Name: Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 배우세요 Cas9 리보핵단백질을 이용한 인간 NK 세포 유전자 편집 방법으로 TGFBR2와 HPRT1 결핍 세포를 생성하여 면역치료 연구에 활용하세요. 이 기술은 고효율 유전자 녹아웃으로 종양 면역치료에 기여합니다.

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우리는 원고 편집에 그의 친절 한 도움에 대 한 브라이언 툴 리를 인정 합니다.

건강 한 기증자 버 피 코트에서 중앙 오하이오 지역 미국 적십자 소스 자료로 얻은 했다. 이 연구는 제도적 검토 보드의 전국 어린이 병원으로 면제 연구 될 결정 했다.
1. 인간 NK 세포 정화 및 확장
<ol><li>버 피 코트12에서 PBMCs를 격리 합니다.<ol>
<li>35 mL Ficoll-Paque의 15 mL에 버 피 코트 샘플의 레이어.</li>
		<li>브레이크 없이 20 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고 인터페이스에서에서 PBMC를 수집 합니다.</li>
		<li>PBS의 적어도 동등한 볼륨을 추가 하 여 복구 된 PBMCs 세 번 씻고, 400 x g에서 5 분간 centrifuging와 PBC 발음 세척. NK 세포 RosettesSep13이 단계에서 격리 된 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>비친 10 x 106 mbIL21-표현으로 자극 하 여 NK 세포를 확장 급지대 셀 0, 7, 14 일에. 10%를 포함 하는 신선한 RPMI 미디어 바꿉니다 FBS, 1% 글루타민, 1% 페니실린 스, 그리고 100 IU/mL의 일리노이-2 전체 미디어 볼륨 매일.</li>
</ol>2. gRNA 디자인 및 선택
<ol><li>대상, 온라인 도구, 예를 들면, NCBI, 앙상블을 사용 하 여 특정 게놈 loci를 선택 하십시오. 예를 들어. 설명: 변형 시키는 성장 인자 beta 수용 체 2 (TGFBRR2) ectodomain 기록 보기: PF08917 InterPro 보기: IPR015013 위치: 49-157 aa 대상된 시퀀스: 엑손 TGFBR2 유전자 (ENSG00000163513)의 4</li>
	<li>디자인은 gRNAs, http://crispr.mit.edu 등 'Benchling' CRISPR 디자인 웹 도구 사용 하 여<ol>
<li>2.1 단계에서 선택 하는 DNA 순서에 입력 합니다. 대상 게놈으로 인간 (hg 19)를 선택 합니다. CRISPR 가이드 (20 뉴클레오티드 팸 시퀀스 다음: NGG) 앞에서 입력 한 시퀀스에서 검색 됩니다. 그것은 또한 선택 된 게놈을 통해 가능한 오프 대상 일치를 표시합니다.</li>
		<li>최고의 3 gRNAs는 그들의 표적에 및 오프 대상 요금에 따라 가장 높은 점수를 선택 하십시오. 예를 들어 표 1 exon TGFBR2 유전자의 4 CRISPR 디자인 웹 도구에 의해 제안 된 대상으로 설계 된 CRISPR RNAs를 보여준다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>합성 순서 특정 crRNAs로 CRISPR RNAs를 주문.</li>
	<li>보존, 주문 transactivating RNA (tracrRNA)는 crRNA와 부분 homology를 통해 상호 작용.</li>
</ol>3. 디자인 삭제 뇌관을 심사
<ol><li>T7E1 돌연변이 분석 결과 대 한 gRNA 분열 사이트를 확장 하는 뇌관 디자인.</li>
	<li>SgRNA 대상 사이트에서 작은 삽입-삭제 (indels) 되도록 예측된 분열 사이트에서 사용 뇌관 최소한 100 bp 돌연변이 분석 결과 따라 1.5 %agarose 젤에 표시 됩니다. 표 2 에서는 TGFBR2 ectodomain를 증폭 하는 데 사용 되는 뇌관을 보여 줍니다.</li>
</ol>4. 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 변환
참고: NK에 Cas9/RNPs 요소의 변환 electroporation 4d 시스템을 사용 하 여 다음과 같이 하면 됩니다.
<ol><li>
셀 준비
	<ol>
<li>
기본 NK 세포에 대 한, 갓 고립 된 NK 세포 RPMI 매체 100 IU/mL 일리노이-2의 앞에 4 일 동안 품 어 하 고 하루 5 electroporation를 수행 합니다. 앞서 고 하루 변환 전에 설명한 대로 매일 미디어를 교체 합니다.</li>
		<li>
확장 된 NK 세포에 대 한, 하루 0 1: 1의 비율로 조사 피더 세포에서 세포를 자극 하 고 하루 5 또는 6 또는 7에서 electroporation를 수행 합니다. 앞서 고 하루 변환 전에 설명한 대로 매일 미디어를 교체 합니다.</li>
		<li>Electroporation 당일 100 IU/mL electroporation 및 습도 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 미리 incubate 플라스 크 셀 일리노이-2 포함 하는 신선한 RPMI의 8 mL 가득 T25 플라스 크를 준비 합니다. 참고: 해 동된 셀 이나 2차 또는 3rd 자극 받은 셀 수 있다 electroporated 설명 된 대로 복구 후 언제 든 지.</li>
		<li>변환 믹스의 26 µ L에 대 한 조건 당 3-4 × 106 셀을 가져가 라. 참고: Electroporation 솔루션에서 NK 세포의 매우 높은 농도 변환 속도를 향상 시킵니다.</li>
		<li>3 번 RNase 활동을 일반적으로 포함 된 모든 FBS를 제거 하려면 PBS 가진 세포를 씻어. 8 분 동안 300 x g에서 매번 그들을 회전 합니다. 참고: 7 electroporation Cas/RNPs에 대 한 단일 gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3)로 및 2 개의 gRNAs (gRNA1 gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 + + gRNA3)의 조합 및 아무 Cas9/RNPs 한 컨트롤을 고려 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
crRNA:tracerRNA을 형성 / 복잡 한
	<ol>
<li>200 μ M의 최종 농도에 테 솔루션 x 1에서 crRNAs (gRNA1, gRNA2, 및 gRNA3) 및 tracerRNA resuspend. 표 3에서 같이 200 μ M tracerRNA와 함께 각 200 μ M gRNA의 혼합 2.2 μ.</li>
		<li>샘플 5 분 동안 95 ° C에가 열 하 고 상 온 (15-25 ° C)를 벤치 위에 시원한 수 있습니다. 스토어 resuspended RNAs 및 crRNA: 나중 사용을 위해-20 ° C에서 tracerRNA/복잡 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNP 복잡 한 형성 참고: 시간을 절약 하는 세척 동안 복잡 한 RNP 형성 단계 4.1.5.
	<ol>
<li>단일 crRNA:tracrRNA 이중 반응, 표 4에 있는 예제에서와 같이 36 μ M에 Cas9 endonuclease 희석.</li>
		<li>CrRNA:tracrRNA duplexes의 조합 변환, 희석 36 μ M에 Cas9 endonuclease에 예제에서와 같이 표 5.
</li>
		<li>피 펫 팁, 30 이상 소용돌이 동안 천천히 Cas9 endonuclease crRNA:tracrRNA 쌍 신 회로 추가 1 분에 s.</li>
		<li>15-20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어. 경우 부 화 후 혼합물을 사용 하 여 준비 하지, 사용까지 얼음에 혼합물을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation
	<ol>
<li>P3 electroporation 솔루션 전체 보충을 추가 하 고 실내 온도에서 보관.</li>
		<li>P3 기본 4 D electroporation 솔루션의 20 μ에 셀 펠 릿 (3-4 × 106 세포 단계 4.1.5)를 resuspend. Pipetting 동안 공기 방울을 피하십시오. 참고: 셀 P3 솔루션에 오랜 시간 동안 하지 맡겨야 한다.</li>
		<li>즉시 세포 현 탁 액에 RNP 복잡 한 (단계 4.3)의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>Cas9/RNPs/셀 100 μ M Cas9 electroporation 증강의 1 μ 믹스를 추가 합니다.</li>
		<li>Cas9/RNPs/셀 믹스 20 μ electroporation 스트립으로 전송 합니다.</li>
		<li>부드럽게 샘플 스트립의 하단 커버 되도록 스트립을 누릅니다.</li>
		<li>4 D electroporation 시스템을 시작 하 고 EN-138 프로그램을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 게시 변환
<ol><li>셀 스트립에서 3 분간 휴식 하자.</li>
	<li>에 베트를 미리 equilibrated 문화 미디어의 80 µ L을 추가 하 고 부드럽게 플라스 크에 샘플을 전송.</li>
	<li>변환, 후 48 시간 차단 유전자 삭제에 대 한 5 × 105 셀에서 게놈 DNA를 추출 합니다.</li>
	<li>Taq DNA 중 합 효소 키트와 함께 3.2 단계에서 설계 된 프라이 머를 사용 하 여 관심사의 유전자를 증폭.</li>
	<li>T7EI 소화에 대 한 PCR amplicon heteroduplexes를 형성 하 고 37 ° C에 T7EI 효소와 함께 30-60 분에 대 한 제품을 품 어 참고: 분석 결과 그것은 빠르고, 단순 하 고 제공으로 심사에 대 한 선호 T7EI 측량 분석 결과 사용 하 여에 비해 전기 영동 결과 청소 합니다. 그러나,이 방법은 삽입 및 삭제를 검색할 수 없습니다 < 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 활동 Cas9 RNPs 실험14에 의해 생성 되는 2 기지.</li>
	<li>1.5%에 소화 DNA를 실행 agarose 젤 110 V 30 ~ 45 분, 15 분 마다 시각화 젤.</li>
	<li>MbIL21 표현으로 셀의 나머지 부분을 자극 1: 1의 비율로 피더 세포.</li>
	<li>자극 후 5 일 정량 Pcr를 사용 하 여 유전자 식 수준에 대 한 RNA를 추출 합니다.</li>
	<li>이전에 보고 된12calcein 분석 실험을 실시 합니다. 간단히, calcein 오전 (예, 3 µ g/mL/1000000 DAOY 셀 사용)에서 대상 셀을 로드 합니다. IL2에 밤새 껏 휴식 하 여 NK 세포 세포 독성 분석 실험에 대 한 준비 (100 IU/mL) 10 ng/mL 전후로 용 해 TGFβ. NK 세포는 하룻밤에 휴식 했다로 동일한 cytokines에 calcein 분석 실험을 실시 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li>
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<li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li>
<li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li>
</ol>

DAL 에서는/택배 치료제, 흑 요 석 치료제, Intellia 치료제, 머 크 연구소, 및 Miltenyi Biotec 컨설턴트 역임 했다와 주식/리더십 CytoSen 치료제에 합니다.

NK 세포의 DNA-종속 수정4,9도전 하고있다. 우리는, 따라서, 도입 직접 종합적으로 미리 형성한 ribonucleoprotein (RNPs) 복잡 하 고 Cas9 단백질 순화 된 단백질으로 기본 및 확장 된 NK 세포8로. 이 방법은 미행, 상한, 제거를 허용 하 고 다른 transcriptional 및 변환 프로세스는 RNA 중 합 효소 II는 DNA 의존 변환 메서드에 연결 된 NK 세포 apoptosis를 발생할 수 있습니다 의해 시작.
또한, 보고 하는 방법 여기 사용 순화 Cas9 단백질에 complexed electroporation 직후 활성화 하 고 신속 하 게, 그로 인하여 증가에 대상 및 현재 프로토콜을 통해 감소 하는 대상에서 효과 저하는 Cas9/RNPs 5 <su...

암 immunotherapy 최근 몇 년 동안에서 고급 되었습니다. 유전자 변형 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포는 암 immunotherapy에 성공적으로 배포 하는 설계 된 면역 세포의 훌륭한 예입니다. 이 셀 최근에 대 한 처리를 위한 FDA에 의해 승인 되었다 CD19 + B 세포 악성 종양, 하지만 성공 지금까지 몇 대상 항, 베어링 질병에 국한 되었으며 같은 제한 된 항 원 레파토리를 대상으로 하는 것은 면역 탈출 하 여 실패 하는 경향이. 또한, 자동차 T 세포 이식-비교-호스트 질병 수용자 T 세포에 의해 발생의 헌 T 세포의 사용에 집중 되었습니다 했다. 반면, NK 세포는 종양 표적 항 원 독립적인 방식으로 죽 일 수 있으며 GvHD, 그들에 게 암 immunotherapy6,7,,89에 대 한 좋은 후보를 발생 하지 않습니다.
CRISPR/Cas9 기술 최근 엔지니어링 면역 세포에서 사용 되었습니다 하지만 NK 세포는 플라스 미드 유전자 재프로그래밍 항상 도전 하고있다. 이것은 lentiviral 및 retroviral 변환 상당한 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis와 유전자 조작된 NK 세포4 의 제한 된 생산 유발 등 DNA 의존 방식에서 transgene 배달에 어려움으로 인해 되었습니다. , 9.
많은 타고 난 면역 세포 표현 병원 체 관련 된 분자 패턴에 대 한 수용 체의 상부와 같은 Retinoic 산을 유도할 수 있는 유전자 나 (장비-난), 어떤 외국 DNA의 과장 된 인식의 사용. 유전 수정10DNA 기반 방법을 사용 하 여 때 이러한 통로의 억제 NK 세포에 더 높은 변환 효율을 수 있게 되었습니다.
여기는 DNA 무료 게놈의 편집 기본 및 확장 된 인간 NK 세포 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 활용 하 여 사용 하기 위한 방법을 설명 합니다. Cas9/RNPs는 세 가지 구성 요소, 재조합 Cas9 단백질에 complexed 합성 단일 가이드 RNA complexed crRNA와 tracerRNA의 구성으로 이루어져 있습니다. 이러한 Cas9/RNPs 기능 복합물으로 그들의 배달으로 인해 외국 DNA 종속 접근 높은 효율으로 게놈 목표를 고착 할 수 있다. 또한, Cas9/RNPs 세포에서의 신속한 통관 apoptosis 유도 등 대상 오프 효과 줄일 수 있습니다. 따라서, 그들은 노크-아웃, 또는 동종 재결합6,7에 대 한 DNA와 결합 될 때 노크 기능 생성을 사용할 수 있습니다. 우리는 Cas9/RNPs의 그 electroporation 보였다 NK 세포에서 유전자 조작의 이전 제약을 극복 하는 간단 하 고 비교적 효율적인 방법입니다.
TGFβ는 활성화 및 NK 세포의 기능을 억제 하는 주요 면역 억제 사이토카인 이다. 그것은 TGFβ 통로 대상으로 면역 세포 기능을 높일 수 있습니다 제안 되었습니다. 우리 TGBR2 ectodomain TGFβ11. 을 바인딩하는 인코딩 지역 대상 대표 결과이 유전자의 mRNA 발현의 수준에 상당한 감소를 표시 하 고 추가 수정 된 NK 세포가 TGFβ에 저항력이 될 입증. 또한, 수정 된 셀 유지 생존 및 증식 잠재력, 그들은 확장 된 게시물 electroporation에 비친된 피더 세포. 을 사용 하 여 될 수 있다 따라서, 다음 메서드는 유전자에 대 한 NK 세포를 조작 하는 유망한 접근 방식을 추가 임상 또는 연구 목적.

<table><tbody><tr><td>로제트Sep&trade; 인간 NK 세포 농축 칵테일</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>The RosetteSep&trade; Human NK Cell Enrichment Cocktail은 음성 선택에 의해 전혈에서 NK 세포를 분리하도록 설계되었습니다.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque&reg; PLUS</td><td>GE Healthcare - Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>통합 DNA 기술은</td><td></td><td>독점적인 화학적 변형을 포함하는 TracrRNA를 1072532 뉴클레아제 저항성을 증가시킵니다. Cas9 효소 Alt-R&reg를 활성화하기 위해 crRNA에 혼성화</td></tr><tr><td>; CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>Alt-R&reg로 합성적으로 생산됨; CRISPR-Cas9 crRNA, intrest Alt-R&reg의 유전자를 표적으로 하는 설계된 gRNA의 염기서열에 기반</td></tr>;<tr><td> 게놈 편집 검출 키트</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1075931</td><td>각 키트에는 T7EI 엔도뉴클레아제, T7EI 반응 완충액 및 T7EI 분석 대조군이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>플래티넘&reg; Taq DNA 중합효소 고화질</td><td>Invitrogen</td><td>11304-011</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade; 시스템</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 IL-2 단백질</td><td>Novartis</td><td>65483-0116-07</td><td></td></tr><tr><td>P3 기본 세포 4D-Nucleofector&trade; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td>포함 pmaxGFP&trade; 벡터, Nucleofector&trade; 솔루션, 보충제, 16웰 뉴클레오큐벳&트레이드; 스트립</td></tr><tr><td>비타겟팅: 맞춤형 siRNA, 표준 0.05 2mol ON-TARGETplus</td><td>Dharmacon</td><td>CTM-360019</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1074181</td><td>Cas9 Nuclease</td></tr><tr><td>DNeasy&reg; 블러드 & 조직 핸드북</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>ThermoFisher</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>580706</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 제어 키트, 인간</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1072554</td>에는 <td>tracrRNA, HPRT 양성 대조군 crRNA, 음성 대조군 crRNA#1, HPRT 프라이머 믹스 및 뉴클레아제가 없는 이중 완충액이 포함됩니다.</td></tr><tr><td>IDTE pH 7.5 (1X TE 용액)</td><td>통합 DNA 기술</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Cas9 Electroporation Enhancer</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1075915</td><td>Cas9 Electroporation Enhancer</td></tr></tbody></table>

cas9 ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 nk 세포의 생성

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 기술 많은 세포 유형, 하지만 지금까지 유전자 배달에 게놈 엔지니어링 가속 되 고 안정적인 유전자 수정 기본 NK 세포에 도전 되었습니다. 예를 들어 transgene 배달 lentiviral 또는 retroviral 변환을 사용 하 여 실질적인 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis 때문 NK 세포 유전자 조작의 제한 된 수율 결과. 여기 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 게놈 편집용 DNA 무료 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 TGFBR2 와 의 효율적인 녹아웃 NK 세포에 HPRT1 유전자 허용. RT-PCR 데이터 유전자 식 수준에 중요 한 감소 그리고 대표적인 셀 제품의 세포 독성 분석 실험 제안 RNP 수정 NK 세포 TGFβ에 덜 민감한 되었다. 유전자 변형된 세포 조사 mbIL21 표현 된 자극에 의해 확장 된 게시물 electroporation 수 지류 세포.

Electroporation 효율
Cas9/RNPs의 electroporation 최적화, GFP 비 대상으로 siRNA와 DNA 플라스 미드의 NK 세포로 변환 된 16 가지 프로그램 테스트. 교류 cytometry 분석 결과 엉-138 셀 생존 및 변환 효율 (35% 라이브 GFP 긍정적인 세포) (그림 1 및 그림 2) 두 입자의 높은 비율을 했다 보여주었다. 흥미롭게도,이 프로그램을 사용 하 여 Cas9/RNPs electroporation에 대 한 효율성 높은 우리가 본 TGFBR2 mRNA 식 수준 (그림 5)에서 60% 감소 했다. 또한, 유전자 변형된 NK 세포 성장...

여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

이 방법은 효과기 세포 기능을 조절하는 특정 유전자 및 경로의 역할과 기능에 대한 NK 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 DNA 의존적 접근법에 비해 성공률이 높아 NK 세포 치료에서 임상적으로 가장 관련성이 높은 유전자 중 하나의 매우 효율적인 녹아웃을 촉진한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 면역 탈출 수단으로 TGF-beta를 발현하는 고형 종양 및 뇌종양의 면역 요법으로 확장됩니다.1차 NK 세포 형질도입의 경우, T75 플라스크당 IL2 100IU/100IU가 보충된 RPMI 배지 1밀리리터당 새로 분리된 5개의 NK 세포를 격일과 형질도입 전날 4일 동안 3회 배양합니다. 확장된 NK 세포 transduction을 위해, 격일과 transduction 전날에 배지를 대체하는 1:1 비율로 방사된 막 결합 IL21 발현 K562 공급 세포로 0일차에 primary NK 세포를 자극합니다. 전기천공법 당일, T25 플라스크 1개에 실험 세포 조건당 IL2 1밀리리터당 100IU가 보충된 8ml의 신선한 배양 배지를 채우고 플라스크를 가습된 섭씨 37도 및 5%CO2 인큐베이터에 넣습니다.배지가 평형을 이루는 동안, 26 마이크로리터의 형질도입 혼합물당 조건당 여섯 번째 세포에 3-4배의 10을 원뿔형 튜브에 추가하고 원심분리에 의해 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 세척당 12ml의 멸균 PBS로 세포를 세 번 세척하여 세포 현탁액에서 모든 FBS를 제거합니다. 세포를 세척하는 동안 각 CRISPR RNA 및 tracrRNA를 200마이크로몰 최종 농도로 재현탁합니다.각 CRISPR RNA 2.2마이크로리터를 샘플당 200마이크로몰 부피의 tracrRNA 1개와 혼합하고 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 샘플을 실온으로 식히고 CRISPR RNA/tracrRNA 복합체를 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 리보핵단백질 복합체를 형성하기 위해 30-60초 동안 소용돌이치면서 적절한 해당 CRISPR RNA/tracrRNA 복합체에 Cas9 엔도뉴클레아제를 첨가하고 생성된 Cas9 리보핵단백질 복합체를 실온에서 15-20분 동안 배양합니다.마지막 세척 후, Nucleofector 용액 P3 키트에서 전체 부피의 electroporation 보충제를 추가하고 기포를 피하기 위해 주의하면서 P3 primary 4D-Nucleofector 용액 20마이크로리터에 각 세포 펠릿을 재현탁합니다. 즉시 각 리보핵단백질 복합체 5마이크로리터를 적절한 세포 현탁액에 추가하고 1마이크로리터의 100마이크로몰 Cas9 전기천공증 인핸서를 Cas9 리보핵단백질 복합체 세포 혼합물에 추가합니다. 26마이크로리터의 Cas9 리보핵단백질 세포 용액을 뉴클레오큐벳 스트립의 개별 웰로 옮기고 스트립을 부드럽게 두드려 샘플이 각 웰의 바닥을 덮도록 합니다.그런 다음 4D-Nucleofector 시스템 EN138 프로그램을 시작합니다. 형질도입이 끝나면 세포를 3분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 80마이크로리터의 사전 평형 배양 배지를 각 큐벳에 추가하고 섭씨 37도의 배양에서 조건당 샘플을 하나의 플라스크로 부드럽게 옮깁니다.48시간의 배양 후, 표준 프로토콜에 따라 유전자 결실 스크리닝을 위해 5 x 10에서 5개의 형질도입 세포로 게놈 DNA를 추출합니다. 그런 다음 새로운 막 결합 IL21 발현 공급 세포로 나머지 형질도입 세포를 1:1 비율로 자극하고 정량적 PCR에 의한 유전자 발현 분석을 위한 표준 프로토콜에 따라 5일간의 공동 배양 후 RNA를 추출합니다. 유세포 분석 분석에 따르면 EN138 프로그램은 사용 가능한 Nucleofector 시스템 프로그램 중 가장 높은 비율의 세포 생존율 및 형질 도입 효율을 나타냅니다.예를 들어, 상업적으로 제공되는 가이드 RNA를 사용하여 인간 HPRT1은 확장된 인간 NK 세포에서 성공적으로 녹아웃됩니다. 또한, 가이드 RNA2, 가이드 RNA1 플러스 가이드 RNA2 및 가이드 RNA3를 포함하는 Cas9 리보핵단백질은 성공적인 TGF-베타 수용체 2 엑토도메인 유전자 녹아웃을 나타내는 반면, 가이드 RNA1 단독은 T7E1 검출 가능한 삽입 결실을 유도하지 않습니다. 실제로, Cas9 ribonucleoprotein electroporation를 위한 EN138 프로그램을 사용하면 이 프로그램을 통해 transduction된 세포에서 TGF-beta receptor two mRNA 발현이 60% 감소합니다.또한, TGF-beta 및 인간 1차 수모세포종 세포주와 형질도입된 세포의 공동 배양은 대조군이 아닌 TGF-beta 처리한 형질도입 세포에 비해 NK 세포 독성에 큰 영향을 미치지 않으며, 단백질 수준에서 Cas9 ribonucleoprotein modified cell에서 TGF-beta receptor 2 기능의 상응하는 결핍에 직면합니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 최상의 유전자 편집 결과를 찾기 위해 여러 가지 다른 가이드 RNA를 설계하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 DNA 염기서열분석 또는 T7E1 돌연변이 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 유전자 편집의 효율성 또는 잠재적인 off-target 유전자 돌연변이를 결정하는 방법에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 암 면역 요법 분야의 연구자들이 암 치료에 유전자 편집 NK 세포를 사용할 수 있는 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 일차 인간 NK 세포의 유전자 편집을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 과정 이후의 NK 세포 확장에 대한 자세한 내용은 이전 Jove 기사를 참조하십시오. 인간의 혈액을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 보편적인 건강 및 안전 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 1차 자연살해(NK) 세포의 Cas9 리보핵단백질 매개 유전자 변형 기술을 보여줍니다. CRISPR RNA(crRNA)와 trans-activating crRNA(tracrRNA)를 염기쌍으로 하여 형성된 가이드 RNA(gRNA)에 결합된 Cas9 엔도뉴클레아제로 구성된 Cas9 리보핵단백질은 전기천공법을 통해 1차 자연살해세포에 도입됩니다. 리보핵단백질은 표적 부위에서 숙주 DNA를 표적화하고 절단하여 세포 복구 기계를 통한 표적 유전자의 변형을 통해 유전자 녹아웃을 유도합니다.

CRISPR Cas9을 이용한 자연살해세포의 유전자 편집 기법

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

우리는 바이러스와 같은 입자 내에서 Cas9/단일 가이드 RNA(sgRNA) 리보뉴클레오단백질 복합체를 로드하기 위한 간단하고 저렴한 프로토콜을 개발했습니다. "나노 블레이드"라고 불리는 이러한 입자는 생체 내에서뿐만 아니라 불멸의 및 1 차 세포에서 Cas9 / sgRNA 복합체를 효율적으로 전달 할 수 있습니다.

바이러스와 같은 입자를 통해 불멸과 1 차 세포에서 Cas9/sgRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 전달 ("나노 블레이드")

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

이 프로토콜은 가이드 RNA의 설계부터 녹아웃 클론의 세포 클로닝 및 특성화에 이르기까지 CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃 근세포를 생성하는 방법을 설명합니다.

렌티바이러스 매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 녹아웃 근육 세포주 개발

CRISPR 관련 프로토콜이 점점 더 유용해지고 접근성이 높아짐에 따라 특정 실험 조건에서 복잡성과 장애물이 여전히 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9을 사용하여 수용체 상호 작용 세린/트레오닌-단백질 키나아제 1(RIPK1/RIP1) 녹아웃 인간 세포주를 생성하는 방법을 간략하게 설명하고 이 과정에서 직면할 수 있는 잠재적인 문제를 강조합니다.

CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 RIP1 Knockout U937 세포주 생성

배우세요 Cas9 리보핵단백질을 이용한 인간 NK 세포 유전자 편집 방법으로 TGFBR2와 HPRT1 결핍 세포를 생성하여 면역치료 연구에 활용하세요. 이 기술은 고효율 유전자 녹아웃으로 종양 면역치료에 기여합니다.

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

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