다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

이 방법은 매개체 매개 질병 생태학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 벡터 마이크로바이옴은 병원체 역학에서 어떤 역할을 하는지, 벡터 마이크로바이옴은 어떻게 형성되고 변화합니까? 이 기술의 주요 장점은 높은 복제, 고분해능 및 식별이 가능하여 사용자가 다양한 생태 및 환경 조건에서 벡터 마이크로바이옴을 정확하게 특성화할 수 있다는 것입니다. 마이크로바이옴 염기서열분석 설정 단계는 배우기 어렵고 사용할 수 있는 다양한 제품과 기술이 있지만 이러한 단계를 학습하는 데 사용할 수 있는 리소스가 거의 없기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 틱 수집을 사용하여 이 절차를 시작합니다. 진드기에서 표면 오염 물질을 제거하려면 500마이크로리터의 과산화수소를 넣고 15초 동안 소용돌이칩니다. 70% 에탄올로 이 세척을 반복한 다음 이중 증류수를 사용하십시오.

진드기를 새 PCR 튜브에 넣고 자연 건조시킵니다. 이 튜브에서 필멸자와 유봉으로 진드기를 분쇄하여 진드기 조직을 기계적으로 파괴합니다. 시중에서 판매되는 DNA 추출 키트에 제공된 지침에 따라 개별 진드기의 DNA를 정제합니다.

최종 부피 100마이크로리터로 용리합니다. 추출 단계에서 음성 대조군을 생성하는 것은 나중에 의심되는 오염 물질과 실제 벡터 미생물을 구별하는 데 중요합니다. 추출 단계와 이후 PCR 단계에서 멸균 기술을 사용하는 것도 16S 염기서열분석에서 흔히 발생하는 오염의 영향을 최소화하기 위해 필요합니다.

1마이크로몰에서 각 프라이머 5마이크로리터와 시판되는 PCR 믹스 12.5마이크로리터를 포함하는 27.5마이크로리터 반응에서 앰플리콘 PCR을 설정합니다. 또한 마이크로리터당 5나노그램 농도로 개별 진드기에서 추출한 5마이크로리터의 DNA를 포함합니다. 튜브를 thermocycler로 옮기고 텍스트 프로토콜에 나열된 프로그램을 실행합니다.

PCR이 완료되면 1.5% 아가로스 겔에 샘플당 4-6마이크로리터를 로드하여 PCR 산물을 시각화합니다. 증폭을 확인하기 위해 460 염기쌍에서 대역을 찾습니다. 각 샘플에 대해 새 PCR 튜브를 사용하여 PCR 산물을 이중 증류수와 결합하여 총 60마이크로리터를 얻습니다.

DNA 농도가 낮은 샘플의 경우, 증폭 편향을 줄이고 샘플을 집중하도록 풀링하기 위해 앰플리콘 PCR을 3회 수행합니다. 상자성 구슬을 실온으로 가져와 사용하기 전에 잘 소용돌이치십시오. 60마이크로리터의 샘플에 48마이크로리터의 상자성 비드를 추가하고 5분 동안 배양합니다.

용액이 투명해질 때까지 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓습니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다. 마그네틱 랙에 튜브를 놓고 갓 준비한 80% 에탄올 500마이크로리터를 추가합니다.

모든 튜브에 에탄올을 첨가 한 직후 액체를 피펫으로 빼내고 비드를 제거하지 마십시오. 에탄올 첨가 및 제거를 한 번 더 반복합니다. 샘플을 자연 건조하여 과도한 에탄올을 제거하려면 마그네틱 랙에서 튜브를 열어 5분 동안 또는 비드에 작은 균열이 보일 때까지 둡니다.

이제 20마이크로리터의 TE 버퍼를 추가하고 실온에서 자석에서 샘플을 배양합니다. 5분에서 10분 후에 튜브를 자석에 다시 끼웁니다. 비드와 액체가 분리되면 상층액을 새 튜브로 옮겨 세척된 PCR 산물을 얻습니다.

시중에서 판매되는 라이브러리 인덱스 키트에서 정방향 또는 역방향 프라이머 중 하나 또는 둘 다를 선택하여 각 샘플에 고유한 프라이머 조합을 할당합니다. 이중 프라이머 또는 인덱스를 샘플에 부착하기 위해 각 프라이머 2.5μL, 시판되는 PCR Master Mix 12.5μl, 이중 증류수 5μL 및 세척된 앰플리콘 제품 2.5μL를 포함하는 PCR 반응을 준비합니다. 튜브를 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 프로그래밍된 thermocycler로 이동합니다.

PCR이 완료되면 1.5% 아가로스 겔에 샘플당 4-6마이크로리터를 로드하여 PCR 산물을 시각화합니다. 이전과 같이 정리 절차를 수행하기 전에 증폭을 확인하기 위해 550 염기쌍의 밴드를 찾습니다. 정제된 바코드 제품 각각에 대한 정확한 정량화를 수행하기 위해 각 샘플과 표준물질에 대해 qPCR을 3회 실행하고 각 샘플을 3회 이상의 희석 수준에서 실행합니다.

6마이크로리터의 qPCR 마스터 믹스, 2마이크로리터의 이중 증류수, 2마이크로리터의 샘플 또는 표준물질을 포함하는 10마이크로리터 qPCR 반응을 준비합니다. qPCR 플레이트를 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프로그래밍된 Real-Time PCR 기기로 옮기고 실행을 수행합니다. 정량화 후, 모든 개별 라이브러리의 동일한 부피를 단일 튜브에 추가하여 결합된 라이브러리를 생성합니다.

결합된 라이브러리와 염기서열분석 대조군을 희석 및 변성한 후, 결합된 혼합물을 염기서열분석 플로우 셀(Sequencing flow cell)에 로드합니다. 최적의 광학 장치를 위해 로드하기 전에 플로우 셀을 철저히 청소하십시오. 그런 다음 플로우 셀(flow cell)을 시퀀서에 로드하고 앰플리콘 염기서열 분석을 수행합니다.

시퀀스 카운트 정규화에 대한 희박 곡선이 여기에 표시됩니다. 이러한 곡선은 샘플당 2000개의 염기서열까지 희박한 것만으로도 관찰된 조작적 분류학적 단위의 전체 다양성을 포착하기에 충분해야 함을 나타냅니다. 희귀 및 품질 필터링 후 염기서열 판독, 알파 및 베타 다양성 출력이 수행됩니다.

여기에 표시된 것은 진드기 마이크로바이옴 구성이 치료에 따라 어떻게 다른지 보여주는 자동으로 생성된 원리 좌표 분석 플롯입니다. 또한, 여기에 표시된 각 샘플에 존재하는 미생물의 시각화는 문 수준에서 모든 샘플에 대해 자동으로 생성됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 염기서열 데이터 해석에 심각한 영향을 미칠 수 있는 미생물 오염의 영향을 최소화하기 위해 멸균 기술을 유지하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 조직학적 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 관찰된 미생물이 벡터 내에서 어디에 위치하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 방법은 분자 생태학 분야의 연구자들이 벡터 내 미생물 상호 작용의 역할을 탐구하고 이것이 병원체 전달에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 조사할 수 있는 길을 열었습니다.