Name: 다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 학습하세요 차세대 16S rRNA 시퀀싱을 활용한 진드기 미생물 특성 분석 방법을. DNA 추출, 증폭, 바코딩을 통해 벡터 미생물군집을 정확히 식별하고 병원체 역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품에 의해 지원 되었다 국립 과학 재단 부여 A.S. (뎁 #1427772, 1745411, 1750037).

1. 틱 컬렉션 및 표면 살 균
<ol><li>틱 틱 관련 서식, 진드기 제거에 1 m2 흰 헝겊을 끌어 호스트 종, 또는 실험실15,16틱 양육 수집. 미세 집게를 사용 하 여 진드기를 조작-80 ° c.에서 그들을 저장 하</li>
	<li>개별 PCR 튜브에 틱 하 고 15 vortexing에 의해 표면 오염 물질을 제거 연속적으로 과산화 수소 (H2O2), 70% 에탄올 및 ddH2오 500 μ s</li>
	<li>새로운 PCR 튜브에 진드기를 놓고 건조 하도록 허용 합니다.</li>
	<li>이 튜브에 기계적으로 박격포와 유 봉 (이 연구에 사용), 작은 구슬 구슬 때리는에 사용 하 여 진드기를 분쇄 하 여 틱 조직을 방해 또는 틱 메스와 떨어져 절단.</li>
</ol>2. DNA 정화
<ol><li>상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트에 제공 된 지침에 따라 개별 틱에서 DNA를 정화. 100 μ의 최종 볼륨을 elute. 참고: 단계 2.2-2.8의 개요 그림 1 을 참조 하십시오. 대체 추출 방법에는 페 놀-클로 프롬 적 출17,18, 에탄올 강수량19또는 추출 chelating 소재20,21포함 됩니다.</li>
	<li>성공 DNA 정화 fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 확인 합니다. Fluorometry, 190 μ 이중 가닥 DNA 분석 결과에서 DNA 템플렛의 10 μ를 사용 합니다. 예상된 수익률은 0.1-1.0 ng/μ22. 분 광 광도 학, 핵 산의 정량화에 DNA 템플렛의 1 μ를 사용 합니다. 예상된 A260/280 비율 약 1.823이다.</li>
	<li>증폭, 즉시 진행-20 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우</li>
</ol>3. 16S rRNA 유전자 증폭
<ol><li>포함 하는 27.5 μ 반응에서 PCR amplicon 설정: 1 μ M;에서 각 뇌관의 5 μ 상용의 12.5 μ PCR 혼합; 그리고 5 ng/μ 농도에 개별 틱에서 추출한 DNA의 5 μ. 참고 다음 프라이 머를 사용 하 여 16S rRNA 유전자13의 하이퍼 V3-V4 영역의 확대를 위한.: 5 '-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'</li>
	<li>튜브에 대 한 프로그래밍 thermocycler 이동: 95 ° c 3 분;에 대 한 초기 변성 30 대 1) 95 ° C의 25 주기 s, 30 ° C 2) 57 s, 30 대 3) 72 ° C s; 5 분; 72 ° C에서 최종 확장 그리고 10 ° c.에 최종 보류</li>
	<li>PCR 완료 되 면, 4-6 μ/샘플 1.5 %agarose 젤에 로드 하 여 PCR 제품을 시각화. 460에서 밴드를 찾고 증폭을 확인 하는 혈압. 참고: Amplicon PCR 제품 보이지 않을 수 있습니다 젤에 샘플 농도 너무 낮은 경우 (< 10 ng). 뇌관 이합체 존재 낮은 농도 샘플에서 일반적 이다. 다른 비 목표 밴드 경우 어 닐 링 온도 조정 하거나 사이클의 수를 감소 합니다.</li>
	<li>정화, 즉시 진행 4 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우</li>
</ol>4. 16 Amplicon 정화
<ol><li>각 샘플에 대 한 새로운 PCR 튜브를 사용 하 여, 케이블의 PCR 제품을 ddH2O 총 60 μ를에 결합. 낮은 DNA 농도와 샘플에 대 한 증폭 바이어스를 줄이고 집중 샘플 수영장을 3 중 amplicon PCR을 수행 합니다.</li>
	<li>실내 온도 소용돌이 그들 사용 하기 전에 잘 상자성 구슬가지고.</li>
	<li>샘플의 60 μ에 상자성 구슬의 48 μ를 추가 하 고 5 분 장소 솔루션은 때까지 5 분에 대 한 자석 선반에 튜브 취소에 대 한 품 어. 제거는 상쾌한. 참고:이 구슬 농도 뇌관 이합체 (< 60 bp)의 제거 대상. 필요한 경우, 다른 일반적인 밴딩을 제거 하 비드 농도 조정 합니다.</li>
	<li>마그네틱 랙 튜브, 추가 갓 80%의 500 μ EtOH. 모든 튜브에 EtOH를 추가한 후 즉시 액체 밖으로 플라스틱. 비즈를 제거 하지 마십시오. EtOH 추가 및 제거 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>5 분, 또는 작은 균열 구슬에 표시 됩니다 때까지 자석 선반에 튜브를 열어두고 여 초과 EtOH를 제거 하는 예제 건조</li>
	<li>TE 버퍼의 20 μ를 추가 하 고 5-10 분 동안 실내 온도에 자석에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>자석에 다시 튜브를 놓습니다. 일단 구슬 및 액체 분리, PCR 제품을 청소를 얻으려면 신선한 튜브는 상쾌한 전송.</li>
	<li>(선택 사항) 4-6 μ/샘플 1.5% 젤에 로드 하 여 성공적인 amplicon 정화를 확인 하려면 제품을 시각화. 460 bp 밴드 표시, 고 아무 뇌관 이합체 이어야 한다.</li>
	<li>샘플을 저장 색인 PCR에 즉시 진행 하지, 4 ° c.</li>
</ol>5. 샘플 바코드 및 정화
<ol><li>앞으로 또는 반전 뇌관, 또는 상업적으로 사용 가능한 라이브러리 인덱스 키트에서 둘 다를 선택 하 여 각 샘플을 독특한 뇌관 조합을 할당 합니다. 참고: 고유 라벨 샘플 시퀀싱 후 차별화 수 있습니다. 키트는 일반적으로 충분 한 뇌관 96-384 샘플 시퀀스를 제공 합니다.</li>
	<li>듀얼 프라이 머, 또는 인덱스, 각 뇌관 (N7xx 및 S5xx), 12.5 μ 상용 PCR 마스터 믹스, ddH2O, 5 μ 그리고 청소 amplicon 제품의 2.5 μ의 2.5 μ를 포함 하는 25 μ 반응에서 PCR을 수행 하 여 샘플을 첨부 합니다.</li>
	<li>튜브에 대 한 프로그래밍 thermocycler 이동: 95 ° c 3 분;에 대 한 초기 변성 8-14 주기 1) 95 ° C 30에 대 한 s, 30 대 2) 55 ° C s 30 3) 72 ° C s; 5 분; 72 ° C에서 최종 확장 그리고 10 ° c.에 최종 보류</li>
	<li>PCR 완료 되 면, 4-6 μ/샘플 1.5 %agarose 젤에 로드 하 여 PCR 제품을 시각화. 550에 밴드를 찾고 증폭을 확인 하는 혈압. 참고: 인덱스 PCR 순환 상태를 시각화 결과 사용 합니다. 일반적인 바인딩 완화 또는 각 샘플에 대 한 보이는 밴드를 사이클 수를 증가 사이클 수를 낮춥니다.</li>
	<li>4 단계에서 나열 된 청소 절차를 반복 합니다. 정리 하는 동안 희석을 방지 하려면 중복에서 인덱스 PCR을 수행 하 고 제품 여기 수영장.</li>
	<li>즉시 라이브러리 정량화 및 정규화를 진행 4 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우</li>
</ol>6. 도서관 정량화 및 정규화
<ol><li>단계는 fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 5.5에서 각 순화, 바코드 제품의 농도 추정 (단계 2.2 참조). 오후 1 시 약의 농도를 테 버퍼에서 샘플을 희석. 참고: 라이브러리 정량화는 시퀀싱 플랫폼에 권장 하는 농도 로딩 하는 샘플을 달성 하는 데 필요한. 도서관 부 량 정량을 통해 이루어집니다 하지만 시 약 및 시간 저장 정량 이전 샘플 농도 추정 합니다. 이 정량화 키트24에서 제공 하는 정량 기준의 평균 농도 1 오후 농도 라이브러리 정량화의 정확도 극대화 하기 위해 좋습니다.</li>
	<li>(라이브러리 정량화 kit)에서 정량 마스터 믹스, ddH2O, 2.0 μ 및 샘플 또는 표준의 2.0 μ의 6.0 μ를 포함 하는 10 μ 반응에서 정량 Pcr를 수행 합니다. 각 샘플 및 큰 정확도 정밀도 대 한 3 중에서 표준 실행 합니다. 세 개 이상의 희석 수준에서 각 샘플을 실행 (예., 오후 0 시 1 분, 1 오후, 그리고 10 오후 예상된 시작 농도 대 한) 정확한 정량화를 위해. 참고: 제공 된 뇌관 및 표준에 대 한 자세한 내용은 정량화 키트 사용에 따라 달라 집니다 및 제품 기술 데이터 시트에서 사용할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 정량화 키트에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	<li>프로그램에 대 한 실시간 PCR 악기를 정량 플레이트 또는 관 이동:; 5 분 동안 95 ° C의 초기 변성 1) 95 ° C의 35 주기 30 s와 45 2) 60 ° C에 대 한 s; 그리고 15 대 1) 95 ° C의 분리 단계 s, 30 대 2) 60 ° C, 및 3) 95 ° C 15에 대 한 s.</li>
	<li>시작 하는 농도 정량 결과에서 얻은 부 량 값과 사용 하는 샘플 희석 수준을 사용 하 여 각 샘플에 대 한 평균을 계산 합니다. 참고: 예를 들어 샘플 희석 1:100,000에 대 한 2pm의 평균 농도 수익률 200의 원래 시작 농도 nM. 부 량 결과; 정확 하지 않을 수 있습니다 주어진된 샘플에 대 한 희석 레벨의 범위 내에 표준 곡선의 경우, 어떤 경우에, 희석 레벨을 조정 하 고 다시 정량 Pcr을 수행.</li>
	<li>4 각 순화, 바코드 샘플 희석 단계 7.5에서에서 계산한 평균 농도에 따라 TE 버퍼에 nM. 참고: 예를 들면, 200의 평균 샘플 농도 nM, 희석 테에 샘플 1시 50분 4 nM 농도 달성 하기 위해 버퍼. 정확한 샘플 농도 시퀀싱 시스템 및 시 약 키트를 사용에 따라 달라 집니다. 권장된 농도 대 한 시퀀싱 시스템 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
	<li>단일 관으로 모든 개별 라이브러리의 동등한 볼륨 (일반적으로 5-10 μ)을 추가 하 여 결합 된 라이브러리를 만듭니다. 참고: 모든 샘플 4 nM 농도에 있어야 해 서 동일한 볼륨 추가 풀링된 라이브러리에서 모든 샘플의 동등한 농도를 달성 한다.</li>
	<li>6.2-6.4 4 nM 농도 확인 하는 결합 된 라이브러리에 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>결합 된 라이브러리 농도 계산 하 고 희석 또는 다시 4를 달성 하기 위해 필요한 Tris 버퍼를 사용 하 여 최종, 풀링된 라이브러리 구성 nM.</li>
	<li>즉시 샘플 로드를 진행-20 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우 손실 또는 변경 내용을 저장 하는 동안 DNA 농도 최소화 하기 위해 정량화 직후 실행 시퀀싱을 수행 합니다.</li>
</ol>7. 도서관 변성 및 희석, 고 시퀀싱 실행 (같은 날에 수행)
<ol><li>NaOH와 단계 6.9에서에서 4 nM 결합된 라이브러리 변성 주: 각 시퀀싱 시스템에 대 한 최종 라이브러리 준비 단계 다. 보다 상세 하 고 업데이트 된 프로토콜에 대 한 시퀀싱 시스템 사용자 가이드를 참조 하십시오. 새로운 사용자가 가능성이 시퀀싱 플랫폼의 사용에 훈련 될 필요가 있을 것 이다 또는 그들의 라이브러리 코어 시퀀싱 시설에 보낼 수 있습니다.</li>
	<li>시퀀싱 시 약 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 버퍼를 사용 하 여 원하는 로드 농도에 변성된 라이브러리를 희석. 참고: 최적의 로드 농도 시퀀싱 시스템 및 일반적으로 1-250 오후25범위에서 다릅니다.</li>
	<li>변성 고 시퀀싱 제어를 희석. 참고: 낮은 다양성 라이브러리에서 발생 하는 시퀀싱 문제에 대 한 수정 시퀀싱 제어를 추가 합니다. NaOH를 사용 하 여 시퀀싱 제어를 변성 하 고 도서관으로 동일한 농도에 희석.</li>
	<li>라이브러리 및 시퀀싱 제어를 결합 한다. 참고: 결합 된 라이브러리를 시퀀싱 제어의 비율 라이브러리 성과 시퀀싱 시스템 사용에 따라 달라 집니다 하지만 일반적으로 1:126.</li>
	<li>결합 된 라이브러리 및 시퀀싱 흐름 셀에 시퀀싱 제어 혼합물을 로드 합니다.</li>
</ol>8. Amplicon 시퀀스 분석
<ol><li>해당 시퀀싱 시스템 사용 하는 클라우드 컴퓨팅 환경에 실행된 통계를 검사 하 여 실행의 전반적인 성공을 평가 합니다. 참고: 연속 읽기 수 등 실행된 통계 시퀀싱 플랫폼 및 시 약 키트 사용에 따라 달라 집니다. 일반적인 시퀀싱 시스템에 대 한 목표 값은 표 1에 나열 됩니다.</li>
	<li>원시 시퀀싱 데이터를 다운로드 하 고 원하는 생물 정보학 오픈 소스 소프트웨어, 양적 통찰력 미생물 생태학 (QIIME)27 또는 Mothur28. 참고: 둘 다 QIIME와 Mothur는 오픈 소스 무료 다운로드. 이러한 프로그램을 사용 하 여 자세한 내용은 온라인 찾을 수 있습니다와 처음 사용자를 위한 상세한 충분히 있습니다. 다음 단계는 QIIME에서 실시 하는 생물 정보학 파이프라인에 대 한 광범위 한 개요를 제공 합니다. Python 친숙 하지만 필요 하지 않습니다 다음 스크립트의 구현을 용이 하 게 한다</li>
	<li>만들고 QIIME에 "validate_mapping_file.py" 스크립트를 사용 하 여 매핑 파일의 유효성을 검사 합니다. 참고: 매핑 파일 샘플 ID, amplicon 뇌관 시퀀스 및 샘플 설명을 포함 한 데이터 분석을 수행 하는 데 필요한 모든 메타 데이터를 포함 합니다. 유효성 검사 단계를 적절 한 형식에 필요한 모든 데이터가 입력 되었습니다 확인 합니다.</li>
	<li>Demultiplex 고 "split_libraries.py" 스크립트 (그림 1)를 사용 하 여 시퀀스를 필터링 합니다. 참고:이 스크립트 샘플 인덱스 뇌관 조합에 따라 바코드 읽기를 할당 하 고 샘플 Id 매핑 파일에서 입력. 그것은 또한 여러 품질 필터링 단계 오류 기반으로 사용자 정의 최소 품질 평가 점수, 시퀀스 길이, 및 최종-트리밍 컷 오프 시퀀싱에 대 한 제어를 수행 합니다.</li>
	<li>"Pick_open_references_otus.py" 스크립트를 사용 하 여 시퀀스에 조작 상 분류학 단위 (OTUs)를 할당 합니다. 참고:이 단계에서 시퀀스 id (일반적으로 97%)의 임계값에 따라 참조 시퀀스 컬렉션에 대 한 클러스터링 됩니다. 참조 시퀀스 컬렉션을 일치 하지 않는 읽기는 서로 대 한 클러스터링 됩니다. 드 노 보 및 폐쇄 기준 OTU 따기 옵션은 또한 사용할 수, 하지만 오픈 참조 따기 QIIME 개발자에 의해 권장 합니다.</li>
	<li>"Alpha_rarefaction.py" 또는 "normalize_table.py" 스크립트를 사용 하 여 OTU 테이블 정규화. 참고:이 단계는 열 합계에는 변형에 대 한 수정 또는 전체 순서 현대 시퀀싱 기술에서 발생 하는 샘플 당 읽습니다. 정규화는 전통적인 진공을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 누적 합계 스케일링 등 다른 방법을 통해.</li>
	<li>여러 알파-, 베타-다양성, 다양 성과 분류학 구성 다양성 분석 "core_diversity_analysis.py" 스크립트를 사용 하 여 한 번에 수행 합니다. 참고: 또는, 이러한 분석 실행할 수 있습니다 별도로 개별 스크립트를 사용 하 여 (예를 들어, "alpha_diversity.py").</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

16S rRNA의 다음-세대 시퀀싱와 벡터 microbiomes 병원 체 전송에 미치는 영향의 연구 활성화 미생물 식별을 위한 표준 접근 되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜 세부 I. pacificus, 라임 병;에 대 한 벡터 종에에서 미생물 커뮤니티 어셈블리를 조사 하기 위해이 메서드를 사용 하 여 그러나, 그것은 쉽게 다른 틱 종 또는 arthropod 벡터 종 연구에 적용할 수 있습니다.
실제로, 16S rRNA 시퀀싱 미생물 분석을 위한 벡터 모기, 체체파리 파리29,,3031, psyllids, 등의 microbiomes 연구를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 벡터 내 미생물 확인을 위해 사용할 수 있는 다른 방법 등 현미경, 배양, 조직학에 게 얼룩이 지기. 이러한 메서드는 시퀀싱 목표...

부활과 벡터 품 어진 질병의 확산을 최근 몇 십년 간에서 글로벌 인간과 야생 동물의 건강에 심각한 위협이 포즈. 이 질병의 대부분에 대 한 효과적인 백신 부족 하 고 제어 노력 벡터와 벡터-호스트 상호 작용의 복잡 한 생물 학적 특성에 의해 방해. 병원 체 전송에서 벡터 내 미생물 상호 작용의 역할을 이해 이러한 문제를 회피 하는 새로운 전략의 개발에 대 한 수 있습니다. 특히, 벡터 관련 미생물 공생, symbionts, 병원 균, 미생물로 사이 상호 작용 병원 체 전송에 대 한 중요 한 결과가 있을 수 있습니다. 압도적인 증거를 이제 벡터 미생물과 질병 말라리아, Zika 바이러스, 그리고 라임 질병1,2,3에 대 한 능력 사이의 링크를 보여 주는 예제와 함께이 단언을 지원 합니다. 그러나, 질병 통제 예방 전략으로 이러한 결과 번역 구조, 기능, 및 벡터 microbiomes의 기원에 대 한 훨씬 더 상세한 이해를 요구 한다. 식별 및 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 미생물 커뮤니티의이 분야에서 앞으로 중요 한 경로 구성 합니다.
병원 체 벡터의 미생물 주민 확인을 위한 절차는 여기 서양 검은 다리 진드기, Ixodes pacificus, Lyme 질병 병원 체의 보렐 리아 burgdorferi종의 벡터를 이용 하 여 제공 됩니다. 틱 항구 다른 절지동물 보다 인간 병원 체의 더 많은 종류의, 하는 동안 상대적으로 작은 틱 microbiomes4의 생물학과 사회 생태에 대 한 알려져 있다. 그것은 분명 진드기 바이러스, 박테리아, 균 류, protozoans 공생, endosymbionts, 및 과도 미생물 주민5,4의 다양 한 배열을 항구. 이전 작업 Ixodes microbiomes 지리, 종, 성별, 생활 단계, 및 혈액 식사 소스6,,78와 관련 된 강력한 변화를 설명 했다. 그러나,이 변화를 기본 메커니즘 알 수와 자세한 출처의 조사와 이러한 미생물 커뮤니티의 보증 합니다. 틱 수직 전송을 통해 미생물을 수집할 수 있습니다 호스트 및 spiracles, 입, 항문 기 공9를 통해 환경에서 글귀와 접촉. 초기 형성 및 개발 틱 미생물의 형성 요인 이해, 특히 수직 및 환경 전송의 상대적 기여도 자연 패턴 및 눈금의 변화를 이해 하기 위한 중요 한 미생물 다양성 및 이러한 지역 사회 병원 체 전송, 질병 또는 벡터 제어 가능한 응용 프로그램 중 상호 작용 하는 방법.
차세대 시퀀싱 등 강력한 분자 기법, 지금 식별 미생물 지역 사회에 대 한 존재 하 고 다양 한 환경 또는 실험 조건에서 벡터 microbiomes 하 채택 될 수 있다. 이러한 높은 처리량 시퀀싱 접근의 출현 전에 미생물의 식별 현미경 검사 법 그리고 문화에 주로 의존 했다. 현미경 검사 법은 신속 하 고 쉽게 기술, 미생물을 식별 하기 위한 형태학 메서드는 본질적으로 주관적이 고 굵고 낮은 감도와 감지10제한. 문화 기반 방법 미생물 식별을 위해 광범위 하 게 사용 하 고 약물 치료11미생물의 감수 성을 결정 하는 데 사용 수 있습니다. 그러나,이 방법은 또한 겪고 있다 낮은 감도에서 환경 미생물의 2% 미만12설정 실험실에서 경작 될 수 추정 되었습니다. 조직학 얼룩 접근 감지 하 고 벡터 내에서 특정 미생물을 지역화, 틱, 내 다양 한 taxa 배포판의 조사 활성화 미생물 상호 작용에 대 한 가설을 공부 고용 또한 있다. 그러나, 미생물 정체성의 사전 지식을 적절 한 얼룩, 미생물 특성화 및 식별에 어울리지이 이렇게 만들기를 선택 하는 데 필요 합니다. 또한, 조직학 얼룩 매우 시간이 오래 걸리는, 힘 드는 프로세스 이며 큰 샘플 크기 위해 잘 확장 되지 않습니다. 생어 시퀀싱은 마찬가지로 그들의 감도 다양 한 미생물 커뮤니티의 탐지에서 제한 등 전통적인 분자 접근.
다음-세대 시퀀싱 샘플의 많은 수에서 미생물의 급속 한 식별 수 있습니다. 표준 표식 유전자 및 참조 데이터베이스 추가 하면 종종 단계로 속 또는 종의 분류학 해상도 향상. 작은 소 단위 ribosomal RNAs는 자주 16S rRNA 유전자 보존 및 가변 지역의 존재로 인해 가장 일반적인 각 세균에 대 한 독특한 amplicons 보편적인 뇌관의 창조에 대 한 허용으로이 목표를 달성 하는 데 사용 됩니다. 종13,14. 이 보고서는 16S rRNA 차세대 시퀀싱을 통해 틱 미생물에 taxa를 식별 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 특히,이 프로토콜 시퀀싱에 대 한 샘플 준비 단계를 강조 합니다. 더는 시퀀싱에 대 한 내용을 일반화 및 생물 정보학 단계 제공 됩니다, 현재 사용할 수 있는 다양 한 시퀀싱 플랫폼 및 분석 프로그램으로 각각의 광범위 한 기존 문서. 이 다음-세대 시퀀싱 방법의 전반적인 타당성은 주요 질병 벡터 내 미생물 커뮤니티 어셈블리의 조사에 적용 하 여 설명 했다.

<table><tbody><tr><td>재료</td><td>/장비</td><td>회사</td><td>카탈로그 #</td></tr><tr><td>1</td><td>DNeasy Blood &의 항목 이름 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>2</td><td>Qubit 4 형광계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q3326</td></tr><tr><td>3</td><td>NanoDrop 8000 분광광도계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td></tr><tr><td>4</td><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td></tr><tr><td>5</td><td>AMPure XP 비즈</td><td>Agen Court</td><td>A63880&nbsp;</td></tr><tr><td>6</td><td>자기 랙</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MR02</td></tr><tr><td>6</td><td>TE 버퍼</td><td>Teknova</td><td>T0223</td></tr><tr><td>7</td><td>Nextera Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1011</td></tr><tr><td>8</td><td>KAPA 라이브러리 수량화 키트</td><td>Roche</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>9</td><td>MiSeq 시스템</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td></tr><tr><td>10</td><td>MiSeq 시약 키트 v3&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td></tr><tr><td></td><td>11 10 mM Tris-HCl(0.1% 트윈 포함) 20</td><td>Teknova</td><td>T7724</td></tr></tbody></table>

다음-세대 16s rrna amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

최근 수십 년간, 벡터 품 어진 질병이 다시 등장 있고 속도, 상당한 병 적 상태와 사망률 세계를 일으키는 놀라운 확대. 효과적이 고 널리 사용 가능한 백신은 소설 질병 완화 전략의 개발을 필요로 하는이 질병의 대부분 부족 합니다. 이 위해, 질병 통제의 한 유망한 애비뉴 벡터 미생물, 미생물 거주 벡터의 커뮤니티를 대상으로 포함 됩니다. 벡터 미생물 병원 체 역학에서 중추적인 역할을 담당 하 고는 미생물의 조작 벡터 품 어진 질병의 소수에 대 한 감소 된 벡터 풍부 또는 병원 체 전송 이어졌다. 그러나, 질병 제어 응용 프로그램에 이러한 결과 번역 벡터 미생물 생태학, 역사적으로이 분야에서 부족 한 기술에 의해 제한에 대 한 철저 한 이해를 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 방법의 출현은 다양 한 미생물 커뮤니티의 급속 한, 높은 병렬 시퀀싱을 활성화 하 고 있다. 높은 보존 16S rRNA 유전자를 대상으로 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 내의 미생물의 characterizations 촉진 했다. 이 기술은 PCR, 시퀀싱, 흐름 셀에 로드 샘플 통해 샘플 바코드, 16S rRNA 유전자의 증폭과 생물 정보학 계통 발생 정보 시퀀스 데이터에 맞게 접근. 종 또는 속 수준 id 복제의 높은 숫자에 대 한 일반적으로 따라서 낮은 검출, 확인, 및 전통적인 경작, 현미경, 또는 조직학에 게 얼룩이 지기에서 출력의 문제를 우회 하는이 접근을 통해 달성 될 수 있다 기술입니다. 따라서,이 방법은 다양 한 조건 하에서 벡터 미생물을 특성화 하는 데 적합 하지만 현재 미생물 함수, 벡터, 또는 항생제 치료에 반응 내에서 위치 정보를 제공할 수 없습니다. 전반적으로, 16S 차세대 시퀀싱 정체성과 역할에서 질병 역학 벡터 미생물의 더 나은 이해를 위한 강력한 기술입니다.

총 3 개의 별도 달걀에서 42 틱 클러치 및 두 환경 노출 기간, 0과 토양, 2 주 미생물 시퀀싱에 대 한 처리 했다. 각 치료 그룹, 6-8 틱 샘플 복제를 포함 한 단일 클러치와 노출 시간으로 간주 됩니다. 이러한 처리 진드기 추출 물 다음-세대 시퀀서에 로드 된 하 고 필터를 통과 하는 12,885,713 쌍 간 읽기를 굴복. 이 실행에 포함 211,214 읽기 (이전 수에 포함)의 총 저조한 추출 단계에서 3 부정적인 컨트롤을 했다. 또한 각 통계에 대 한 최적의 값과 함께 실행된 품질 기준은 표 2에 자세히 나와 있습니다. OTUs는 시퀀싱 깊이, 또는 수의 독특한 시퀀스 샘플 당 읽습니다 2,129 읽기의 충분 한 것 미생물 지역 사회 (의 다양성을 적절 하 게 잡으려고 표시 샘플 당 수가 시퀀싱 노력 관련 진공 곡선 그림 2)입니다. 진공 레벨 샘플 형식에 따라 달라 집니...

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

이 방법은 매개체 매개 질병 생태학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 벡터 마이크로바이옴은 병원체 역학에서 어떤 역할을 하는지, 벡터 마이크로바이옴은 어떻게 형성되고 변화합니까? 이 기술의 주요 장점은 높은 복제, 고분해능 및 식별이 가능하여 사용자가 다양한 생태 및 환경 조건에서 벡터 마이크로바이옴을 정확하게 특성화할 수 있다는 것입니다. 마이크로바이옴 염기서열분석 설정 단계는 배우기 어렵고 사용할 수 있는 다양한 제품과 기술이 있지만 이러한 단계를 학습하는 데 사용할 수 있는 리소스가 거의 없기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 틱 수집을 사용하여 이 절차를 시작합니다. 진드기에서 표면 오염 물질을 제거하려면 500마이크로리터의 과산화수소를 넣고 15초 동안 소용돌이칩니다. 70% 에탄올로 이 세척을 반복한 다음 이중 증류수를 사용하십시오.진드기를 새 PCR 튜브에 넣고 자연 건조시킵니다. 이 튜브에서 필멸자와 유봉으로 진드기를 분쇄하여 진드기 조직을 기계적으로 파괴합니다. 시중에서 판매되는 DNA 추출 키트에 제공된 지침에 따라 개별 진드기의 DNA를 정제합니다.최종 부피 100마이크로리터로 용리합니다. 추출 단계에서 음성 대조군을 생성하는 것은 나중에 의심되는 오염 물질과 실제 벡터 미생물을 구별하는 데 중요합니다. 추출 단계와 이후 PCR 단계에서 멸균 기술을 사용하는 것도 16S 염기서열분석에서 흔히 발생하는 오염의 영향을 최소화하기 위해 필요합니다.1마이크로몰에서 각 프라이머 5마이크로리터와 시판되는 PCR 믹스 12.5마이크로리터를 포함하는 27.5마이크로리터 반응에서 앰플리콘 PCR을 설정합니다. 또한 마이크로리터당 5나노그램 농도로 개별 진드기에서 추출한 5마이크로리터의 DNA를 포함합니다. 튜브를 thermocycler로 옮기고 텍스트 프로토콜에 나열된 프로그램을 실행합니다.PCR이 완료되면 1.5% 아가로스 겔에 샘플당 4-6마이크로리터를 로드하여 PCR 산물을 시각화합니다. 증폭을 확인하기 위해 460 염기쌍에서 대역을 찾습니다. 각 샘플에 대해 새 PCR 튜브를 사용하여 PCR 산물을 이중 증류수와 결합하여 총 60마이크로리터를 얻습니다.DNA 농도가 낮은 샘플의 경우, 증폭 편향을 줄이고 샘플을 집중하도록 풀링하기 위해 앰플리콘 PCR을 3회 수행합니다. 상자성 구슬을 실온으로 가져와 사용하기 전에 잘 소용돌이치십시오. 6

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

미생물 군집을 특성화하는 것은 환경 미생물학의 오랜 목표였습니다. 차세대 염기서열분석 방법을 통해 이제 최소한의 비용과 노동력으로 전례 없는 깊이로 미생물 군집의 특성을 분석할 수 있습니다. 여기에서는 벤치탑 염기서열분석기를 사용하여 박테리아 16S 리보솜 RNA 유전자를 염기서열분석하는 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS) 및 분자 기술(16S rRNA 유전자 염기서열 분석)을 통해 일상적인 진단에서 희귀 박테리아 병원체를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하는 두 기술의 조합에 있습니다.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

반자동된 워크플로 인간 우유와 다른 낮은 바이오 매스 샘플 종류에서 16S rRNA의 타겟된 시퀀싱에 대 한 제공 됩니다.

인간의 우유 샘플의 타겟된 16S 시퀀싱 하는 방법

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

학습하세요 차세대 16S rRNA 시퀀싱을 활용한 진드기 미생물 특성 분석 방법을. DNA 추출, 증폭, 바코딩을 통해 벡터 미생물군집을 정확히 식별하고 병원체 역학 연구에 활용할 수 있습니다.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

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