Name: 비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 학습하세요 비계 무료 3차원 심장 조직 제작을 위한 혁신적인 금형 기반 방법을. 다양한 세포 유형을 활용한 구형체를 사용하여 구조적 무결성과 동기적 수축 특성을 갖춘 기능적 심장 조직을 효율적으로 생성하는 이 기술은 재생의학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 다음 자금 출처 인정: 심혈 관 연구에 대 한 마술을 문제 기금.

1입니다. Cardiomyocytes의 준비
<ol><li>앞에서 설명한17지하실 멤브레인 매트릭스와 문화 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)와 6 잘 플레이트 코트.</li>
	<li>앞에서 설명한 방법18을 사용 하 여 hiPSC CMs로 hiPSCs를 구분 합니다.</li>
	<li>16-18 d 후 차별화에서 일시 중지는 cardiomyocytes 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 2 mL와 함께 각 잘 헹 궈 서 칼슘 또는 마그네슘, 인큐베이션 1 mL/트립 신 또는 셀 분리 시 약 (참조 테이블의의 뒤에 없이 재료) 실 온에서 5 분.</li>
	<li>트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 셀 미디어 B-27 (RPMI/B-27 셀 미디어)와 보완의 동일한 볼륨을 사용 하 여. 위쪽 및 아래쪽 준수 셀을 풀고 플라스틱.</li>
	<li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 정지 cardiomyocytes 수집 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 얻기 위해 상 온에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심</li>
	<li>RPMI/B-27 셀 미디어 10 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>20 µ L 세포 현 탁 액의 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 결합 하 고 부드럽게 혼합.</li>
	<li>수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.</li>
</ol>2입니다. 섬유 아 세포의 준비
<ol><li>앞에서 설명한16인간의 심장 섬유 아 세포 (HCF) (성인 심 실 타입) 셀 라인의 문화를 시작 합니다.</li>
	<li>트립 신 또는 셀 분리 시의 적절 한 금액으로 그들을 배양 하 여는 HCFs 일시 중단 ( 재료의 표참조) 실내 온도16시 5 분. T175 플라스 크에 10 mL의 트립 신 또는 셀 분리 시 약 사용 되었다.</li>
	<li>트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 다음 50 mL 원뿔 튜브에 샘플을 전송 매체의 동일한 볼륨을 사용 하 여, 고를 실 온에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심을 펠 릿입니다.</li>
	<li>섬유 아 세포 성장 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend ( 재료의 표참조).</li>
	<li>20 µ L HCF 세포 현 탁 액의 0.4 %trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 결합 하 고 부드럽게 혼합.</li>
	<li>자동된 셀 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 새로운 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.</li>
</ol>3입니다. 내 피 세포의 준비
<ol><li>앞에서 설명한17인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC) 라인의 문화를 시작 합니다. 트립 신 또는 셀 분리 시의 적절 한 금액으로 그들을 배양 하 여는 HUVECs를 일시 중단 ( 재료의 표참조) 실내 온도17시 3 분. 트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 다음 50 mL 원뿔 튜브에 전송 매체의 동일한 볼륨을 사용 하 여, 및 펠 릿을 실 온에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심. 참고: T175 플라스 크에 10 mL의 트립 신 또는 셀 분리 시 약 사용 되었다.</li>
	<li>내 피 세포 성장 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend ( 재료의 표참조).</li>
	<li>HUVEC 서 스 펜 션의 20 µ L를 결합 하 여 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 그것을 얼룩 하 고 부드럽게 혼합.</li>
	<li>자동된 셀 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.</li>
</ol>4입니다. 드롭 Spheroids 매달려의 창조
<ol><li>교수형 장소 살 균 6 잘 플레이트에 (각각 350 µ m의 직경) 850 micropores를 포함 하는 드롭 장치.</li>
	<li>위에서 설명한 세 가지 종류의 세포를 분리: hiPSC CMs, HCFs, 및 HUVECs. ML 당 2,475,000 세포의 농도에 RPMI/B-27 셀 미디어 70 %iPSC-CMs, 15% HCFs 50 mL 원뿔 튜브에서 15 %HUVECs 비율에 그들을 결합.</li>
	<li>드롭 시스템 (350 µ m의 작은 직경) 6 잘 플레이트에 매달려 매우 낮은 첨부 파일의 각 음에 세포 현 탁 액 (mL 당 2,475,000 세포)의 4 mL를 분배.</li>
	<li>Spheroids는 교수형에 세포 현 탁 액을 분배의 12 h 이내 저절로 형성 드롭 장치. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도에서 72 h (3 d)의 총에 대 한 문화는 spheroids의 성숙에 대 한 계속.</li>
	<li>문화의 72 h 후 수확 교수형의 바닥에 숨 구멍을 통해 spheroids 매체와 접시에 장치를 배치 하 고 소용돌이 그것 부드럽게 교수형에서 spheroids를 해제 하 여 시스템을 드롭 드롭 장치.</li>
</ol>5. 3 차원 패치 창조 소설 그물 형을 사용 하 여
<ol><li>기지, 평방 바닥판, 바닥 그물, 및 10 층된 측면 그물은 소독 집게의 쌍의 원조와 함께 소설 몰드를 만드는 조립 첫째, 스택 및 기지, 바닥판 평방, 정렬 하단 코너 게시물을 사용 하 여 net. 그런 다음 스택과 고급 스테인레스 스틸 접지 단자의 그물을 만드는 방향으로 번갈아에 10 쪽 그물 레이어.</li>
	<li>플러시 PBS 또는 매체를 표면 장력을 감소, 다음, 전송 충전 베이스에 조립된 형 기본 작성.</li>
	<li>PBS와 같은 방법에 있는 매체 그물 금형 캐비티에 젖은. 천천히 원하는 크기의 전제 된 구멍에는 spheroids를 입력 (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 m m, 또는 6 x 6 x 1 m m). 참고: 셀 집계에 꽉 연결 하 고 정적 유지 구멍에 spheroids의 예상된 하는 볼륨의 120% 공급 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>Net 상단과 상단 스퀘어 플레이트 코너 게시물에 어셈블합니다 및 stoppers 및 지주 튜브는 spheroids의 유실을 방지 하기 위해 보안.</li>
	<li>6 잘 플레이트 RPMI/B-27 셀 미디어 또는 전체 조립된 형을 충당 하기 위해 충분 한 매체와 멸 균 용기에 6 mL와 채워진된 그물 형 시스템 전송.</li>
	<li>3000-4000 x g에 7-10 일 동안 스윙 통에 채워진된 금형 시스템 6 잘 플레이트를 품 어. 참고:는 인큐베이션 기간 심장 패치의 크기에 의해 결정 됩니다. 큰 패치, 보육 시간 심장 패치 성숙에 대 한 증가 합니다.</li>
</ol>6. 소설 그물 형에서 패치 제거
<ol><li>미디어에서 금형 시스템을 제거 하 고 소독된 처리 매트 살 균 10 cm 접시에에 놓습니다.</li>
	<li>지주 관, stoppers, 상단 사각 접시 및 최고 그물을 제거 합니다. 신중 하 게 살 균 집게의 쌍을 가진 계층된 측면 그물 하나에 의해 밖으로 슬라이드. Decannulation, 후 그대로 심장 패치 하단의 그물 위에 얻을 수 있다.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 패치 순 하단을 선택 하 고 하단의 net RPMI/B27 미디어의 5 mL와 함께 35 mm 접시에 전송. 부드럽게 천천히 접시, 또는 살 균 세포 스 크레이 퍼와 함께 그물을 소용돌이 의해 그물 아래에서 패치를 풉니다. 그물 아래에서 초연, 후 심장 조직 RPMI/B27 미디어 양식 수 있습니다.</li>
	<li>35 mm 접시에 부동성 3 차원 심장 패치를 품 어 계속. 금형에서 제거 후 빠르면 24 시간 기능 동기 박동을 관찰할 수 있습니다.</li>
	<li>그물 형에서 패치를 제거한 후 모양을 무결성 및 시간 동기 박동 증가의 강도 유지는 관찰 합니다. 참고: 3 차원 그물 형 기반 심장 패치 전시 decannulation 후 구성 요소 cardiospheres의 전기 통합. 우리는 60에서 80 분당 60 일 이상 유지 하는 구타 주파수를 관찰.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
<li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Microscale+Devices+to+3D+Printing%3A+Advances+in+Fabrication+of+3D+Cardiovascular+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues.</a> Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).</li>
<li>Tandon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+systems+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering.</a> Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).</li>
<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
<li>Lux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+large-scale+cardiac+patches+based+on+a+perfusable+starter+matrix+by+cyclic+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation.</a> Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix%3A+a+new+heart+muscle+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).</li>
<li>Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+seeded+with+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+promoted+the+regeneration+of+host+cardiomyocytes+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).</li>
<li>Caspi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+vascularized+cardiac+muscle+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.</a> Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-Free+Three-Dimensional+Bioprinting+of+Cardiac+Tissue+using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).</li>
<li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">3D culture for cardiac cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).</li>
<li>Langenbach, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+differentiation+of+microtissues+from+multipotent+precursor+cells+for+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture%3A+a+comparative+study+of+growth%2C+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 방법의 중요성의 재현성 및 결과 다층 심장 조직의 효율성에 있다. 심장 조직 공학 분야에서 현재 목표 중 하나는 치는, 다층, 고 기능 3 차원 심장 패치를 생성 하는 방법을 식별 하입니다. 우리는 spheroids 소설 그물 형으로 cardiomyocytes, 내 피 세포, 섬유 아 세포의 구성의 직접 수동 시드 다층된 심장 조직 만들기의 효율적이 고 재현 가능한 방법 보고. 이 방법에 사용 되는 그물 형 6 x 6 x 1 m m 2 x 2 x 1 밀리미터에서 배열 하는 조직의 창조에 대 한 서로 다른 크기의 다양 한 있다. 우리가 설명 또한 다른 금형 셰이프 및 원하는 조직 형상에 따라 시스템을 수정할 수 있습니다. HiPSC-CMs에 대 한 설명된 셀 농도 및 비율 이전 최적화 했다 하 고 다른 셀 형식에 대 한 수정 추가 평가 요구할 것 이다.
생체 외에서 의 창조 bioprinter 기술을 사용 하 여 3 차원 심장 조직 치료 및 진단 모델 개발의 희...

현재 심장 조직 공학의 목표는 대체 또는 손상 된 심근 조직1의 기능과 구조를 복구 하는 치료를 개발 하는 것입니다. 기본 심장 조직의 중요 한 수축 및 electrophysiological 속성을 전시 하는 3 차원 심장 조직 모델을 만드는 방법 급속 하 게 확대 되어 있다2,3. 다양 한 전략을 탐험 하 고 연구4,5에서 사용 되었습니다. 이 방법에서에서 범위 특정 합성 및 천연 생리 활성 hydrogels, 젤라틴, 콜라겐, 섬유 소, 그리고 펩 티 드6, 같은 사용 하 여 바이오 잉크 증 착 기술2 및 bioprinting 기술7.
그것은 비 자유로운 방법 외국 비 계 소재8통합의 단점 없이 소재 기반 방법으로 유사한 조직 생산할 수 표시 되었습니다. 오 렌 Caspi 외. 셀의 다양 한 종류의 매우 vascularized 인간의 조작된 심장 조직9의 세대 수는 설명 했다. 턱 외. spheroids에서 심장 패치 생성을 위한 3 차원 인쇄 방법을 개발. 결과 패치 cardiomyocytes, 섬유 아 세포, 내 피 세포는 70:15:15 비율10에 구성 됩니다. Spheroids 하 여 효과적인 "빌딩 블록" 비 계 없는 심장 조직 창조의 그들은 저 산소 증에 대 한 저항으로 이식11,12에 대 한 충분 한 기계적 무결성을가지고 표시 되었습니다. 이전 학문은 회전 타원 체 생성에 대 한 여러 가지 제작 방법을 설명 했다, 교수형의 사용을 포함 하 여 방법, 스피너 플라스 크13, 미세 시스템14및 비 점착 문화 표면 코팅 또는 코팅 agarose 마이크로 금형15. 이 프로토콜을 사용 하 여 교수형 드롭 장치, spheroids의 수백을 한 번에 집 광을 위한 micropores를 포함.
이 연구는 소설 평방 금형 캐비티에는 spheroids를 수동으로 시드 및 성숙에 대 한 통에 조직 배양 포함 심장 조직 창조에 대 한 효율적인 비 계 없는 방법을 선물 한다. 일반적인 정적 문화 조건 하에서 산소 보급 조직 구조, 중앙 괴 사 발생의 외부 측면에 제한 됩니다. 그러나, 그물 형 금형에 시드 모든 spheroids 영양분과 산소의 증가 보급에 대 한 수 있도록 지속적인 유체 운동, 미디어에 몰두. 또한,이 형 기반 방법 수동 최소의 노력으로 다른 크기의 조직 패치의 동시 생성 가능 하며 결과 조직 형에서 쉽게 제거 될 수 있습니다. 이 새로운 메서드는 비 계, 다층 심장 패치의 효율적이 고 재현 가능한 창조에 대 한 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인간 심장 섬유아세포 (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2는 기초 매체로 구성되어</td><td>있습니다. Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF 배양 매체</td></tr><tr><td>인간 배빌리칼 정맥 내피 세포 (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC 배양 배지</td></tr><tr><td>E8 미디어&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>HiPSC 배양 배지</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>트립신 및 세포 해리 시약</td></tr><tr><td>RPMI 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>RPMI 배지 B-27 보충제는 hiPSC-CM 배양 배지</td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>RPMI 배지와 B-27 보충제는 hiPSC-CM 배양 배지</td></tr><tr><td>Trypan Blue 솔루션, 0.4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Novel net mold&nbsp;</td><td>TissueByNet Co.,Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>행잉 드롭 플레이트</td><td>Kuraray Co.,Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

이 프로토콜 고 추가 비 계 자료 없이 3 차원 (3 차원) 심장 조직을 만들 쉬운 그물 형 기반 방법에 설명 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes (iPSC-CMs), 인간의 심장 섬유 아 세포 (HCFs), 그리고 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 격리 하 고 70 %iPSC-CMs, 15 %HCFs, 및 15 %HUVECs 세포 현 탁 액을 생성 하는 데 사용. 그들은 spheroids의 수백을 한 번에 집 광을 위한 micropores를 포함 하는 매우 낮은 첨부 파일 "걸기 하락" 시스템에서 공동 경작. 셀 집계 하 고 자발적으로 공동 문화의 3 일 후 구타 spheroids를 형성 한다. spheroids 수확, 새로운 금형 캐비티에 시드 고 인큐베이터에 통에 경작. spheroids가 성숙한 기능 조직 시드 후 약 7 일. 만족 스러운 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 융합된 spheroids 결과 다층된 조직에 의하여 이루어져 있다. 이 새로운 메서드는 나중에 심장 마비의 치료에 대 한 설계 조직 만들기를 재현 하 고 비용 효율적인 방법으로 유망 가능성이 있다.

우리의 실험에 우리는 70 %iPSC-CMs, 15% HCFs RPMI/B-27 셀 미디어 mL 당 2,475,000 세포의 농도에 15 %HUVECs 세포 현 탁 액을 활용. 세포 현 탁 액을 만든 후 우리는 프로토콜의 4.3 단계에서 설명한 대로 드롭 시스템에 매달려 매우 낮은 첨부 파일의 각 음에 세포 현 탁 액 4 mL 적절. 교수형의 사용 문화 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도에서 3 일 후에 spheroids를 치고 수백의 자발적인 형성 귀착되 었 다 드롭 시스템. Spheroids는 쉽게 4 배와 10 배 확대 한 평균 직경 350 µ m의 문화 (그림 1)의 72 h 후에 가벼운 현미경 아래 박동을 관찰 했다.
Spheroids, 수확 후 프로토콜의 6.5 단계의...

이 프로토콜 만족 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 3 차원 비 계 없는 심장 조직을 만들 순 형 기반 방법을 설명 합니다.

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

이 프로토콜은 스페로이드를 골격이 없는 심장 조직 생성을 위한 도구로 사용하는 3차원 심장 조직 생성을 위한 새롭고 쉬운 곰팡이 기반 방법을 설명합니다. 본 실험에서는 인간 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포, 인간 심장 섬유아세포, 인간 제대 정맥 내피 세포의 세 가지 유형의 세포를 분리하여 세포 현탁액을 생성하는 데 사용했습니다. 70% 심근세포, 15% 섬유아세포, 15% 내피 세포가 50ML 원추형 튜브에 있습니다.그런 다음 세포 현탁액을 초저 부착 행잉 드롭 시스템의 각 웰에 분배하면 3일 후에 수백 개의 박동 스페로이드가 자발적으로 형성됩니다. 그런 다음 스페로이드를 수확하여 새로운 금형 캐비티에 장착합니다. 그런 다음 조직은 배지가 있는 멸균 용기에 넣어 인큐베이터의 셰이커에서 며칠 동안 보관합니다.그 후 곰팡이가 제거되어 기계적 무결성을 가진 비계 없는 조직 패치가 생성됩니다. 행잉 드롭 장치는 각각 직경이 350미크론인 850개의 마이크로 기공이 있는 재사용 가능한 초저 부착 웰입니다. 행잉 드롭은 표준 6웰 플레이트와 호환됩니다.세포 현탁액을 만든 후 1,000만 개의 세포를 포함하는 4ml의 세포 현탁액을 행잉 드롭 시스템의 각 웰에 분배합니다. 장치는 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 습도 95%에서 배양됩니다. 72시간 후 평균 직경이 350미크론인 박동 스페로이드의 자발적인 형성이 관찰됩니다.스페로이드는 매달린 드롭 장치를 매체가 있는 다른 접시에 놓고 부드럽게 소용돌이쳐 스페로이드를 방출하고 행잉 드롭 시스템 하단의 기공을 통해 표류할 수 있도록 하여 수확합니다. 이것은 3차원, 골격이 없는 심장 조직 생성을 위한 새로운 금형의 개략도입니다. 여기에는 취급 매트, 충전 베이스 및 새로운 금형이 포함됩니다.새로운 금형은 바닥, 바닥 사각형 플레이트, 바닥 그물, 미세한 스테인리스 스틸 갈래로 만든 10 층의 측면 그물로 구성됩니다. 상단 그물, 상단 사각형 플레이트, 홀딩 튜브 및 스토퍼 핀. Novel Mold 시스템은 2 x 2mm, 4 x 4mm, 6 x 6mm를 포함하여 다양한 크기의 조직을 만들 수 있습니다.기본 바닥 사각형 플레이트와 바닥 그물은 모서리 기둥을 사용하여 쌓이고 정렬됩니다. 그런 다음 10 층의 측면 그물을 교대로 쌓아 한 쌍의 멸균 집게의 도움으로 미세한 스테인리스 스틸 갈래의 그물을 만듭니다. 그런 다음 충진 베이스를 1X 인산염 완충 용액(PBS)으로 세척하여 스페로이드를 새로운 주형에 장착하기 전에 표면 장력을 줄입니다.새로운 곰팡이 캐비티를 동일한 메탄에 적신 후 스페로이드는 원하는 크기의 가정된 캐비티에 안착됩니다. 안착 시 여분의 매체는 그물 주형을 통해 배출되어 스페로이드가 채워지고 사전 정의된 캐비티의 모양을 취할 수 있습니다. 그런 다음 상단 그물과 상단 정사각형 플레이트를 모서리 기둥에 조립하고 스토퍼 핀과 홀딩 튜브를 고정하여 스페로이드의 세척을 방지합니다.충진된 새로운 금형 시스템은 6mm의 B-27 보충 배지가 있는 6웰 플레이트로 이송된 다음 30-40RPM으로 7-10일 동안 스윙 셰이커의 인큐베이터에서 유지됩니다. 배양 기간은 심장 패치의 크기에 따라 변경될 수 있습니다. 배양 후 시스템을 꺼내고 홀딩 튜브, 스토퍼, 상단 사각 플레이트 및 상단 그물을 제거합니다.그런 다음 겹겹이 쌓인 옆그물을 조직이 파괴되지 않도록 주의하면서 하나씩 조심스럽게 밀어냅니다. 모든 옆그물을 제거한 후 아래쪽 그물 위에 손상되지 않은 심장 패치를 얻습니다. 기능적 동기 박동은 24시간 이내에 관찰됩니다.이 새로운 곰팡이 기반 방법은 최소한의 수작업으로 3차원 골격이 없는 심장 조직을 만드는 효율적이고 쉬운 방법입니다. 그 결과 생성된 다층 조직은 만족스러운 구조적 무결성과 동기 박동 거동을 가진 융합 스페로이드로 구성됩니다. 이 새로운 곰팡이 기반 방법은 엔지니어링 조직의 현재 바이오 제조 방법에 대한 비용 효율적이고 확장 가능한 대안을 제시합니다.

a-net-mold-based-method-scaffold-free-three-dimensional-cardiac

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜에서는 모세관 힘 리소그래피를 사용하여 두 개의 별개의 고분자 재료로 만든 생체 모방 심장 세포 배양 하층의 제작을 보여줍니다.  설명된 방법은 in vitro 및 in vivo 응용 프로그램을 위해 거시적 심장 조직의 구조와 기능을 엔지니어링할 수 있는 확장 가능하고 비용 효율적인 기술을 제공합니다.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

이 프로토콜은 생체 재료를 사용하지 않고 심장 ​​조직의 3D bioprinting을 설명합니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.

생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

엔지니어링 된 조직은 중요한 영양소와 가스를 제공하고 신진 대사 폐기물을 제거하기 위해 적절한 혈관 네트워크에 크게 의존합니다. 이 작업에서는 내피 세포 및 지지 세포의 단계별 파종 프로토콜이 제어된 3D 환경에서 혈관 거동을 연구하기 위한 고도로 조직된 혈관 네트워크를 생성합니다.

스테셀레이트 비계에 단계별 세포 파종하여 발아 혈관을 연구합니다.

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

환자 별 모델은 수술 계획을 개발하거나 학습 할 때 외과 의사와 동료의 자신감을 향상시킵니다. 3차원(3D) 프린터는 수술 준비를 위한 적절한 세부 정보를 생성하지만 조직 햅틱 충실도를 복제하지 못합니다. 3D 프린팅 정밀도와 시뮬레이션 된 실리콘 조직을 결합한 환자 별 실리콘 심장 모델의 생성을 자세히 설명하는 프로토콜이 제공됩니다.

수술 전 계획 및 실습 교육에서 응용 프로그램을 갖춘 환자 별 실리콘 심장 모델 생성

용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.

폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

학습하세요 비계 무료 3차원 심장 조직 제작을 위한 혁신적인 금형 기반 방법을. 다양한 세포 유형을 활용한 구형체를 사용하여 구조적 무결성과 동기적 수축 특성을 갖춘 기능적 심장 조직을 효율적으로 생성하는 이 기술은 재생의학 연구에 활용됩니다.

비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

더 많은 동영상 탐색