Name: Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 학습하세요 Xenopus laevis 달걀 추출물을 이용한 미세유화액 기반 세포 주기 진동 재구성 방법을. 이 기술은 유사분열 네트워크와 세포 주기 역학의 고처리량 정량 분석을 가능하게 합니다.

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우리 감사 마들렌 루 securin mCherry 플라스 미드, 무릎 남자 리, 케네스 호 및 물방울 생성에 대 한 토론을 위한 알 렌 P Liu, 제레미 B. 장과 제임스 E. Ferrell Jr GFP NLS 구성 제공 하기 위한 건설. 이 작품은 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다 (이른 경력 그랜트 #1553031), 건강의 국가 학회 (미 라 #GM119688), 및 슬론 연구 장학금.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 세포 주기 재구성 및 탐지에 대 한 자료의 준비
<ol><li>
플라스 미드 DNA 건설과 securin mCherry의 mRNA 정화에 대 한 복제 깁슨 어셈블리
	<ol>
<li>PMTB2 벡터 백본, securin, 그리고 연쇄 반응 (PCR)을 통해 mCherry를 포함 하 여 3 개의 DNA 조각을 준비 하 고 정화21,22젤.</li>
		<li>fluorospectrometer을 사용 하 여 파편의 농도 측정 합니다. 백본 1에서 securin 및 mCherry 삽입과의 결합 100 ng: 1:1 분자 비율 5 µ L에 대 한 반응의 총 볼륨 조절 이온된 수를 추가 하 고.</li>
		<li>1의 3 mL와 함께 등온 어셈블리 반응 버퍼 x 5의 6 mL 준비 M Tris-HCl (pH 7.5), 1 M MgCl2, 600 10 mM dNTP의 µ L, 1 M DTT의 300 µ L, 페그-8000, 1.5 g 및 나드23의 20 밀리 그램의 300 µ L.</li>
		<li>1 x 등온선 어셈블리 반응 버퍼 aliquot의 15 µ L를 결합된 조각을 추가 합니다. 15 분 동안 50 ° C에서 PCR 반응 관에 반응을 품 어.</li>
		<li>0.8 %agarose 젤과 전압 10 V/cm이이 파편의 어 닐 링 효율 확인의 실행을 확인 합니다.</li>
		<li>생성 된 플라스 미드를 정화 하 고 elute RNase 무료 물 15 µ L를 사용 하 여. 50 순화 된 플라스 미드 DNA의 1 µ L 변환 µ L DH5α 유능한 대장균 의 세포24 미래 사용을 위해.</li>
		<li>추출 및 securin mCherry DH5α 유능한 대장균 에서 DNA 플라스 미드 정화 셀.</li>
		<li>MRNA에 선형화 securin mCherry 플라스 미드 DNA를 transcribe 고 정화는 mRNA. MRNA의 농도가 100 ng / µ L 이며 260에서 흡 광도의 비율을 확인 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm 및 280 nm은 약 2.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Demembranated Xenopus laevis 정자 DNA의 준비 참고: 머 레이 19911에서 적응.<ol>
<li>성인 남성 Xenopus laevis안락사25 와 4 개의 남성 개구리26,27testes를 해 부.</li>
		<li>4 개구리에서 testes 동일한 100 mL 페 트리 접시에에서 놓습니다. 감기 1 x MMR 솔루션 (0.1 M NaCl, KCl 2mm, MgCl2, 2mm CaCl2, 5 mM HEPES, 0.1 m m EDTA의 1 mM) 50 mL에 세 번 testes를 씻어.</li>
		<li>100 mL 페 트리 접시에 testes에서 과잉 혈액과 지방 제거 하 고 찬 핵 준비 버퍼 (일) (250 m m 자당, 15 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5 m m spermidine trihydrochloride, 0.2 m m spermine tetrahydrochloride)에 두 번 세척.</li>
		<li>핵 준비 버퍼 (일)을 제거 하 고 0.2 cm 100 mL 페 트리 접시에에서 해 날카로운가 위를 사용 하 여 보다 작은 길이 조각으로 testes를 잘라. 추가 분석에 대 한 고환에 찬 일의 8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>사용 나일론 메시 직물 70 µ m의 기 공 크기와 testes를 필터링 하 고 15 mL 원뿔 관으로 정자 샘플을 수집. 4 ° C에서 10 분 동안 1,730 x g에서 수집된 sperms 아래로 회전 시키십시오 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>일의 1 mL 및 50 µ L 10 mg/mL lysolecithin의 정자 세포를 공급 하 고 demembranate 정자 세포를 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>Demembranated 정자 DNA 3 %BSA 솔루션 감기 일의 10 mL로 세 번 세척.</li>
		<li>DNA는 hemocytometer와 정자의 밀도 측정 합니다.</li>
		<li>액체 질소에 5 µ L aliquots에 정자 DNA를 동결 하 고-80 ° c.에 저장 정자 DNA의 최적 농도 약 105 핵 / µ L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
GFP 핵 지 방화 신호 (NLS GFP)의 단백질 정화
	<ol>
<li>BL21 GST 태그 GFP NLS 플라스 미드를 변환 (DE3) 유능한 대장균 세포5.</li>
		<li>1 시간 동안 37 ° C에서 항생제 없이 셀을 품 어 하 고 있는 파운드 agarose 판 100 µ g/mL 암 피 실린에 확산.</li>
		<li>셀 단일 식민지로 성장 14 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품 어. 선택 하 고 단일 식민지 파운드 미디어 100 µ g/mL 암 피 실린의 4 mL에 접종. 12 시간 동안 37 ° C에서 세포를 흔들어.</li>
		<li>압력가 YT 미디어 (Bacto tryptone의 16 g, Bacto-효 모 추출 물, NaCl의 5 g의 10 g)를 준비 하 고 37 ° c YT 미디어 열</li>
		<li>100 µ g/mL 암 피 실린 preheated YT 미디어의 250 mL에 파운드 미디어에서 하룻밤 incubated 셀의 1 mL를 접종 하 고 셀 밀도 높이기 위해 2 시간 동안 흔들어.</li>
		<li>측정 셀 광학 밀도 (OD) 30 분 마다 600의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm. 0.1 m m IPTG OD 값에 도달 하면 0.1 GFP NLS 단백질 발현을 유도 하는 셀에 추가 합니다.</li>
		<li>18 ° C 하룻밤 세포 성장 율을 더 나은 단백질 식 및 합성에서 세포를 흔들어.</li>
		<li>5 분 동안 4 ° C에서 34,524 x g에서 셀 아래로 회전 시키십시오 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>셀 펠 릿 40 ml PBS 버퍼 (50 mg/mL lysozyme의 800 µ L, leupeptin, pepstatin, 및 chymostatin, 10mg/mL 혼합의 13.2 µ L PMSF 0.2 M, 0.5 M EDTA의 8 µ L의 100 µ L 함께 제공 됨)의 resuspend와 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>휴식 4 x 30 20 kHz의 주파수는 sonicator를 사용 하 여 셀 아래로 출시 각 쥡니다 사이 30 s 간격으로 s GFP NLS 단백질 표현.</li>
		<li>깨진된 세포를 제거 하는 35 분 20000 x g에서 회전 합니다.</li>
		<li>친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 추출 하 여 GFP NLS 단백질 정화.</li>
		<li>1.5 mL 비드 슬러리 PBS 버퍼의 15 mL로 세 번 세척 하 고 반전 4 ° C에서 4 시간 동안 구슬 lysate의 250 mL를 품 어.</li>
		<li>5 분 x g 2000에서 구슬 아래로 회전 시키십시오 고 구슬에 세척 솔루션 (25mm Tris 기본, pH 7.5, 500 mM NaCl, 그리고 5 mM DTT) 10 mL를 추가 합니다. 차입 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 8.8, 20 m m 감소 티, 그리고 5mm DTT) 4 ° c.에 회전의 700 µ L에서 구슬을 품 어 50 µ L의 양으로 차입의 약 수를 수집 합니다.</li>
		<li>Coomassie 파란 젤28을 실행 하 여 수집 된 단백질의 농도 측정 합니다.</li>
		<li>버퍼 교환을 통해 스토리지 버퍼 (20 mM HEPES, 150 m m KCl, 10% 글리세롤, pH 7.7) 3 mL와 PD-10 열을 사용 하 여 단백질 elute</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 Xenopus 사이클링의 추출
참고: 추출 준비의 전반적인 절차 그림 1A에서 보여 줍니다. 머 레이 19911에서 적응.
<ol><li>10 일 전에 알 66 IU 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)와 3 성숙 여성 Xenopus laevis 을 주사.</li>
	<li>18 시간 추출 물 순환의 준비 전에 누워 계란을 유도 하기 위해 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (HCG)의 500 IU와 이러한 Xenopus 개구리를 주사.</li>
	<li>밤새 누워 계란을 삭제 합니다. 실험 (데이터 표시 되지 않음)에 따라, 갓된 알에서 준비 된 추출 물 같은 여성 개구리에서 누워 계란에서 준비 된 추출 물 보다 더 긴 지속 활동을 생성 합니다. 각 여성 개구리의 알을 쥐 어 짜기 100 mm 페 트리 요리 0.2 x MMR 버퍼의 10 mL로 하 고 스테레오 현미경 검사.</li>
	<li>동물과 식물성 극 사이의 불분명 한 경계 또는 동물 기둥 위에 불규칙 한 흰 반점이 계란의 일괄 처리를 삭제 합니다.</li>
	<li>명확 하 게 차별화 된 동물과 식물성 폴란드와 계란의 균질 인구를 제시 하는 한 여성 개구리에서 계란의 배치를 선택 하 고 600 mL 비 커에 계란을 전송.</li>
	<li>초과 0.2 x MMR 버퍼에 밖으로 부 어 하 고 부드럽게 추가 250 mL 100 mL 당 2g의 시스테인 (pH 7.7) 1 x 추출 버퍼 (100 m m KCl, 0.1 m m CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50mm 자당, pH 7.7) 계란.</li>
	<li>손으로 계란을 적극적으로 악수 하 고 계란 시스테인의 800 mL의 총 볼륨 3 세척 3 분 또는 계란 집계까지 버퍼와 젤리 코트 제거 성공을 나타내는 비 커의 하단에 정착의 젤리 코트를 제거 합니다.</li>
	<li>워시 계란 0.2 x MMR 솔루션의 1 리터와 4 시간 이상.</li>
	<li>선택 하 고 흰색 유리 전송 피 펫을 사용 하 여 설정 하는 계란을 삭제.</li>
	<li>MMR 버퍼에 밖으로 부 어와 0.1 µ g/mL 칼슘 ionophore 활성화를 위한 0.2 x MMR 버퍼에 A23187 솔루션의 200 mL와 함께 계란을 공급.</li>
	<li>유리 피 펫의 넓은 개방 면을 사용 하 여 부드럽게 계란 활성화 되 고 칼슘 ionophore 솔루션을 제거할 때까지 계란을 저 어 줍니다.</li>
	<li>계란 비 커의 하단에 정착 후 활성화 효율성을 확인 하십시오. 잘 활성화 된 알 약 25%는 동물 극과 식물성 극의 75%의.</li>
	<li>두 번 추출 버퍼 protease 억제제 (10 µ g/mL 각 leupeptin, pepstatin, 및 chymostatin)와 보충 x 1의 50 mL와 함께 활성화 된 계란 세척.</li>
	<li>계란 0.4 mL 스냅 캡 microtube 신중 하 게 전송 하 고 다음 600 x g 30 초 60 초 동안 200 x g에서 원심 분리를 통해 달걀 팩.</li>
	<li>계란을 추출의 희석을 줄이기 위해 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 위에 여분의 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 15000 x g에 계란을 분쇄</li>
	<li>짓 눌린된 달걀의 3 개의 층을 분리 하 고 중간 계층에서 원유 세포질을 유지 하는 면도날으로 튜브를 잘라.</li>
	<li>새로운 ultracentrifuge 튜브, 원유 세포질을 전송 하 고 protease 억제제와 cytochalasin B 10의 µ g/mL 각 보충.</li>
	<li>다시 더 세포질 노른자위 초과 지질을 제거 하 여 정화를 5 분간 4 ° C에서 15000 x g에서 원유 세포질 원심</li>
	<li>계속 갓 준비 얼음에 추출 합니다.</li>
</ol>3. 물방울 생성
<ol><li>
2D 유리 챔버 준비 참고: 사각형 유리 튜브 챔버 쉽게 관찰 및 데이터 수집에 대 한 수 있도록 하나의 2 차원 평면에서 방울을 제한 하는 역할을 합니다.<ol>
<li>잘라 2 m m x 100 µ m의 내부 차원 가진 직사각형 유리 튜브 4mm 긴 조각. 숫 돌의 날카로운 가장자리를 사용 하 여, 빛 조각으로 유리 튜브의 외부 표면에 원하는 경계 표시 다음 부드럽게 유리 튜브의 조각 끊다 에칭의 양쪽에 압력을 적용 합니다.</li>
		<li>95 ° c.에 건조 목욕 인큐베이터가 열 사전 열 블록을 꺼내와 폴 리카 보 네이트 진공 desiccator에 배치.</li>
		<li>Trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 난방 블록에서의 30 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 배치 합니다. 열 블록을 약 5 cm에서 진공 desiccator 내부 컷 유리 튜브를 하다.</li>
		<li>진공 펌프는 desiccator를 연결 합니다. 원하는 진공 수준에 도달 하는 1 분 동안 펌프를 켭니다 다음 유리 튜브의 내부 벽 코트 trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 란 증기 하는 desiccator 인감 3 방향 밸브를 닫습니다. 이 방울을 안정화에 대 한 소수 성 환경을 만들 것입니다.</li>
		<li>하룻밤 코팅 desiccator 내부 유리 튜브를 둡니다. 튜브 사용 다음 날을 위해 준비 될 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
작은 물방울 생성 및 이미징 참고: 작은 물방울을 생성 하 고 이미징 절차는 그림 1B 및 1 c.에서 설명<ol>
<li>10 ng / µ L을 2 단계에서 준비 된 추출 물 공급 securin mCherry mRNA 간단한 세포질 전용 세포 주기 실험에 대 한. 또는, demembranated 정자 염색 질 (추출의 µ L 당 250)와 전원 추출, 10 µ M GFP NLS 단백질, 그리고 10 ng / µ L securin mCherry mRNA 정기적인 핵 형태학을 전시 하는 작은 물방울을 만들을 변경 합니다.</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 추출의 믹스 20 µ L 재조합 단백질 이나 mRNA와 함께 제공 2 %perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜의 200 µ L (PFPE-PEG) fluorosurfactant HFE7500 불 기름에.</li>
		<li>와 동 믹서를 사용 하 여 방울을 생성 합니다. 방울 크기의 범위 소용돌이 속도 및 기간에 의해 변조 될 수 있습니다. 만들 방울 반지름 50에서 200 µ m에 이르기까지, 56 x g (4.9 m m의 반경으로 3200 rpm)에서 소용돌이 속도 설정 하 고 부드럽게 눌러 추출 포함 하는 microcentrifuge 튜브 및 계면 활성 제 혼합물 믹서에 3.5 초에 대 한. 시각적으로 작은 물방울은 크기가 균일 경우 검사 합니다.</li>
		<li>20 µ L 피 펫을 사용 하 여 PCR 관으로 가기 고 PFPE 못 계면의 동일한 볼륨에 떠 있는 물방울을 전송. 유리 튜브 1.5 mL microcentrifuge와 대기 물방울 레이어로 단계에서 준비 하는 방울 튜브의 약 75% 가득 튜브 완전히 채워집니다 때까지 계면 활성 제 층으로 튜브를 밀어 때까지 찍어. 드롭릿 밀도 낮은과 밀로 인 한 중복 또는 모양 왜곡 없이 챔버 내부에 한 층을 형성 방울 허용 됩니다.</li>
		<li>미네랄 오일 40 m m의 직경을 가진 유리 하단 접시를 채우십시오. 부드럽게 좋은 트위터를 사용 하 여 내려 그들을 추진 하 여 오일에서 방울 채워진 튜브를 담가.</li>
		<li>후 모든 샘플, 유리를 사용 하 여 표시 모든 파편을 제거 하는 플라스틱 또는 방울을 유출. 더 많은 미네랄 오일 추가 튜브 또는 이미징 프로세스에 완전히 몰입 될 것입니다.</li>
		<li>자동화 한 x-y 무대를 갖춘 epifluorescence 현미경에 방울의 이미지를 실시 ( 재료의 표참조). 4 X 어 목표를 사용 하 여 모든 이미지에 대 한. 형광 이미징, 형광 조명, 광원 및 GFP 필터 (여기 482/35 nm 및 방출 514/LP nm)를 설정 하 고 mCherry 필터 (여기 562/40 nm 및 방출 641/75 nm) 이미징 130 W 수은 증기 짧은 아크 램프를 사용 GFP NLS 및 securin mCherry 신호입니다.</li>
		<li>밝은 분야 및 여러 형광 채널 방울 그들의 활동을 잃을 때까지 6-9 분 마다 기록 시간 경과 비디오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석
<ol><li>
세분화와 방울의 추적
	<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어 ".tif" 또는 ".oif"의 형식으로 기록된 데이터를 가져오기 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>밝은 필드 채널을 사용 하 여 단일 방울 세그먼트. 밝은 분야 이미지 어두운 경계와 밝은 원으로 물방울 표시 됩니다. 이미지에 임계 처리를 적용 합니다. 각 표면 해당 물방울의 전체 면적을 어둡고 밝은 픽셀 사이의 임계값을 조정 하 여 추적 표면 각 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>자동으로 자동 회귀 모션 알고리즘을 사용 하 여 인접 프레임 사이의 세그먼트를 추적 합니다. 정확 하 게 추적 하는 작은 작은 물방울을 대부분 방울의 반지름 보다 작아야 두 인접 프레임 사이 작은 물방울의 허용 최대 여행 거리를 조정 합니다.</li>
		<li>시각적으로 모든 잘못 된 세그먼트를 검색 하는 전체 비디오 세그먼트 빈 공간 간의 추적 대신 실제 방울 방울을 확인 합니다. 수동으로 잘못 된 트랙을 삭제 합니다.</li>
		<li>배경 형광 강도를 한 방울 없이 세그먼트 및 트랙 배경 영역입니다. 신호 노이즈를 개선 하기 위해, 각 시간 프레임에서 물방울의 형광 강도에서 배경 강도를 뺍니다.</li>
		<li>시간이 지나면서, 평균 및 표준 편차 형광 강도 및 드롭릿 지역을 포함 하 여 ".csv" 파일로 각 트랙에 대 한 측정 된 매개 변수를 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
방울 크기와 진동의 데이터 분석
	<ol>
<li>각 작은 물방울에 대 한 시간이 지나면서 형광 강도 플롯 하려면 R로 ".csv" 파일을 로드 합니다. ".Csv" 파일로 기록 방울 ID입니다.</li>
		<li>Matlab으로 분석 소프트웨어와 방울 ID의 목록이 ".csv" 파일에서 내보낸 ".csv" 파일을 가져올 하 고 추가 데이터 분석을 위해 ".mat" 파일로 저장 합니다.</li>
		<li>세분화와 유리의 높이 챔버19후 내보낸된 드롭릿 지역 정보에 따라 압축 된 물방울의 볼륨을 계산 합니다. 볼륨을 사용 하 여 구체로 작은 물방울의 반지름을 계산.</li>
		<li>시간 지점의 봉우리와 골짜기 피크/물마루 탐지 알고리즘을 사용 하 여 압축을 풉니다. 봉우리와 골짜기 그들은 정확 하 게 감지 되도록의 위치에 수동 수정 수행 합니다.</li>
		<li>세포 주기 기간을 계산 하기 위해 두 개의 인접 한 봉우리 사이의 간격 시간을 계산 합니다. 그것의 세포 주기 기간으로 각 방울에 대 한 모든 간격의 평균을 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1839804">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li>
<li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li>
<li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdk1-APC%2FC+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed%2C+ultrasensitive+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li>
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<li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator%3A+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li>
<li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li>
<li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li>
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<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li>
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</ol>

공개 하는 것이 없다.

우리는 그 수에 체 외 재구성 및 단일 세포 수준에서 자체 지속적인된 세포 주기 진동의 장기 추적 높은 처리량 인공 세포 시스템을 개발 하기 위한 새로운 방법을 제시 했습니다. 이 메서드를 성공 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 좋은 품질을 가진 첫 번째, 갓 Xenopus 달걀 누워 계란에 비해, 오래 지속 진동 활동 추출 물을 생산 하는 경향이 있다. 둘째, 계면 안정화 microenvironments에서 추출 물 캡슐은 진동 활동을 유지 하기 위해 중요 합니다. 얇은 튜브 굴레 쉽게 이미지 프로세싱 및 장기 추적을 위한 단일 레이어 내에서 물방울에 기름 방울의 세 번째, 보육 넷째, 낮은 표면 에너지를 반대로 접착제로 trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H perfluorooctyl) 실 란과 튜브 내벽을 코팅 추출 활동을 유지 도움이 됩니다. 다섯째, 오일 튜브 씰링 방울 흐름을 방지할 것. 오일 밀봉 방법 또한 증발을 방지 하 고 더 추출 활동을 보존 수 있습니...

Xenopus laevis 계란에서 준비 하는 세포질 추출 물 중 가장 주된 모델 oocytes, 급속 한 세포 주기 진행 및 재구성 하는 능력의 큰 볼륨을 주어 세포 주기의 생화학 연구에 대 한 대표 mitotic 이벤트 체 외에서1,2. 이 시스템 초기 발견과 필수적인 세포 주기 레 귤 레이 터의 기계적 특성 등 다운스트림 mitotic 프로세스 뿐 아니라 성숙 촉진 인자 (MPF) 스핀 들 어셈블리 및 염색체 분리1 같은 수 있다 ,2,3,,45,6,7,8,9,10, 11. Xenopus 달걀 추출 물 또한 세포 주기 시계8,12,,1314 의 규제 네트워크의 상세한 해 부 및 DNA 손상의 연구에 대 한 사용 되었습니다. /replication 검사점15 그리고 mitotic 스핀 들 어셈블리 검사점16,,1718.
Xenopus 달걀 추출 물을 사용 하 여 셀의 이러한 연구는 주로 되었습니다 기반으로 대량 측정 합니다. 그러나, 기존의 대량 반응 분석 실제 셀 동작, 그들의 크기 및 반응 분자의 subcellular 공간 구획에 큰 차이가 주어 모방 하지 않을 수 있습니다. 또한, mitotic 활동의 대량 측정 전에 신속 하 게 감쇠8사이클의 제한 된 수를 주는 경향이 있다. 대량 반응의 이러한 단점 추가 복잡 한 시계 동적 속성 및 기능에 대 한 이해를 제공 하기 위해 추출 시스템을 방지 했습니다. 최근 연구는 셀 무료 cytostatic 요인 체포 (CSF) Xenopus 추출 물19,20 크기 정의 셀 같은 구획에 의해 스핀 들 크기는 변조 하는 방법을 명료 하 게 도운로 캡슐화는 세포질 볼륨입니다. 그러나,이 생체 외에서 시스템은 cytostatic 요소1의 행동에 의해 감수 제 2 분열의 분열에서 체포 하 고 세포 주기의 추가 조사에 대 한 단일 셀 수준에서 장기 지속적인된 진동 수 있는 시스템 필요 발진기입니다.
공부 하 고 단일 셀 해상도 세포 주기 진동, 우리 셀 규모, 재구성 및 개별 아사카에 여러 자기 지속적인된 mitotic 진동 프로세스의 동시 측정을 위한 높은 처리량의 시스템 개발 작은 물방울. 이 상세한 비디오 프로토콜에 10에서 300 µ m에 배열 하는 크기의 microemulsions에서 자전거 Xenopus laevis 계란 세포질을 캡슐화 하 여 인공 mitotic 진동 시스템의 창조를 설명 합니다. 이 시스템에서는, 염색체 응축과 드 응축, 핵 붕괴와 개혁, 그리고 저하 고 anaphase 기판 (예: securin-mCherry이 프로토콜에서)의 합성 등 mitotic 진동 했다 성공적으로 재구성 된다.

<table><tbody><tr><td>Xenopus laevis 개구리</td><td>Xenopus-I Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2935</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 이오노포어</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A23187</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>독성</td></tr><tr><td>트리클로로</td><td>시그마-알드리치</td><td>448931</td><td>독성</td></tr><tr><td>(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸) 실란</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFPE-PEG 계면활성제</td><td>란 생명공학</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>GE 헬스케어 글루타티온 세파로스 4B 비드</td><td>시그마-알드리치</td><td>GE17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 열</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>VitroCom 소형 중공 유리관</td><td>VitroCom</td><td>5012</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 SZ61 스테레오 현미경</td><td>올림푸스 올림푸</td><td></td><td></td></tr>스 <tr><td>IX83 현미경</td><td>올림푸스 올림푸</td><td></td><td></td></tr>스 <tr><td>FV1200 컨포칼 현미경</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 분광 광도계</td><td>Thermofisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mL 스냅 캡 마이크로튜브</td><td>E& K Scientific</td><td>485050-B</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA 미니 키트</td><td>ThermoFisher(Ambion)</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 아날로그 와류 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>버전 7.3</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

microemulsions 셀 무료 xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

단일 셀 수준에서 진동의 실시간 측정 생물 시계의 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 대량 추출 Xenopus laevis 계란에서 준비는 되어 있지만 생화학 네트워크 기본 세포 주기 진행을 해 부에 강력한, 그들의 앙상블 평균 측정 일반적으로 이끌어 각에 불구 하 고 감쇠 진동 지속 되는 개별 발진기 시끄러운 생물 학적 시스템에서 개별 발진기 간의 완벽 한 동기화의 어려움 때문입니다. 검색 하려면 발진기의 단일 셀 역학, 우리 셀 같은 구획 Xenopus laevis 계란의 자전거 세포질 추출 물을 캡슐화에 mitotic 사이클을 다시 구성할 수 있는 물방울 기반 인공 세포 시스템을 개발. 이러한 간단한 세포질 전용 셀 30 사이클에 대 한 지속적인된 진동 전시. 핵을 가진 더 복잡 한 세포를 구축, 우리는 demembranated 정자 염색 질 시스템에서 자기 조립 핵을 방 아 쇠를 추가. 우리 염색체 응축/decondensation의 정기적인 진행을 관찰 하 고 핵 실제 셀에 같은 고장/개혁, 봉투. 이 mitotic 발진기 여러 다운스트림 mitotic 이벤트를 충실 하 게 기능을 나타냅니다. 우리는 동시에 mitotic 발진기 및 다중 채널 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 방울에 다운스트림 프로세스의 역학을 추적 합니다. 양적 조작 및 가능성이 규제 기계와의 기능에 중요 한 통찰력을 제공 하는 단일 셀 해상도, mitotic 진동의 분석을 위한 높은 처리량 프레임 워크를 제공 하는 인공 세포 주기 시스템 시계입니다.

그림 2, 우리는이 프로토콜 모두 간단 하 고, 핵 없는 세포로 핵, 복잡 한 셀 어디 발진기 핵 형성과 변형의 주기적 교체 드라이브 mitotic 진동 생산 표시 됩니다. 핵 없는 물방울 생성 mitotic 진동 최대 30 undamped 사이클에 92 시간의 기간 동안 정기적인 합성 한 형광 기자 securin-mCherry (그림 2A)의 저하에 의해 표시 된 대로. 복잡 한 APC/c. 홍보 anaphase의 기판은 securin Anaphase 동안 securin mCherry의 저하는 따라서 APC/c.의 활동을 나타냅니다.
다운스트림 mitotic 이벤트를 mitotic 발진기의 능력 검사, 우리 또한 공급 demembranated 정자 염색 질...

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

이 방법은 미토성 네트워크 뒤에 있는 조절 기계장치 및 세포 주기 시계의 동적 속성 및 기능과 같은 시스템 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 각각 다중 세포 주기가 있는 대량의 물방울을 생성하여 정량적 조작 및 분석을 위한 높은 처리량 프레임워크를 제공한다는 것입니다. 시작하려면 동물과 식물극 사이의 경계가 불분명한 계란의 배치 또는 동물 극 위에 불규칙한 흰색 반점이 있는 것을 폐기하십시오.다음으로, 한 여성 개구리에서 계란의 적절 한 배치를 선택 하 고 600 밀리 리터 비커에 계란을 전송. 0.2배MMR 버퍼를 과도하게 붓고, 1배 추출 버퍼에 시스테인을 달걀에 부드럽게 넣습니다. 그 후, 비커를 손으로 힘차게 흔들어 계란의 젤리 코트를 제거합니다.시스테인 버퍼의 총 800 밀리리터와 또는 계란이 집계하고 비커의 바닥에 정착 할 때까지세 번 이 세척을 반복합니다. 젤리 코트를 제거한 후 0.2x MMR 용액 1리터로 계란을 4회 세척합니다. 유리 파이펫을 사용하여 흰색으로 변하는 알을 집어 들고 버립니다.비커에서 MMR 버퍼를 붓고 200 밀리리터의 칼슘 이오노포어 용액을 계란에 넣습니다. 유리 파이펫을 사용하여 계란이 활성화될 때까지 부드럽게 저어주고, 칼슘 이오노포어 용액을 제거합니다. 너무 오랫동안 칼슘 이오노포어 용액에 계란을 두면 멸망을 시작할 수 있습니다.계란을 1.5분 간 저어서 활성화 효율을 확인합니다. 활성화되지 않은 경우 교반을 다시 시작하고 90%의 활성화가 이루어질 때까지 더 자주 확인합니다. 계란이 비커의 바닥에 정착 한 후 활성화 효율성을 확인하십시오.잘 활성화 된 계란은 동물 극의 약 25 %와 식물극의 75 %를 가지고 있습니다. 다음으로, 프로테아제 억제제로 보충된 추출물 버퍼의 총 부피 50 밀리리터로 계란을 두 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 계란을 0.4 밀리리터 스냅 캡 마이크로튜브로 조심스럽게 옮기습니다.마이크로튜브를 200g에서 60초 간 원심분리한 다음 600g에서 30초 간 계란을 포장합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 각 단계 후 계란 위에 과도한 버퍼를 제거합니다. 그 후, 15, 000 g에서 4섭씨에서 10분간 계란을 분쇄하십시오.면도날을 사용하여 튜브를 잘라 서 세 겹의 으깬 달걀을 분리하고 중간 층에 조잡한 세포질을 유지합니다. 그런 다음, 조질 세포질을 옮겨 초원심분리기 튜브를 청소합니다. 프로테아제 억제제와 사이토찰라신 B를 각각 밀리리터당 10 마이크로그램으로 보충합니다.원유 세포질을 15, 000g, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 튜브를 자르고 중간 층에 세포질을 유지합니다. 갓 준비한 추출물을 얼음 위에 놓습니다.먼저, 준비된 추출물에 세큐린-mCherry mRNA를 첨가한다. 다음으로, 추출물 mRNA 혼합물에 2%PFPE-PEG 형광활성제의 200마이크로리터를 추가한다. 소용돌이 믹서를 사용하여 물방울을 생성하여 필요에 따라 소용돌이 속도와 지속 시간을 조정합니다.그런 다음 방울을 육안으로 검사하여 크기가 균일했는지 확인합니다. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 위에 떠 있는 액적과 동일한 계면활성제를 PCR 튜브로 옮습니다. 유리 튜브를 물방울 층에 담그고 물방울이 튜브의 약 75 %를 채울 때까지 기다립니다.그런 다음 튜브를 계면활성제 층으로 밀어 넣고 튜브를 완전히 채웁니다. 다음으로, 유리 바닥 접시에 미네랄 오일을 채웁니다. 그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 액적으로 채워진 튜브를 오일에 담급다.유리 파이펫을 사용하여 눈에 보이는 이물질이나 유출된 물방울을 제거합니다. 물방울의 움직임과 누출을 피하기 위해 물방울로 채워진 유리 튜브는 미네랄 오일 아래에 조심스럽게 침지되어야합니다. 양 끝에서 균형을 맞추거나 튜브 끝에 미네랄 오일 몇 방울을 동시에 추가할 수 있습니다.그 후, 전동식 xy 스테이지를 장착한 피형성 현미경을 사용하여 물방울을 이미지화한다. 물방울이 활동을 잃을 때까지 밝은 필드에 시간 경과 비디오를 기록하고 6 ~ 9 분마다 여러 형광 채널을 기록합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 핵을 가진 간단한, 핵 없는 세포 및 복잡한 세포 둘 다에 있는 미토성 진동이 생성되었습니다.핵없는 방울은 92 시간 동안 최대 30 개의 무양 식 사이클을 생성했습니다. 하류 미토틱 이벤트를 구동하는 미토틱 발진기의 능력도 조사되었다. 자기 지탱된 미토틱 발진기는 뚜렷한 세포 주기 단계의 자율적 변경을 통해 관찰된 핵 형태학의 변화를 주도했습니다.이 절차를 시도하는 동안, 그것은 시간에 민감한, 추출을 만들 때 시간을 염두에 기억하는 것이 중요합니다, 항상 계란을 유지하고 얼음에 추출. 개발 후, 이 기술은 제노푸스 laevis의 튜닝성과 스토세서티와 같은 복잡한 시계 특성의 기본 원칙을 탐구하는 시스템 생물학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.

reconstitution-cell-cycle-oscillations-microemulsions-cell-free

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

원유 및 fractionated Xenopus 달걀 추출물은 형태학의 및 생화 학적 분석을위한 세포 프로세스를 reconstituting을위한 재료를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 계란 용해 및 차등 원심 분리가에 차례로 fractionated 추출물과 가벼운 막 준비를 준비하는 데 사용되는 원유 추출을 준비하는 데 사용됩니다.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

우리는 살려서 살짝 익히고의 컬렉션을...

생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

방법은 Xenopus의 계란 추출물 및 단백질 분해의 저분자 변조기에 대한 고 처리량 스크리닝을 위해 그 적응 방사성 표지와 루시퍼 라제 융합 단백질을 이용하여 단백질 분해 분석에 대해 설명한다.

β-catenin의 저하의 재구성<em&gt; Xenopus의</em&gt; 계란 추출

Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

고도로 압축된 유사분열 염색질의 축합의 분자 메커니즘은 잘못 정의되어 있습니다. 당사는 HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물에서 분리한 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 응축 과정을 충실하게 재구성하는 cell-free 분석을 제시합니다.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

세포 및 세포 내 스케일링의 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. Xenopus 배아 추출물의 사용은 세포 기관 크기 조절의 메커니즘을 밝히기 위해 점점 더 보편화되고 있습니다. 이 방법은 배아 추출물 준비와 핵 크기 조절 메커니즘을 확인할 수 있는 새로운 핵 스케일링 분석을 설명합니다.

사용하여 셀 - 무료 분석<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em&gt; 배아 핵 크기 규제의 메커니즘을 연구하기 위해 추출

유사분열 방추체의 조립 및 위치는 미세소관 역학, 운동 단백질 및 가교제에 의해 생성된 결합된 힘에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 구형 에멀젼 방울의 기하학적 구속이 기본 유사 분열 방추체의 상향식 재구성에 사용되는 최근에 개발 된 방법을 제시합니다.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

우리는 세포주기의 특정 단계와 관련된 사건을 연구하기위한 배경 정보를 제공하는 두 가지 세포 동기화 프로토콜을보고합니다. 우리는이 접근법이 교란되지 않은 세포주기 또는 세포주기에 영향을 미치는 약물에 노출되었을 때 특정 유전자의 조절을 분석하는데 유용하다는 것을 보여준다.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

우리는 Xenopus laevis 알에서 희석되지 않은 세포질 추출물의 제조 및 라이브 이미징 방법을 설명합니다.

제노푸스 라에비스 동적 세포질 조직을 시각화하기 위한 계란 추출물 준비 및 라이브 이미징 방법

미세유동 칩 상에서 마우스 배아 조직의 배양 및 조작을 위한 프로토콜이 제공된다. 경로 조절제의 펄스를 적용함으로써, 이 시스템은 마우스 소미토제네시스의 기능적 조사를 위해 신호전달 진동을 외부적으로 제어하는데 사용될 수 있다.

Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법

학습하세요 Xenopus laevis 달걀 추출물을 이용한 미세유화액 기반 세포 주기 진동 재구성 방법을. 이 기술은 유사분열 네트워크와 세포 주기 역학의 고처리량 정량 분석을 가능하게 합니다.

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

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