2018년 8월 5일
이 프로토콜 만족 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 3 차원 비 계 없는 심장 조직을 만들 순 형 기반 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜은 스페로이드를 골격이 없는 심장 조직 생성을 위한 도구로 사용하는 3차원 심장 조직 생성을 위한 새롭고 쉬운 곰팡이 기반 방법을 설명합니다. 본 실험에서는 인간 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포, 인간 심장 섬유아세포, 인간 제대 정맥 내피 세포의 세 가지 유형의 세포를 분리하여 세포 현탁액을 생성하는 데 사용했습니다. 70% 심근세포, 15% 섬유아세포, 15% 내피 세포가 50ML 원추형 튜브에 있습니다.
그런 다음 세포 현탁액을 초저 부착 행잉 드롭 시스템의 각 웰에 분배하면 3일 후에 수백 개의 박동 스페로이드가 자발적으로 형성됩니다. 그런 다음 스페로이드를 수확하여 새로운 금형 캐비티에 장착합니다. 그런 다음 조직은 배지가 있는 멸균 용기에 넣어 인큐베이터의 셰이커에서 며칠 동안 보관합니다.
그 후 곰팡이가 제거되어 기계적 무결성을 가진 비계 없는 조직 패치가 생성됩니다. 행잉 드롭 장치는 각각 직경이 350미크론인 850개의 마이크로 기공이 있는 재사용 가능한 초저 부착 웰입니다. 행잉 드롭은 표준 6웰 플레이트와 호환됩니다.
세포 현탁액을 만든 후 1,000만 개의 세포를 포함하는 4ml의 세포 현탁액을 행잉 드롭 시스템의 각 웰에 분배합니다. 장치는 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 습도 95%에서 배양됩니다. 72시간 후 평균 직경이 350미크론인 박동 스페로이드의 자발적인 형성이 관찰됩니다.
스페로이드는 매달린 드롭 장치를 매체가 있는 다른 접시에 놓고 부드럽게 소용돌이쳐 스페로이드를 방출하고 행잉 드롭 시스템 하단의 기공을 통해 표류할 수 있도록 하여 수확합니다. 이것은 3차원, 골격이 없는 심장 조직 생성을 위한 새로운 금형의 개략도입니다. 여기에는 취급 매트, 충전 베이스 및 새로운 금형이 포함됩니다.
새로운 금형은 바닥, 바닥 사각형 플레이트, 바닥 그물, 미세한 스테인리스 스틸 갈래로 만든 10 층의 측면 그물로 구성됩니다. 상단 그물, 상단 사각형 플레이트, 홀딩 튜브 및 스토퍼 핀. Novel Mold 시스템은 2 x 2mm, 4 x 4mm, 6 x 6mm를 포함하여 다양한 크기의 조직을 만들 수 있습니다.
기본 바닥 사각형 플레이트와 바닥 그물은 모서리 기둥을 사용하여 쌓이고 정렬됩니다. 그런 다음 10 층의 측면 그물을 교대로 쌓아 한 쌍의 멸균 집게의 도움으로 미세한 스테인리스 스틸 갈래의 그물을 만듭니다. 그런 다음 충진 베이스를 1X 인산염 완충 용액(PBS)으로 세척하여 스페로이드를 새로운 주형에 장착하기 전에 표면 장력을 줄입니다.
새로운 곰팡이 캐비티를 동일한 메탄에 적신 후 스페로이드는 원하는 크기의 가정된 캐비티에 안착됩니다. 안착 시 여분의 매체는 그물 주형을 통해 배출되어 스페로이드가 채워지고 사전 정의된 캐비티의 모양을 취할 수 있습니다. 그런 다음 상단 그물과 상단 정사각형 플레이트를 모서리 기둥에 조립하고 스토퍼 핀과 홀딩 튜브를 고정하여 스페로이드의 세척을 방지합니다.
충진된 새로운 금형 시스템은 6mm의 B-27 보충 배지가 있는 6웰 플레이트로 이송된 다음 30-40RPM으로 7-10일 동안 스윙 셰이커의 인큐베이터에서 유지됩니다. 배양 기간은 심장 패치의 크기에 따라 변경될 수 있습니다. 배양 후 시스템을 꺼내고 홀딩 튜브, 스토퍼, 상단 사각 플레이트 및 상단 그물을 제거합니다.
그런 다음 겹겹이 쌓인 옆그물을 조직이 파괴되지 않도록 주의하면서 하나씩 조심스럽게 밀어냅니다. 모든 옆그물을 제거한 후 아래쪽 그물 위에 손상되지 않은 심장 패치를 얻습니다. 기능적 동기 박동은 24시간 이내에 관찰됩니다.
이 새로운 곰팡이 기반 방법은 최소한의 수작업으로 3차원 골격이 없는 심장 조직을 만드는 효율적이고 쉬운 방법입니다. 그 결과 생성된 다층 조직은 만족스러운 구조적 무결성과 동기 박동 거동을 가진 융합 스페로이드로 구성됩니다. 이 새로운 곰팡이 기반 방법은 엔지니어링 조직의 현재 바이오 제조 방법에 대한 비용 효율적이고 확장 가능한 대안을 제시합니다.
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이 프로토콜은 3차원 스캐폴드-프리 심장 조직을 생성하기 위한 새로운 금형 기반 방법을 설명합니다. 이 방법은 만족스러운 구조적 무결성과 동기화된 박동 행동을 달성하기 위해 구형체를 활용합니다.
This scaffold-free cardiac tissue method addresses the need for reproducible, physiologically relevant models in early cardiovascular drug discovery. By generating mature, beating human cardiac tissues from iPSC-derived cells, it enables mechanistic de-risking of cardiotoxicity and efficacy targets. The approach supports predictive confidence in lead identification and preclinical triage through scalable, low-cost tissue fabrication.
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical model development, providing a bridge between spheroid-based screening and functional tissue evaluation.