을 연장된 보육 시간에 따라 달라 지는 힘 드는 thymic 기관 문화, 달리 thymic 조각 기술과 그대로 thymic 엽 접근 허가 제어 소개의 특정 하위 집합의 모두, 사전 분류 thymocytes 네이티브 조직 건축 환경에. 그러나, 혈액 흐름은 이후 결 석이 모델은 명확 thymus thymus 실질 또는 성숙한 T 세포의 thymic egression 역학 창시자 (TSPs) 정착의 채용 과정을 공부에 대 한 제한.
Vivo에서 모델 쥐에서 thymic T 세포 성숙 생리학의 연구에 대 한 조각 또는 중 신장 캡슐17 또는 intradermally18안으로 배치 하는 전체 기관 돌출부의 이식 포함 됩니다. 비록 이러한 옵션 보여 조직의 조직 기능 engraftment가 그들의 유틸리티, thymic 이식 동물 내에서 깊은 또는 불투명 직물의 층에 의해 덮여의 위치 비보에 의해 임 플 란 트의 시험에 대 한 그들의 사용 제한 TPLSM입니다.
눈의 앞쪽 챔버 각 막 레이어의 투명도 덕택으로 어떤 이식할 조직을 직접 모니터링을 위한 쉽게 접근할 수 있는 공간을 제공 합니다. 이점의 홍 채에 의해 형성 된 챔버의 혈관과 자율 신경 엔딩, 빠른 revascularization 및 이식19,20reinnervation 풍부 하다. 박사 Caicedo 성공적으로 유지 보수 및 지난21에서 췌 장 독도의 종 적 연구에 대 한이 해 부 공간을 사용 하고있다. 자, 우리 보여이 전략 뿐만 아니라 네이티브 기관 구조 내에서 thymocytes의 역학을 공부 하는 유효한 접근을 구성 하지만 또한 고유 하 게 확장 하는 비보에 조상 모집의 연구에 경도 기록을 허용 하 고 성숙한 T 세포 egression 단계 마우스입니다.

<table><tbody><tr><td>이소플루오란 기화기(이소플루오란 포함</td>) <td>Kent Scientific Corp</td><td>VetFlo-1215</td><td></td></tr><tr><td>해부 범위(광원 포함</td>) <td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 집게</td><td>WPI</td><td>500455</td><td></td></tr><tr><td>중간 절부 집게</td><td>WPI</td><td>501252</td><td></td></tr><tr><td>곡선 팁 미세 절부 집게</td><td>WPI</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 가위</td><td>WPI</td><td>503371</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>WPI</td><td>503243</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>WPI</td><td>500353</td><td></td></tr><tr><td>40mm 18G 바늘</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>일회용 전사 피펫</td><td>Thermofisher</td><td>201C</td><td></td></tr><tr><td>열 패드 및 열 램프</td><td>Kent Scientific</td><td>Corp Infrarred</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>VWR</td><td>83,813,360</td><td></td></tr><tr><td>60mm 멸균 접시</td><td>SIGMA</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>멸균 1x PBS pH(7,4)</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>멸균 물티슈</td><td>Kimberly-Clark</td><td>LD004</td><td></td></tr><tr><td>통증 관리 약물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3035-1VL</td><td></td></tr><tr><td>식염수 또는 Viscotears</td><td>Novartis</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ FLIII</td><td></td></tr><tr><td>헤드 홀딩 어댑터</td><td>Narishige</td><td>SG-4N-S</td><td></td></tr><tr><td>방독면</td><td>Narishige</td><td>GM-4_S</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>Telstar</td><td>BIO IIA</td><td></td></tr></tbody></table>

레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 thymocytes의 비보에 추적 실시간

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

제시 되는 방법의 목적은 쇼, 처음으로, vivo에서 경도 실시간 모니터링를 vascularized 내에서 thymocytes´ 역학의 isogenic 성인 쥐의 앞쪽 눈 챔버로 신생아 thymi의 이식 thymus 세그먼트입니다. 이식, 다음 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 각 막 통해 비보에 비 침 투 적인 반복된 이미징을 셀룰러 해상도 수준에서 수 있습니다. 중요 한 것은, 접근에 추가 이전 intravital T 세포 성숙 모델 이미징 연속 조상 세포 모집 및 성숙한 T 세포 출구 녹음에 대 한 가능성 같은 동물에서 합니다. 시스템의 추가 장점은 이식 조직의 거시적인 신속한 모니터링 허용 이식할 영역의 투명도 그리고 조직의 치료 뿐만 아니라 지역화 된 임 플 란 트에 대 한 허용에 대 한 접근. 주요 제한 되 고 조직의 볼륨을 엽 트리밍에 대 한 요구는 눈 챔버의 감소 된 공간에 맞는. 기관 무결성 패턴 이전 성숙한 T 세포 생산에 대 한 기능 표시 thymus 돌출부를 해 부하 여 최대화 됩니다. 기술은은 잠재적으로 환경 의학 관련 질문 thymus 함수에 관련 된 면역, 면역 결핍, 중앙 허용;의 적합 하다 프로세스 mechanistically 가난 하 게 정의 된 남아 있는입니다. 지도 thymocyte 마이그레이션, 차별화 및 선택 메커니즘의 미세 해 부 소설 치료 전략 개발 T 세포를 대상으로 지도 해야 한다.

Thymus 신생아 쥐에서 b 6에서에서 격리 했다. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas 쥐가이 프로토콜 (단계 1.1-1.9)에 설명 된 대로. 이러한 유전자 변형 쥐에서 닭 베타 걸 발기인 빨간 형광 단백질 변형 DsRed의 식을 지시합니다. 임 플 란 트의 추적을 촉진 세포 (CMV) 즉시 초기 증강의 영향 아래 산악 표준시.
조직 제거, 유전자와 isogenic 개인을 방지 하기 위해: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J 는 주인으로 선정 됐다. 이러한 유전자 변형 생쥐에서 인간 유비퀴틴 C 발기인 기증자와 받는 사람이 조직 사이 명확한 차별화에 대 한 허용 하는 모든 조직에 향상 된 녹색 형광 단백질 (GFP)의 표현에 지시 합니다. 인간의 유비퀴틴 C 발기인의 행동 특정 조 혈 세포 유...

프로토콜의 목표는 레이저 스캐닝 현미경 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 임 플 란 트에 의해 thymocytes의 경도 intravital 실시간 추적을 보여주는 것입니다. 각 막의 투명도는 이식의 vascularization 지속적으로 녹음 시 조 셀 모집 및 성숙한 T 세포 출구 수 있습니다.

레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

이 방법은 자기 면역, 면역 결핍, 중앙 내성 및 흉부 불응력의 기계장치에 관하여 면역학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 혈관 및 접목 마우스 흉선 세그먼트 내에서 선조 모집 및 성숙한 T 세포 환귀의 생체 내 세로 기록을 허용한다는 것입니다. 이 방법은 흉선의 발달 그리고 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 췌장 섬이나 신장 구술과 같은 다른 조직에도 적용 될 수 있습니다.흉기를 분리하려면 마우스를 등쪽 수직 위치에 멸균 흡수성 종이 타월에 라미나르 플로우 후드에 놓고 70%에탄올로 마우스 복부를 닦아냅니다. 아래 복부에 피상적 V 자형 절개를 만들어 흉부 구멍을 노출하고 직선 10 센티미터 해부 가위를 사용하여 복부 미드 라인을 따라 가슴에 0.5 ~ 1 센티미터 절개를합니다. 흉부 구멍을 노출하고 격막과 흉곽 구멍을 통해 두 개의 추가 깊은 0.5 ~ 1 센티미터 측면 절개를 만들기 위해 가슴의 각 측면에 피부를 접을.흉선은 심장 바로 위에 두 개의 창백한 엽으로 나타나야합니다. 곡면 포프 팁을 흉막 아래에 놓고 수직으로 당겨 전체 장기를 추출하여 흉곽의 접이식 뒷면을 직선 집게로 방지합니다. 그런 다음 얼음에 차가운 멸균 PBS를 포함하는 멸균 60 밀리리터 접시에 고립 된 흉선을 잠그고 메스를 사용하여 결합 된 이스머스를 잘라 백리믹 로브를 분리합니다.이식하기 전에 각 수신자 마우스를 태그하고 계량하고 첫 번째 동물을 측면 측측 억양 위치에 놓고 한 쪽 눈이 해부 현미경의 렌즈에 직접 노출됩니다. Vannas 가위를 사용하여, 각 세그먼트가 일부 흉피질과 medulla 조직을 포함하는지 확인하기 위해 지그재그 패턴에 따라 폭1 밀리미터까지 고립 된 흉엽 중 하나를 소비합니다. 큰 조각이 제대로 이식되지 않을 수 있으므로 이식 직전에 흉을 손질하는 것이 중요합니다.다음으로, 수술 영역의 각막 기저에서 시작하여 40mm 18 게이지 바늘의 끝을 사용하여 외부 각막 층으로 작은 절개를 하여 한 쌍의 해부 가위 끝이 도입될 수 있도록 한다. 가위를 사용하여 각막 의 기지 바로 주위5 ~ 10mm 측면 절개를 만드는 동시에 평평한 단조 포셉을 사용하여 각막을 단단히 고정하여 재밀봉을 방지합니다. 평평한 집게로 컷 각막 상피를 잡고, 개구부를 통해 티믹 세그먼트를 삽입하면서 각막의 개구부를 유지합니다.조직이 도입되기 전에 자발적인 재밀봉을 방지하기 위해 각막

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 신생아 chimeras의 생성뿐만 아니라 2 광자 현미경으로 해부하고 예 생체내 이미징에 대한 thymus의 준비를위한 단계별 지침을 제시한다.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

본 연구진은 흉선의 생체 내 영상 획득을 위한 새로운 실험실 도구 및 프로토콜을 개발하였습니다. 이러한 기술은 T 세포 발달이 일어나는 흉선 내의 "니치(niches)"를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

2 - 광자 현미경의 최근 발전은 실시간으로...

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

이 비디오는 인간 폐 종양 절편 내에서 형광 결합 항체로 표지된 상주 종양 침투 CD8 T 세포의 이미징을 설명합니다. 이 기술을 사용하면 컨포칼 현미경을 사용하여 CD8 T 세포 이동을 실시간으로 분석할 수 있습니다.

컨포칼 현미경을 사용한 다양한 종양 영역에서의 상주 T 세포 이동에 대한 실시간 분석

안구 이식 및 공 촛점 현미경을 결합 새로운 접근 방식은 이식 조직 내에서 단일 셀 해상도 세로, 비 침습적 실시간 이미징을...

길이, 비 침습적을위한 안구의 앞쪽 상공 회의소에 이식<em&gt; 생체에</em실시간으로 단일 셀 해상도&gt; 영상

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

이 프로토콜에서는 이미지 거주 종양 침투 CD8 T 세포 인간 폐 종양 조각 내 붙일 결합 된 항 체와 함께 표시 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 CD8 T 세포 이동의 실시간 분석을 허용 한다.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

우리는 경내 주입 후 눈에 리포좀의 스파티오 측두분포를 비침습적으로 연구하기 위해 광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)의 사용을 위한 프로토콜을 제시한다.

광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징

본 논문은 회전 원반 공초점 현미경을 사용하여 망막에서 미세아교세포 운동성과 시냅스 후 눈점과의 접촉을 시각화하고 정량화하는 방법을 시연합니다.

병든 쥐 망막에서 미세아교세포 역학과 시냅스와의 상호작용에 대한 실시간 영상 및 특성 분석

배우세요 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 마우스 눈 앞쪽 챔버에 이식된 흉선에서 흉선세포의 실시간 추적 방법을. 이 기술은 면역학 연구에서 전구세포 모집 및 성숙 T세포 이출을 장기간 관찰할 수 있어 자가면역 및 면역결핍 메커니즘 연구에 활용됩니다.

레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간

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