Name: 감기 응답 MicroRNAs의 연구에 대 한 호모-그리고 수 박 및 호리병박 사이 Heterografts를 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 학습하세요 수박과 호리병박 간 동종 및 이종 접목 기술을 통해 저온 스트레스에 반응하는 microRNA를 연구하는 방법을. 이 효율적이고 재현 가능한 기법은 식물 스트레스 반응에서 miRNA 역할을 밝히는 데 유용합니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31772191), 강성 (2017 C 32027) 공익에 대 한 연구 프로젝트, 키 과학 프로젝트의 식물 Breeding 절 (2016 C 02051)에서 및을 위한 국가 프로그램에 의해 지원 되었다 최고 수준의 젊은 전문가 (P.X.)의 지원.

1. 살 균 및 발 아 씨앗
<ol><li>표면 살 균, 병 조롱 박 씨앗 가끔 교 반, 물 온도 40 ° c.에 떨어질 때까지 58 ° C에 물으로 채워진 500 mL 비 커에 담가</li>
	<li>한편, 나일론 가방 그리고, 소독, 토 탄 토양의 3 kg을 넣어 압력솥 120에서 ° C/0.5 MPa 20 분.</li>
	<li>4-5 시간 더 없는 감동 병 조롱 박 씨앗을 몸을 담글 유지.<ol>
<li>물에는 실내 온도 도달 하면, x-증류수와 함께 3 x 2 씨앗을 씻어.</li>
		<li>과잉의 물을 배수 하 고 어둠 속에서 성장 챔버에 28 ° C에서 거 즈 가방에 새싹 씨앗을 허용.</li>
		<li>발 아, 후 소독된이 탄 토양으로 채워진 플라스틱 냄비 (지름에서 6cm)에 씨앗을 뿌린.</li>
	</ol>
</li>
	<li>때 병 조롱 박 묘 두 병합된 cotyledons 개발, 단계 1.1-1.3 수 박 씨앗을 반복 합니다. 참고:이 시간 관리 접 순과 rootstock의 크기 잘 성공적인 접목에 대 한 일치를 보장 합니다.</li>
</ol>2. 묘 종 성장과 접목
<ol><li>온도 28 ° C (빛) 낮에 밤 동안 22 ° C에서 (어두운)로 유지 16 h 라이트 /8-h 어두운 주기와 성장 챔버에 묘 목 성장. 늦은 오후에 하루 x 물 1을 추가 하 여 묘를 관개.</li>
	<li>사용 컷 접목 방법22 heterografts 때 병 조롱 박 (rootstock)의 모 종 한 진정한 잎 단계에서 수 박 (scion)의 cotyledons (아직 평평) 등장.<ol>
<li>Cotyledons, 아래 2-3 cm에서 수 박 모 종 hypocotyls 고 바로 진정한 위에 사이트에서 병 조롱 박 묘 위에 나뭇잎.</li>
		<li>이쑤시개를 사용 하 여 트림된 병 조롱 박 묘 상단에 구멍을 만들기 위하여. 트림된 수 박 모 종 heterografts 수 있도록 병 조롱 박 묘 목 구멍에 삽입 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사용 유사한 방법 단계 2.2에서에서 제시 하는으로 homografts. 참고: 호모-및 heterografting 조합 항상 여야 한다 동시에 (그림 1),이 경우에, 다음에서 결과: (WB, heterograft) 수 박/병 조롱 박, 수 박/수 박 (WW, homograft) 및 호리병박 /bottle 조롱 박 (BB, homograft)</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig1.jpg"> 그림 1: 이식 조합 및 융합 하였습니다 공장 구조 그림. WB = 수 박/병 조롱 박 heterografting; WW = 수 박/수 박 homografting; Bb 탄 = 병 조롱 박/병 조롱 박 호모-접목; WB-S = 수 박/병 조롱 박 heterografts 샘플링 된;의 접 순 잎 WB-R = 샘플링 된 수 박/병 조롱 박 heterografts의 rootstock 나뭇잎. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 관리, 감기 치료, postgrafting 및 샘플링
<ol><li>상대적으로 높은 습도 유지 하 고 7 d 16 h 빛/8-h 어두운 주기, 낮 (빛) 28 ° C에 온도 유지 하 동안 22 ° C에서의 환경 조건 하에서 그들을 유지 하는 것을 투명 한 폴 리 에틸렌 가방 이식할된 묘 enwrap는 밤 (어둠)입니다.</li>
	<li>7 일에 투명 한 폴 리 에틸렌 봉투를 발견. 식물 성장 추가 7-10 일 같은 조건에 대 한 하자.</li>
	<li>두 그룹 (스트레스) 감기 치료를 위해, 하나 컨트롤 (비-스트레스)으로 건강 한 균일 한 묘를 나눕니다. 컨트롤 그룹에 대 한 냉 스트레스 그룹에는 추가 48 h에 대 한 (28 ° C)에서 동일한 성장 챔버에 묘를 두고, 단계에서 설명한 대로 명암 조건 6 ° C에서 일정 한 온도와 성장 챔버에 묘를 전송 2.1입니다.</li>
	<li>이식 (그림 1)에서 scion는 rootstock의 잎을 샘플. 액체 질소에는 샘플을 즉시 고정 하 고 사용까지-70 ° C에서 그들을 저장 합니다.</li>
</ol>4. 라이브러리 준비 및 높 처리량 연속
<ol><li>액체 질소에서 2 mL microcentrifuge 튜브를 냉동된 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>조직을 포함 하는 각 관에 스테인리스 스틸 비드 (지름 5 m m)를 추가 합니다.</li>
	<li>30 대 한 비드 밀 균질 화기를 사용 하 여 정밀한 분말을 조직 균질 s.</li>
	<li>각 이식 조합에 대 한 동일 금액 (0.1 g) 10 묘에서 지상 샘플의 고 10 mL 원심 분리기 튜브에서 그들을 믹스. Guanidium 염 산 염 시 약 (자료 테이블) 조직 무게에 해당 하는 제조 업체의 제안에 따라의 적절 한 금액을 추가 합니다.<ol>
<li>RNA-무료 DNase를 추가 하 여 게놈 DNA 오염 제거 나 1 시간 동안 37 ° C에서 150 U/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결정 총 RNA 무결성을 보장 하기 위해 microcapillary 전기 시스템에 RNA 양 번호 &gt; 7.0. 참고: 린 &gt; 7.0 RNA 샘플의 높은 무결성 보장.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 상업 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 작은 RNA 라이브러리를 준비 합니다. 샘플 당 총 RNA의 1 µ g를 사용 하 여 시작 하.<ol>
<li>해 동 라이브러리 정규화 시 약 그리고 어댑터 제조업체의 지침에 따라. 5 '과 3 ' 어댑터와 작은 RNAs를 위하여 elute 하 고 그들을 정화. 리버스는 5 '를 녹음 하는 다음, 3' 제조업체의 지침에 따라 작은 RNAs 출혈 및.</li>
		<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 증폭을 수행 합니다. Microcapillary 전기 시스템을 사용 하 여 cDNA 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다.</li>
		<li>여 린 수 있도록 microcapillary 전기 시스템에는 RNA 라이브러리의 1 µ L 로드 &gt; 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>23설명 되어 있는 대로 높은 처리량 시퀀싱 악기에 작은 RNA 라이브러리 순서.</li>
</ol>5. miRNA와 표적 유전자 예측
<ol><li>각 이식 조합에 대 한 가난한 품질 시퀀스를 제거 하 고 원시 읽기에서 어댑터 시퀀스 트림 UEA 요 스르나. 워크 벤치 2.4 공장 버전24 오픈 소스를 사용 합니다. 18 보다 작은 시퀀스를 삭제 nt 32 보다 크거나 nt.</li>
	<li>오픈 소스 Rfam 11.0 데이터베이스 인식 하 고 읽기 rRNA, tRNA, snoRNA, 및 다른 snRNAs의 제거에 높은-품질 "깨끗 한" 시퀀스를 비교 합니다.</li>
	<li>나머지 읽기25짧은 읽기 시퀀스 정렬 도구 사용 하 여 참조 게놈을 맞춥니다. 이 단계에서 아무 불일치 허용 됩니다. 참고: 수 박 "97103" 게놈 어셈블리 V126 , 접 순에서 읽기 정렬에 사용 된 및 호리병박 "HZ" 게놈 어셈블리 V127 는 rootstock에서 읽기 위해 사용 되었다.</li>
	<li>오픈 소스 miRBase 22.028에 알려진된 성숙한 miRNAs에 대 한 나머지 읽기를 비교 합니다. 알려진된 miRNAs에 동종 읽기 보존된 miRNAs로 분류 됩니다.</li>
	<li>알려진된 miRNA 선구자 게놈 시퀀스와 일치 하도록 실패 하는 시퀀스를 비교 합니다. MIREAP29 알고리즘을 사용 하 여 기본 설정에서 잠재적인 소설 miRNAs 감지.</li>
</ol>6. 차동 식 및 유전자 온톨로지 분석
<ol><li>그들의 읽기 카운트에 따라 miRNAs의 식 수준을 비교 합니다. miRNAs는 P-값 (피셔의 정확한 시험) &lt; 0.05와는 절대 로그2 값 &gt; 2 차동 표현 될 것으로 간주 됩니다.</li>
	<li>기본 매개 변수에서 차동 표현된 miRNAs에 잠재적인 상호 보완적인 mRNAs (미르 대상 유전자)를 예측 하는 센스 oligonucleotide 대상 사이트 선택 도구 (TargetFinder)30 을 사용 합니다.</li>
	<li>유전자 존재론을 사용 하 여 (가) 미르 대상 유전자 존재론 (이동)을 농축 분석 도구31 P아래 패턴-통계적 의미에 대 한 0.05의 값을 임계값.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다. 작은 RNA 시퀀싱 데이터 취득 번호 SRP136842에서 은행에 입금 됩니다.

이 프로토콜에서 우리 자세히 호모-고 수 박 및 호리병박 사이 heterografts 고 재현 방법 설명. 필요한 특정 장비,이 방법은 매우 운영 하 게 쉬운 이며 일반적으로 접목의 매우 높은 생존 율을가지고. 메서드 또한 수 박, 오이, 호박 사이 다른 cucurbits에 대 한 이식을 만들기 위해 사용할 수 있습니다.
그것은 rootstock 및 접 순의 상대적 크기 (나이)은 성공적인 이식 ( 프로토콜의 단계 2.2)를 만들기 위해 중요 한 지적 가치가 있다. 우리는, 사용 rootstock scion에 비해 너무 큰 했다, 이식 연합 있었다면 양식에 더 어려운 scion의 줄기는 다소 빈 때문에 관찰. 우리의 이전 proteomic 데이터31에 따라, 컨트롤로 자동 이식할된 접 순 및 자체 이식할된 rootstock의 포함이 좋습니다 ( 프로토콜의 단계 2.3)에 게, ...

접목은 오래 고용 농업 기술로 개선 작물 생산 그리고 공차 biotic 및 abiotic 스트레스1,2,3. Heterografting 시스템에서 엘리트 감지 수 있습니다 식물의 물과 양분 통풍 관을 강화, 강화 토양 병원 균에 저항 하 고 금속 독성4,5,이 이식 된 향상 된 부여 수 있습니다 부정적인 영향을 제한 성장 활력 그리고 환경 스트레스를 증가 허용입니다. 대부분의 경우에서 heterografting 수 있습니다 또한 과일 자질 향상 된 과일 맛과 건강 관련 화합물6,7의 증가 콘텐츠를 선도 하는 원 예 식물에 영향을. Scion는 rootstock 사이 phytohormones, RNAs, 펩 티 드, 단백질의 장거리 전송 성장과 개발 프로그래밍 scion 식물8,9의 변조 하는 근본적인 메커니즘입니다 발견 되었습니다. ,10. 접목 장거리 신호 및 교통 환경 적응11관련의 연구에 널리 사용 되어 있다. 이식 실험은 조직 또는 혈관 수액, 그리고 활성화 또는 억제 신호 전송12인 분자 대상에 전송 된 분자의 명백한 탐지를 위해 특히 강력 합니다.
비 코딩 RNAs, 셀에 규정 하는 중요 한 기능을 발휘 하는 RNA의 큰 클래스 abiotic 스트레스13식물 적응을 촉진 역할을 보고 되었습니다. miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs의 약 20-24 생 nt. 연구 miRNAs 식물 활동의 다양 한 측면에서의 규제 역할을 계시 했다, 같은 성장, 쏠로 루트 형성14,,1516, 측면 양분 통풍 관, 황산 물질 대사 그리고 항상성17및 응답 biotic 및 abiotic 스트레스18. 최근, miRNAs와 그들의 타겟 유전자의 표현은 heterografted 오이 모 종19허용 오차 스트레스를 소금에 관련 되었다. 포도의 intervariety 이식에서 miRNA 식 가뭄 스트레스의 응답 유전자 형 종속20을 발견 했다.
신속한 개발 및 높은 처리량 시퀀싱 기술의 비용 감소 농경 식물에서 miRNA 규정의 연구에 대 한 좋은 기회를 제공. 수 박 (Citrullus lanatus [Thunb] Mansf.), 세계에 걸쳐, 재배 하는 중요 한 cucurbit 작물 저온 쉽습니다. 호리병박 (Lagenaria의 siceraria [몰리 나] Standl.) 기후 탄력 cucurbit 수 박으로 이식 하 농부에 의해 일반적으로 사용 되는. 현재 연구의 기본 목표는 표준, 효율적인, 그리고 수 박 (Citrullus lanatus [Thunb] 사이 heterografts를 만들기 위한 편리한 방법 설정 Mansf입니다.) 그리고 병 조롱 박 (Lagenaria의 siceraria [몰리 나] Standl). 이 프로토콜 또한 제공 한다 상세한 실험 계획 및 분석 절차 미르 식 접목, 다음의 규칙의 연구는 heterografting 장점 기본 메커니즘을 공개 하는 데 유용.
이 연구에 사용 된 식물 재료 수 박 품종 및 호리병박 landrace 포함 됩니다. 수 박 품종은 낮은 온도에 취약 하지만 높은 수확량을 가진 상업 품종이 이다. 호리병박 landrace 접목 수 박, 오이와 병 조롱 박, 낮은 온도21의 우수한 관용 때문에 인기 있는 rootstock입니다.

<table><tbody><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>RNA-free DNase I</td><td>Takara</td><td>D2270A</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bionalyser</td><td>Agilent</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>UEA sRNA 워크벤치 2.4-plant 버전&nbsp; (소프트웨어)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Rfam 11.0 데이터베이스&nbsp;( 웹사이트)</td><td>NA</td><td></td><td>NA http://rfam.janelia.org</td></tr><tr><td>miRBase 22.0&nbsp;( 웹사이트)</td><td>NA</td><td></td><td>NA http://www.mirbase.org/</td></tr> <tr><td>MIREAP(소프트웨어)</td><td>NA</td><td></td><td>NA https://sourceforge.net/projects/mireap/</td></tr> <tr><td>TargetFinder&nbsp;( 소프트웨어)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://targetfinder.org/</td></tr></tbody></table>

감기 응답 micrornas의 연구에 대 한 호모-그리고 수 박 및 호리병박 사이 heterografts를 생성

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs)는 작은 비 코딩 RNAs의 약 20-24 생 nt, 알려진 식물 개발 및 적응에 중요 한 역할을. 보여주는 특정 miRNAs의 식을 접목 때 변경 되는 축적 증거는 biotic 및 abiotic 스트레스에 작물 허용 오차를 개선 하기 위해 농부에 의해 일반적으로 사용 하는 농업 연습. 호리병박은 많은 다른 주요 cucurbits, 수 박 등, 하나는 후자에 대 한 가장 널리 사용 되 감지의 렌더링에 비해 본질적으로 기후 탄력 자르기. 높은 처리량 시퀀싱 기술의 최근 발전 감기 응답 miRNAs와 heterograft 장점;에 그들의 기여를 조사 하기 위해 좋은 기회를 제공 하고있다 그러나, 적절 한 실험 절차는이 목적에 대 한 필수. 여기, 우리는 효율적으로 호모-및 감기 취약 수 박과 조직 샘플링, 데이터 생성 및 데이터 분석의 방법 이외에 감기 허용 호리병박 사이 heterografts를 생성 하기 위한 상세한 프로토콜을 제시. 제시 메서드는 또한 다른 식물 이식 시스템가 열, 가뭄, 염 분 등 다양 한 환경 스트레스에 따른 miRNA 규정에 대 한 유용 합니다.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> 그림 2: 실내 온도 및 감기 스트레스 조건에서 다양 한 이식의 고기. (한)이이 패널이 보여줍니다 호모-및 heterografted 묘 실 온에서 제어. (b)이이 패널 호모-및 heterografted 묘 목 감기 치료의 48 h 후에 보여준다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
설명한 방법을 사용 하 여, 우리가 획득 접목에 대 한 98...

여기 우리는 효율적으로 만들기 위한 호모-수 박, 병 조롱 박, 감기 응답 microRNAs의 조사에 대 한 조직 샘플링, 데이터 생성 및 데이터 분석의 방법 이외에 사이 heterografts 상세한 프로토콜을 제시.

감기 응답 MicroRNAs의 연구에 대 한 호모-그리고 수 박 및 호리병박 사이 Heterografts를 생성

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

이 방법은 miRNA가 수박 병 박 접목에서 차가운 스트레스하에서 규제되는 방법과 같은 식물 이식에 스트레스 능력에 대한 miRNA 응답의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 호모와 이성이식을 만드는 것이 매우 효율적이고 재현 가능한 방법이라는 것입니다. 그것은 특정 장비가 필요하지 않으며, 수행하기가 매우 쉽고, 일반적으로 접목의 매우 높은 생존율을 초래합니다.이 방법을 통해 수박 병 박 접목 시스템에서 차가운 스트레스에 대한 miRNA 반응에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그것은 또한 지역 및 장거리 miRNA 수송의 메커니즘을 공개하기 위한 그밖 현대 유기체에 적용될 수 있습니다. 접목 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다.이 단계는 고급 기술이 필요하고 접목 된 식물의 생존의 열쇠입니다. 우선, 58°C의 500 밀리리터 비커에 병에 박진 씨앗을 담급니다. 수온이 섭씨 40도까지 떨어질 때까지 가끔 씨앗을 저어줍니다.물이 식는 동안, 나일론 가방에 이탄 토양 3킬로그램을 넣고 오토클레이브합니다. 물이 실온에 도달하면 씨앗을 증류수로 2~3회 헹구고 여분의 물을 배출합니다. 어두운 성장 챔버에서 28섭씨에서 씨앗이 거즈 백에 새싹을 넣도록 하십시오.발아 후, 멸균 토탄 토양으로 가득 플라스틱 냄비에 씨앗을 뿌리. 병 박 모종두가 두 개의 평평한 코틸레던을 개발할 때, 수박 씨앗으로이 과정을 반복하십시오. 성장 챔버에서 병 박과 수박 묘목을 성장.오후에 하루에 한 번 모종에 물을 넣습니다. 다음으로, 코틸레던 아래 2~3센티미터 의 수박 묘목의 고압을 자른다. 코틸레톤 바로 위에 있는 병 통 묘목의 상단을 잘라냅니다.그런 다음 이쑤시개를 사용하여 다듬어진 병 통 모종의 상단에 구멍을 만듭니다. 손질된 수박 묘목을 구멍에 삽입하여 이종이식을 만듭니다. 이 후, 이전에 설명된 방법을 사용하여 균형 이식을 준비한다.첫째, 접목된 모종을 투명 폴리에틸렌 백에 싸서 습도가 상대적으로 높게 유지합니다. 그런 다음 7 일 동안 성장 챔버에서 포장 된 묘목을 유지합니다. 일곱 번째 날 이후에는 가방을 제거하고 식물이 7 일에서 10 일 동안 동일한 조건에서 자랄 수 있도록하십시오.모종을 두 그룹으로 나눕니다. 제어 묘목을 동일한 환경 조건으로 반환합니다. 차가운 처리된 묘목을 대조군과 동일한 밝은 어두운 조건으로 섭씨 6도로 설정된 성장 챔버에 놓습니다.48 시간 후, 접목에서 접종과 뿌리 줄기의 샘플을 둡니다. 액체 질소에 즉시 샘플을 동결 하 고 영하 70섭씨에 저장. 냉동 샘플을 액체 질소의 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 이송합니다.각 샘플 튜브에 스테인레스 스틸 비드를 추가하고 조직을 미세 분말에 균질화합니다. 각 이식 조합에 대 한, 10 모종에서 지상 샘플의 동일한 금액을 가지고 10 밀리 리터 원심 분리 튜브에 혼합. 적절한 양의 가미염 시약을 추가합니다.다음으로, RNA가 없는 DNase를 1시간 동안 섭씨 37도에서 밀리리터당 1~150단위를 추가합니다. 그런 다음 마이크로 모세관 전기 포근 시스템에서 총 RNA 양을 결정합니다. 이 후 라이브러리 정규화 시약 및 어댑터를 해동합니다.그런 다음 다섯 개의 프라임 및 3 개의 프라임 어댑터로 작은 RNase를 리디게이트하고, 그들을 엘리트하고 정화합니다. 역전사는 제조업체의 지침에 따라 5개의 프라임과 3개의 프라임 리그작은 RNase를 전사합니다. 다음으로 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 증폭을 수행합니다.그런 다음 미세 칼 전기 전광 시스템을 사용하여 RNA 무결성 수가 7 개 보다 큰지 확인합니다. RNA 무결성 수가 7개 이상인지 확인하기 위해 마이크로모세필리 전기포고시스템에 RNA 라이브러리의 마이크로리터 1개를 적재한다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱 기기에 작은 RNA 라이브러리를 서열한다.이 프로토콜을 사용하여 접목 및 실온 및 냉부 응력 조건에 대한 표현형에 대한 98%의 생존율을 얻었다. 24개의 뉴클레오티드의 sRNA는 온도 처리에 관계없이 모든 접목 조합에서 sRNAs의 가장 큰 클래스를 구성했습니다. 감기 치료의 48 시간 후, 30 및 268 microRNA는 각각 위아래로 조절되었다.이종 이식에 있는 자손의 잎에서, 반대로, 뿌리 줄기의 잎에서, 31 및 12 microRNA는 각각 위아래로 통제되었습니다. 수박 수박 균질 이식에서, 64 및 83 microRNA는 각각 위아래로 통제되었습니다. 이것은 이종 이식이 microRNA 표현의 심오한 재프로그래밍을 일으키는 원인이 되었다는 것을 보여주었습니다.이 절차를 시도하는 동안, 딸 줄기의 상대적 크기와 나이를 기억하는 것이 중요하고 자손은 성공적인 접목을 만드는 데 중요합니다. 이 절차에 따라, 접목 시스템에서 lncRNA 및 단백질 및 코딩 시스템의 조절을 조사하기 위해 lncRNA 시퀀싱, 프로테오믹 프로파일링을 같은 다른 방법이 수행될 수 있다. 개발 후, 이 기술은 Cucurbitaceae 및 그 너머에 있는 식물 이식 이점의 메커니즘을 탐구하기 위하여 식물 무생물 내성의 필드에 있는 연구를 위한 도로를 포장했습니다.구아니딘 염산염으로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 예방 조치는 항상 이 절차를 수행해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 동영상은 형질전환 예쁜꼬마선충 균주를 만드는 일반적인 방법인 미세주입에 대해 설명합니다. 이 예에서는 CRISPR 염기 유전자 편집을 위한 리보핵단백질(RNP) 복합체를 도입하는 데 사용되는 미세주입을 볼 수 있습니다.

생식선 미세주입: 예쁜꼬마선충의 생식세포에 직접 화합물을 전달하는 방법

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 기술을 사용하여 다중 유전자 녹아웃을 만드는 데 사용되는 하나의 가이드 RNA concatemer 벡터에 여러 단일 가이드 RNA를 복제하는 단계를 설명합니다. 장 organoids에 이중 knockouts의 생성은이 방법의 가능한 응용 프로그램으로 표시됩니다.

CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

이 프로토콜의 목적은 배아 조직 이식 기술을 사용하여 Cas9 돌연변이 공여자 조직에서 유래한 haploid 앞다리를 가진 키메라 액록톨을 생산하는 것입니다.

배아 이식을 통해 돌연변이 Haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성

감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

농균 계 주사 (농업 주입) 프로토콜은 옥수수 묘목으로 여우 꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 클론의 접종을 위해 제시된다. 이러한 방식으로 접종은 바이러스 감염, 마커 유전자의 바이러스 유발 유전자 침묵, GFP의 바이러스 과발현으로 이어집니다.

재조합 폭스테일 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염 클론주사에 의해 옥수수 묘목의 직접 농경화

이 프로토콜은 마우스 난관에서 국소적으로 제한된 CRISPR 매개 게놈 편집을 위한 미세주입 및 생체 내 전기천공을 설명합니다.

생체 내 미세주입 및 전기천공을 사용한 체세포 게놈 공학 마우스 모델

이 연구는 담수 사과 달팽이( Pomacea canaliculata)의 안정적인 돌연변이 계통을 생성하고 유지하는 워크플로우를 개발했습니다. 프로토콜에는 접합자 채취, CRISPR/Cas9 시스템 구성 요소를 통한 미세 주입을 통한 게놈 편집, 배아의 난자 배 양, 그리고 통제된 교배 후 유전자형 분석이 포함됩니다.

황금 사과 달팽이 Pomacea canaliculata: 접합자에서 안정적인 돌연변이 계통까지의 이야기

학습하세요 수박과 호리병박 간 동종 및 이종 접목 기술을 통해 저온 스트레스에 반응하는 microRNA를 연구하는 방법을. 이 효율적이고 재현 가능한 기법은 식물 스트레스 반응에서 miRNA 역할을 밝히는 데 유용합니다.

감기 응답 MicroRNAs의 연구에 대 한 호모-그리고 수 박 및 호리병박 사이 Heterografts를 생성

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